基于主成分分析和聚類分析的橄欖油中微量元素的統(tǒng)計(jì)比較

楊雯懿，陳林，周學(xué)忠

1(中南大學(xué) 計(jì)算機(jī)學(xué)院，湖南 長沙，410083)2(湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，湖南 長沙，410013) 3(湖南工學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 衡陽，421008)

橄欖油是以油橄欖油為原料經(jīng)物理壓榨得到的優(yōu)質(zhì)植物油，富含不飽和脂肪酸、多酚、角鯊烯以及維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[1]，具有預(yù)防糖尿病、心腦血管疾病、抗衰老、防癌等功能[2]，是地中海飲食的重要組成部分，在西方國家享有“液體黃金”之美譽(yù)[3]。雖然橄欖油的品質(zhì)和等級主要依據(jù)其有機(jī)指標(biāo)來確定[4]，但其所含無機(jī)組分對于橄欖油的食用安全和保質(zhì)期起重要的作用[5]，同時，橄欖油中無機(jī)元素的含量不僅受油橄欖對礦物元素的吸收和預(yù)富集特性所控制，而且與油橄欖的產(chǎn)地和生長環(huán)境密切相關(guān)[6]。因此，通過研究橄欖油中無機(jī)元素的種類和含量，并結(jié)合數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析表征橄欖油的地域信息，對橄欖油的產(chǎn)地溯源保護(hù)和地理標(biāo)志保護(hù)具有重要意義。

目前，植物油樣品的前處理技術(shù)主要有干法灰化、濕法消解、微波消解和有機(jī)溶劑稀釋等方法[7-8]。干法灰化法和濕法消解法在加熱處理過程會導(dǎo)致部分元素?fù)]發(fā)，不能用于揮發(fā)性元素的測定；微波消解法樣品消解徹底，但由于消解油脂的特殊性，長時間預(yù)消解操作費(fèi)時，不適合高通量分析[9]；有機(jī)溶劑稀釋法避免了復(fù)雜煩瑣的消解過程和分析元素的損失，但必須面對有機(jī)基質(zhì)在分析過程中形成的嚴(yán)重干擾。在應(yīng)用于植物油中微量元素的原子光譜測定技術(shù)中，電感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜(inductively coupled plasma tandem mass spectrometry，ICP-MS/MS)利用特有的串聯(lián)質(zhì)譜和碰撞反應(yīng)池(collision reaction cell，CRC)系統(tǒng)，幾乎可以消除所有干擾，適合微量以及痕量元素的測定[10-12]。因此，采用有機(jī)溶劑稀釋結(jié)合ICP-MS/MS能準(zhǔn)確測定植物油中的微量元素。

主成分分析是通過對錯綜復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，篩選能重現(xiàn)的數(shù)據(jù)信息，將原變量轉(zhuǎn)換為少數(shù)新變量(主成分)的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，主成分分析能集中典型地表征原變量的數(shù)據(jù)特征，從而充分反映總體信息[13]。聚類分析是依據(jù)觀察對象某些特征加以歸類的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法[14]。主成分分析和聚類分析已廣泛應(yīng)用于食品分類和產(chǎn)地溯源的研究[15-18]。本文采用煤油稀釋橄欖油后直接進(jìn)樣，利用ICP-MS/MS測定其中16種微量元素的含量，并根據(jù)不同產(chǎn)地橄欖油中微量元素的含量進(jìn)行主成分分析和聚類分析，以期為橄欖油的產(chǎn)地溯源保護(hù)和地理標(biāo)志保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

18種特級初榨橄欖油樣品(產(chǎn)地分別為意大利4種、希臘4種、西班牙4種、中國6種)購置于京東超市。

1 000 μg/g的Na、K、Ti、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Cd、Hg、Pb單元素油標(biāo)，美國Spex CertiPrep公司；1 000 μg/g的Sc、Y、Bi單元素內(nèi)標(biāo)，美國Spex CertiPrep公司；高純煤油，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；99.99%的高純O2、NH3、He，湖南省華中特種氣體有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器及設(shè)備

Agilent 8800型電感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；配置有自吸式C-flow 200 PFA霧化器，Peltier冷卻雙通道Scott型霧化室，窄口徑(內(nèi)徑為1.5 mm)進(jìn)樣炬管，S透鏡，Pt錐。Element XR型扇形磁場電感耦合等離子質(zhì)譜(sector field inductuvely coupled plasma mass spectormetry，SF-ICP-MS)儀，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 橄欖油前處理

采用質(zhì)量稀釋法用煤油將橄欖油樣品進(jìn)行5倍稀釋后待測，同時采用煤油為空白試劑。

1.3.2 ICP-MS/MS工作參數(shù)

ICP-MS/MS調(diào)諧優(yōu)化后的操作條件：射頻功率1 550 W；載氣流速1.08 L/min；輔助氣流速1.08 L/min；補(bǔ)償氣流速0.15 L/min；采樣深度8.0 mm；O2流速0.08 L/min；操作模式MS/MS；反應(yīng)氣O2、NH3/He(He中混入10%的NH3)；反應(yīng)氣流速，O20.30 mL/min、NH3/He 3.0 mL/min；八極桿偏置電壓-18 V；動能歧視電壓-8 V；同位素23Na、39K、48Ti、52Cr、55Mn、56Fe、59Co、60Ni、63Cu、66Zn、75As、78Se、88Sr、111Cd、202Hg、208Pb。

