重組大腸桿菌產(chǎn)乙酰乳酸合成酶發(fā)酵條件優(yōu)化

趙婷，黃禮清，金紫陽(yáng)，袁思棋*，劉君,2,3*

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓，644000)2(宜賓五糧液集團(tuán)有限公司，四川 宜賓，644000) 3(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都，610000)

雙乙酰(diacetyl)，又稱2,3-丁二酮，是一種具有特殊氣味的黃綠色油狀液體，廣泛存在于郁金香、草莓和薰衣草等天然植物內(nèi)，以及奶油、奶酪、酸奶等乳制品中[1]。2分子丙酮酸在乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase, ALS, EC 4.1.3.18)作用下產(chǎn)生1分子α-乙酰乳酸(α-acetolactate, α-AL)，再經(jīng)過(guò)非酶催化脫羧生成雙乙酰[2-4]。雙乙酰在工業(yè)應(yīng)用廣泛，例如，在奶油風(fēng)味食品的生產(chǎn)過(guò)程中，主要通過(guò)添加化學(xué)工業(yè)生產(chǎn)的雙乙酰作為食品添加劑，從而改善食品的風(fēng)味。但是，化學(xué)工業(yè)生產(chǎn)雙乙酰的過(guò)程一般需要涉及亞硝酸酯等有毒物質(zhì)；另一方面，雙乙酰具有很強(qiáng)的揮發(fā)性，一次性添加不能使食品的風(fēng)味持續(xù)很久[5]。

在發(fā)酵過(guò)程中，能夠表達(dá)α-乙酰乳酸合成酶的菌株(如乳酸乳球菌)的酶產(chǎn)量有限，不能滿足當(dāng)前食品市場(chǎng)非常巨大的需求[6-7]。因此，為了提高乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中雙乙酰的產(chǎn)量以及延長(zhǎng)雙乙酰風(fēng)味的作用時(shí)間，更健康、安全的方法是添加乙酰乳酸合成酶酶制劑[5]。常用的工程菌自身組成性表達(dá)的乙酰乳酸脫羧酶會(huì)不可逆地催化α-乙酰乳酸生成乙偶姻，很大程度上降低了雙乙酰的產(chǎn)率。研究報(bào)道，通過(guò)基因工程過(guò)表達(dá)α-AL編碼基因或在天然產(chǎn)雙乙酰的菌株中過(guò)表達(dá)α-AL編碼基因，增加雙乙酰合成途徑的通量，可以有效提高雙乙酰的產(chǎn)率[1]。大腸桿菌不僅沒(méi)有乙酰乳酸脫羧酶基因，不具有催化乙偶姻生成的能力，而且具有培養(yǎng)周期短、代謝易控制、營(yíng)養(yǎng)要求粗放等許多優(yōu)勢(shì)，較適合作為雙乙酰生產(chǎn)的工程菌[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)室篩選得到1株高產(chǎn)乙酰乳酸合成酶的地衣芽孢桿菌T2，從T2中克隆獲取乙酰乳酸合成酶基因alsS，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGX-6p-1-alsS，并轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)進(jìn)行異源表達(dá)，并對(duì)重組alsS的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得重組目的基因的最佳表達(dá)條件，提高具有活性的乙酰乳酸合成酶產(chǎn)量。從而為后續(xù)酶降低酶制劑生產(chǎn)成本奠定基礎(chǔ)，增強(qiáng)雙乙酰的合成代謝流，使得利用微生物更安全、更環(huán)保地進(jìn)行雙乙酰生物合成生產(chǎn)[7,10-11]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

E.coliBL21(DE3)/pEGX-6p-1-alsS，作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10；發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖5，酵母浸粉5，蛋白胨5，NaCl 5。使用250 mL搖瓶，裝液量為50 mL。將上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽替換成不同的成分以進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化。

1.1.3 試劑

發(fā)酵培養(yǎng)基各成分，上海源葉生物技術(shù)有限公司；異丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、氨芐青霉素，購(gòu)自生工生物工程股份(上海)有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

UV-1800分光光度計(jì)，翱藝儀器(上海)有限公司；SCIENTZ-ⅡD超聲波破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

將甘油管保藏菌種接入LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)；按體積分?jǐn)?shù)5%接入發(fā)酵(基礎(chǔ))培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)，加入0.2 mmol/L IPTG，于25 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。