1.3.3 橄欖油微量元素的測定

采用煤油將1 000 μg/g的分析元素油標(biāo)和內(nèi)標(biāo)進(jìn)行稀釋，配制0.00、2.00、10.、50.0、200 μg/kg系列分析元素混合油標(biāo)，使用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)混合“T”型接頭在線加入1 μg/g的Sc、Y、Bi混合內(nèi)標(biāo)，在優(yōu)化的ICP-MS/MS操作條件下進(jìn)行測定，獲得各元素的校準(zhǔn)曲線，同時對空白和樣品進(jìn)行測定，利用MassHunter工作站軟件計(jì)算樣品中分析元素的含量。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用18種橄欖油樣品中16種微量元素的含量組成18×16的原始數(shù)據(jù)矩陣，應(yīng)用SPSS 25軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以消除橄欖油中微量元素原始數(shù)據(jù)之間的量綱和數(shù)量級不同對分析結(jié)果的影響，使標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)具有可比性并遵循正態(tài)分布規(guī)律，從而進(jìn)行主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ICP-MS/MS的分析性能評價

2.1.1 線性關(guān)系與檢出限

按實(shí)驗(yàn)條件采用ICP-MS/MS測定系列分析元素混合油標(biāo)，以分析元素與內(nèi)標(biāo)元素的信號強(qiáng)度比值所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度自動進(jìn)行線性回歸，建立校準(zhǔn)曲線，各元素的線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表1。采用所建立的方法對空白(煤油)連續(xù)測定10次，計(jì)算各元素標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差所對應(yīng)的濃度為儀器的檢出限(limit of detection，LOD)[19]。由表1可以看出，所有分析元素在具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)≥0.999 7。各元素儀器的LOD為0.001～1.22 μg/kg。

表1 分析元素的線性關(guān)系與檢出限Table 1 Linear relationship and the limit of detection for analytes

2.1.2 方法準(zhǔn)確性與精密度

由于缺少橄欖油標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)選取實(shí)際樣品中加入油標(biāo)，采用所建立的分析方法對加標(biāo)樣品平行測定6次，計(jì)算各元素的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)，同時采用SF-ICP-MS對加標(biāo)樣品進(jìn)行分析，對2種分析方法的測定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用來評價ICP-MS/MS的準(zhǔn)確性和精密度，結(jié)果見表2。由表2可以看出，各元素的加標(biāo)回收率為95.2%～108%，RSD≤5.3%；16種分析元素的加標(biāo)測定值與采用SF-ICP-MS的加標(biāo)測定值基本一致，驗(yàn)證了所建立的方法準(zhǔn)確性和精密度好。

表2 加標(biāo)樣品的分析結(jié)果(n=6)Table 2 Results obtained for analytes in spiked sample (n=6)

2.2 橄欖油樣品分析

采用ICP-MS/MS法測定了來自國內(nèi)外不同產(chǎn)地的18種橄欖油樣品，其中來自意大利4種(樣品編號IT1-4)、希臘4種(樣品編號GR1-4)、西班牙4種(樣品編號ES1-4)、中國6種(樣品編號CN1-6)，測定各橄欖油中的16種微量元素，每個樣品重復(fù)測定6次，結(jié)果見表3。18種橄欖油中Na、K、Fe、Cr的含量相對較高，而Co、Cd、Hg、Pb的含量相對較低。對照我國橄欖油國家標(biāo)準(zhǔn)GB 23347—2009以及食品中污染物限量國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2762—2017[20]，所有橄欖油中的Fe、Cu的含量均低于GB 23347—2009中特級初榨橄欖油的限量值，重金屬元素的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于GB 2762—2017中的限量標(biāo)準(zhǔn)。

表3 不同產(chǎn)地橄欖油中微量元素的含量(已進(jìn)行了稀釋校正) 單位：μg/kg

2.3 主成分分析

2.3.1 橄欖油中微量元素的適用性檢驗(yàn)

采用SPSS 25的Bartlett's球狀檢驗(yàn)對18種橄欖油中的16種微量元素進(jìn)行適用性檢驗(yàn)，考察原始數(shù)據(jù)矩陣中各變量的相關(guān)性，當(dāng)顯著性值(Sig或P)<0.05時，原始數(shù)據(jù)矩陣中各變量具有相關(guān)性，適合主成分分析，反之不適合主成分分析[21]。本實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)結(jié)果表明，原假設(shè)原始數(shù)據(jù)矩陣是單位矩陣時的顯著性值為0.000，拒絕原始數(shù)據(jù)矩陣中各變量全獨(dú)立的原假設(shè)，表明18種橄欖油中的16種微量元素之間具有強(qiáng)線性相關(guān)性，能應(yīng)用主成分分析進(jìn)行研究。