1.2.2 重組大腸桿菌產(chǎn)乙酰乳酸合成酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

參照1.2.1的方法培養(yǎng)重組大腸桿菌，LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)種子液，以體積分?jǐn)?shù)2%接種量接入發(fā)酵(基礎(chǔ))培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)，加入1 mmol/L IPTG，于30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，4 ℃、8 000 r/min 離心5 min，以工程菌作為對(duì)照。

1.2.3 菌體吸光度分析

將所得菌懸液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，UV-1800分光光度計(jì)測(cè)定其吸光值，如公式(1)所示：

OD600=讀數(shù)×稀釋倍數(shù)

(1)

1.2.4 菌體生物量的測(cè)定

為考察單位菌體產(chǎn)酶量參數(shù)，建立了OD600與菌體質(zhì)量濃度(g/L)的線性關(guān)系。取相同體積不同濃度的菌體，測(cè)定其OD600后，8 000 r/min離心10 min，棄上清，用去離子水懸浮菌體，再離心，棄上清，將菌體放置于70 ℃烘干至恒重。

1.2.5 菌體破碎

誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體，用7.5 mL K3PO4緩沖液(100 mmol/L，pH 6.0)懸浮菌體，使用超聲波破碎儀處理10 min后置于 4 ℃、8 000 r/min、離心20 min，取上清液進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.2.6 重組蛋白質(zhì)酶活力的測(cè)定

酶活測(cè)定：乙酰乳酸在一定溫度條件下會(huì)脫羧形成乙偶姻，而乙偶姻在堿性條件下可以與肌酸和α-萘酚的混合物反應(yīng)生成紅色物質(zhì)，在525 nm有吸光度[12]。反應(yīng)體系為l mL 100 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)，其中含40 mmol/L的丙酮酸鈉，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L TPP，10 μmol/L FAD，37 ℃加入20 μL 酶液，10 min后加50 μL 3 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，37 ℃脫羧25 min，2 000 r/min離心1 min，上清稀釋20倍后取200 μL加入1 mL 1.7 g/L肌酸和1 mL 17 g/L的α-萘酚，37 ℃顯色 30 min，于525 nm處測(cè)定吸光度[13]。乙偶姻的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.060 2x+0.095 5(R2=0.995 1)，其中x為乙偶姻濃度(μmol/L)，y為OD525值。酶活單位(IU)定義為在37 ℃條件下，1 min內(nèi)催化生成 1 μmol/L乙偶姻所需的酶量。

1.2.7 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.7.1 碳源及質(zhì)量濃度對(duì)重組大腸桿菌產(chǎn)乙酰乳酸合成酶的影響

根據(jù)已有文獻(xiàn)[14]進(jìn)行優(yōu)化，分別以葡萄糖、甘油、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖(質(zhì)量濃度均是5 g/L)為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，以酵母浸粉5 g/L和蛋白胨10 g/L為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，測(cè)定酶活力，確定最佳碳源。在最佳碳源的基礎(chǔ)上，根據(jù)文獻(xiàn)[10]選擇添加量(質(zhì)量濃度)4、6、8、10、12 g/L，確定最佳濃度。

1.2.7.2 氮源及質(zhì)量濃度對(duì)重組大腸桿菌產(chǎn)乙酰乳酸合成酶的影響

在最佳碳源及濃度的基礎(chǔ)上，分析氮源添加條件對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響：(1)僅添加無(wú)機(jī)氮源(NH4)2SO4和NH4Cl(各3 g/L)；(2)僅添加有機(jī)氮源牛肉膏；(3)酵母膏；(4)蛋白胨及牛肉膏蛋白胨組合；(5)牛肉膏酵母膏組合;(6)酵母膏蛋白胨組合。根據(jù)以上結(jié)果，分別測(cè)定對(duì)應(yīng)條件下酶活力，確定最佳氮源。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)文獻(xiàn)資料[15]選擇添加量5、10、15、20、25 g/L，確定最佳質(zhì)量濃度。

1.2.7.3 無(wú)機(jī)鹽離子及質(zhì)量濃度對(duì)重組大腸桿菌產(chǎn)乙酰乳酸合成酶的影響

無(wú)機(jī)鹽對(duì)微生物有非常重要的生理功能，可作為酶的激活劑或輔基，并且在維持滲透壓、pH的穩(wěn)定以及組成細(xì)胞物質(zhì)等方面均有重要體現(xiàn)[16]。最佳碳源及氮源的種類和添加量確認(rèn)后，以產(chǎn)酶水平為考察指標(biāo)，使用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)無(wú)機(jī)鹽種類及濃度進(jìn)行優(yōu)化。選用4種常用的無(wú)機(jī)鹽(檸檬酸鈉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl)對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)乙酰乳酸合成酶的影響[15]。

1.2.8 重組大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

甘油管菌種接種于5 mL LB Amp+培養(yǎng)基37 ℃活化過(guò)夜, 將活化的菌種接種于LB Amp+培養(yǎng)基中，37 ℃、 200 r/min培養(yǎng)，分析以下不同發(fā)酵條件對(duì)工程菌生長(zhǎng)和目標(biāo)蛋白表達(dá)的影響[17-19]：(1)改變加入IPTG誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)時(shí)間；(2)加入不同濃度的IPTG誘導(dǎo)劑；(3)改變加入IPTG誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)溫度；(4)改變接種量；(5)改變培養(yǎng)基的pH；(4)改變培養(yǎng)搖床的轉(zhuǎn)速。

1.2.9 響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)產(chǎn)酶水平影響較大的3個(gè)因素，通過(guò) Box-Behnken 法設(shè)計(jì)出3因素(pH、溫度、IPTG濃度)、3水平正交實(shí)驗(yàn)。pH的3水平分別為6、7和8；溫度的3水平分別為25、 30、 37 ℃；IPTG濃度的3水平分別為0.2、 0.4、0.6 mmol/L(表1)。

表1 基于 Box-Behnken 設(shè)計(jì)的 3 因素 3水平正交實(shí)驗(yàn)表Table 1 Design and protocol of the three-variable/three-level Box-Behnken method

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體干重與OD600的線性關(guān)系

根據(jù)1.2.4實(shí)驗(yàn)方法處理，獲得菌體干重(g/L)與OD600回歸方程，y=0.376 7x-0.015 9(R2=0.999 3)，其中x為OD600，y為菌體干重(g/L)。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響

由表2可知，菌體質(zhì)量濃度在6種不同碳源培養(yǎng)基中，淀粉最高，依次是甘油、蔗糖、葡萄糖和麥芽糖，乳糖最低。當(dāng)葡萄糖作為碳源時(shí)，單位菌體產(chǎn)酶量及產(chǎn)酶水平均最高，其他碳源對(duì)應(yīng)的單位菌體產(chǎn)酶量及產(chǎn)酶水平均低于葡萄糖。

表2 不同碳源對(duì)重組大腸桿菌菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響Table 2 Effects of different carbon sources on the growth and enzyme production of recombinant E. coli

通過(guò)不同碳源影響因素的確定，隨著不同葡萄糖添加質(zhì)量濃度增加，單位菌體產(chǎn)酶量呈小幅度增加，而產(chǎn)酶水平呈明顯增加趨勢(shì)(圖1)，即當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為12 g/L時(shí)，單位菌體產(chǎn)酶量及產(chǎn)酶水平分別為112.990 kU/g和122.779 U/mL。

圖1 不同葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)乙酰乳酸合成酶活力的影響Fig.1 Effects of different glucose concentrations on acetolactate synthase activity

2.2.2 氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響

重組大腸桿菌可以有效利用有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源。由表3可知，重組大腸桿菌對(duì)單一有機(jī)氮源的利用效率高于無(wú)機(jī)氮源，而混合的有機(jī)氮源利用效率較低。根據(jù)表3數(shù)據(jù)顯示，(1)無(wú)機(jī)氮源NH4Cl的單位菌體產(chǎn)酶量和產(chǎn)酶水平明顯比(NH4)2SO4高；(2)單一有機(jī)氮源中，蛋白胨對(duì)應(yīng)的菌體質(zhì)量濃度、單位菌體產(chǎn)酶量和產(chǎn)酶水平均高于牛肉膏和酵母膏；(3)混合有機(jī)氮源中，除單位菌體產(chǎn)酶量外，牛肉膏+酵母膏組合的菌體質(zhì)量濃度和產(chǎn)酶水平均高于其他2種組合。綜合考慮有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)成本，最終確定本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基僅需添加蛋白胨作為唯一氮源。

表3 不同氮源對(duì)重組大腸桿菌菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響Table 3 Effects of different nitrogen sources on the growth and enzyme production of recombinant E. coli