2.3.2 主成分的貢獻(xiàn)率與選擇

采用主成分分析法提取公因子，其特征值和總體方差描述見表4。由表4可以看出，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率的80.961%來源于前5個主成分，即1個5因子模型可解釋80.961%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，包含了18種橄欖油中16種微量元素的大部分信息，并且這5個主成分的特征值均>1，符合累積方差貢獻(xiàn)值大于80%且特征值>1的主成分個數(shù)選擇原則[22]。因此，本實(shí)驗(yàn)提取前5個主成分來評判16種微量元素在18種橄欖油中的分布。

表4 主成分分析特征值和總體方差描述Table 4 Principal component analysis characteristics and total variance explained

2.3.3 微量元素的因子分析

根據(jù)橄欖油中微量元素的因子分析結(jié)果(見表5)，分別建立5個主成分因子(F1、F2、F3、F4、F5)得分模型：

表5 橄欖油中微量元素的因子分析Table 5 Factor analysis of trace elements in olive oil

F1=0.945X1+0.595X2+0.853X3-0.521X4-0.687X5+0.623X6-0.445X7+0.761X8+0.942X9+0.926X10-0.667X11+0.713X12+0.909X13-0.431X14+0.379X15+0.196X16

F2=-0.039X1+0.037X2+0.028X3+0.386X4-0.398X5+0.239X6-0.520X7-0.190X8-0.099X9-0.114X10+0.367X11+0.140X12-0.069X13+0.140X14-0.033X15+0.832X16

F3=0.153X1-0.524X2+0.261X3+0.155X4-0.164X5+0.382X6+0.326X7+0.245X8+0.079X9+0.171X10+0.308X11-0.434X12+0.101X13-0.102X14-0.580X15-0.007X16

F4=0.091X1-0.263X2+0.198X3+0.470X4-0.068X5+0.047X6+0.290X7+0.048X8+0.036X9+0.081X10-0.021X11+0.235X12+0.045X13+0.697X14+0.439X15-0.173X16

F5=0.116X1+0.069X2+0.079X3+0296X4+0.290X5+0.429X6-0.126X7-0.407X8-0.001X9+0.124X10+0.132X11-0.252X12+0.007X13-0.365X14+0.404X15-0.216X16

可以看出，F(xiàn)1在X1、X3、X9、X10、X13有較大的因子載荷值，分別為0.945、0.853、0.942、0.926、0.909，與對應(yīng)的Na、Ti、Cu、Zn、Sr高度正相關(guān)，F(xiàn)2在X16有較大因子荷載值(0.832)，與對應(yīng)Pb高度正相關(guān)，由于F1和F2的累積方差貢獻(xiàn)率(58.392%)大于50%，可確定Na、Ti、Cu、Zn、Sr、Pb是橄欖油的特征元素。

2.4 聚類分析

通過ICP-MS/MS測定得到橄欖油中微量元素含量的原始數(shù)據(jù)較為離散，不能直觀地比較各元素的相近程度。本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 25的系統(tǒng)聚類分析對不同產(chǎn)地橄欖油樣品進(jìn)行聚類分析。以16種微量元素含量為變量，對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)處理后，以歐氏距離平方(系統(tǒng)默認(rèn))為準(zhǔn)則采用組間連接聚類，結(jié)果如圖1所示?？梢钥闯?，隨著聚類距離的增大，聚類結(jié)果也逐漸發(fā)生變化。當(dāng)聚類距離為10時，18種橄欖油聚為兩大類，國內(nèi)樣品聚為一類，國外樣品聚為一類；當(dāng)聚類距離為8時，18種橄欖油聚為四大類，國內(nèi)樣品聚為一類，國外樣品意大利產(chǎn)橄欖油歸為一類，希臘產(chǎn)橄欖油歸為1類，西班牙產(chǎn)橄欖油歸為一類。表明以橄欖油中16種微量元素為變量可以對不同產(chǎn)地的橄欖油進(jìn)行溯源，有利于橄欖油的產(chǎn)地溯源保護(hù)和地理標(biāo)志保護(hù)。

圖1 橄欖中微量元素含量系統(tǒng)聚類Fig.1 Phylogenetic clustering of olive oil based on trace elements

3 結(jié)論

利用ICP-MS/MS測定了不同產(chǎn)地橄欖油中16種微量元素Na、K、Ti、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Cd、Hg、Pb的含量，采用SPSS 25對18種橄欖油中16種微量元素組成的原始數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行了主成分分析和聚類分析。橄欖油中的Na、K、Fe、Cr含量相對較高，Co、Cd、Hg、Pb含量相對較低，其余微量元素?zé)o明顯規(guī)律性。不同產(chǎn)地橄欖油中微量元素的含量具有地域特征，通過聚類分析可以較好地區(qū)分橄欖油的產(chǎn)地來源，研究結(jié)果為橄欖油的產(chǎn)地判別提供了準(zhǔn)確可靠的標(biāo)記驗(yàn)證方法。