在確認(rèn)最佳氮源后，探討不同質(zhì)量濃度的蛋白胨對(duì)單位菌體產(chǎn)酶量及產(chǎn)酶水平的影響情況。結(jié)果顯示，隨著蛋白胨濃度的不斷升高，大腸桿菌單位菌體產(chǎn)酶量及產(chǎn)酶水平先增加，后逐漸降低，即當(dāng)?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，單位菌體產(chǎn)酶量及產(chǎn)酶水平均為最高(圖2)。因此，確定蛋白胨10 g/L作為最佳蛋白胨添加量。

圖2 不同蛋白胨濃度對(duì)乙酰乳酸合成酶活力的影響Fig.2 Effects of different glucose concentrations on acetolactate synthase activity

2.2.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響

不同的無(wú)機(jī)鹽離子對(duì)微生物的生長(zhǎng)有不同的影響。由表4可知，檸檬酸鈉對(duì)產(chǎn)酶的影響最顯著(R值為50.3)，其他無(wú)機(jī)鹽依次為 NaCl(11.59)，KH2PO4(11.16)，MgSO4·7H2O(8.21)，其中MgSO4·7H2O對(duì)產(chǎn)酶的影響最小。檸檬酸是三羥酸循環(huán)的關(guān)鍵物質(zhì)，推測(cè)檸檬酸鈉的添加可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量，也可促進(jìn)細(xì)胞的產(chǎn)酶。細(xì)胞干重隨檸檬酸鈉質(zhì)量濃度的增大而增大，產(chǎn)酶水平及單位菌體產(chǎn)酶量也逐漸提高。根據(jù)不同無(wú)機(jī)鹽離子的正交實(shí)驗(yàn)，最優(yōu)組合為A3B2C1D3，即檸檬酸鈉0.25 g/L， KH2PO40.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.025 g/L，NaCl 0.1 g/L。

表4 無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)與結(jié)果Table 4 Orthogonal experiments and results of inorganic salt optimization

2.3 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.3.1 接種量、pH和培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

由圖3可知，隨著接種量、培養(yǎng)基pH值和搖床轉(zhuǎn)速的增加，重組大腸桿菌單位菌體產(chǎn)酶量和產(chǎn)酶水平均呈現(xiàn)先增加，后降低的趨勢(shì)，即在接種量0.04%、pH=7和搖床轉(zhuǎn)速180 r/min時(shí)，對(duì)應(yīng)的單位菌體產(chǎn)酶量和產(chǎn)酶水平達(dá)到最高。

a-接種量；b-pH；c-培養(yǎng)轉(zhuǎn)速圖3 接種量、pH和培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對(duì)單位菌體產(chǎn)酶量和產(chǎn)酶水平的影響Fig.3 Effects of inoculation , pH and culture rotation speed on the enzyme production per unit and production level of recombinant E. coli

2.3.2 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

根據(jù)實(shí)驗(yàn)用大腸桿菌的培養(yǎng)溫度情況，選擇18、25、30、37 ℃ 4個(gè)誘導(dǎo)溫度進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，隨著溫度的升高，單位菌體產(chǎn)酶量和產(chǎn)酶水平呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，即當(dāng)誘導(dǎo)溫度為30 ℃時(shí)，單位菌體產(chǎn)酶量與產(chǎn)酶水平均最高(圖4)。因此，最終選定30 ℃為最適誘導(dǎo)溫度。

圖4 誘導(dǎo)溫度對(duì)單位菌體產(chǎn)酶量和產(chǎn)酶水平的影響Fig.4 Effects of induced temperature on the enzyme production per unit and production level of recombinant E. coli

2.3.3 誘導(dǎo)劑 IPTG 濃度的優(yōu)化

在重組大腸桿菌菌株生長(zhǎng)過(guò)程中，添加誘導(dǎo)劑IPTG促進(jìn)菌體中基因表達(dá)。根據(jù)先前實(shí)驗(yàn)室重組菌株的實(shí)驗(yàn)，選擇IPTG濃度分別為 0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，由圖5可知,隨著誘導(dǎo)劑IPTG濃度的增加，單位菌體產(chǎn)酶量和產(chǎn)酶水平呈先增加后減少的趨勢(shì)；當(dāng)IPTG濃度為 0.4 mmol/L時(shí)，產(chǎn)酶水平最高，達(dá)到314.724 U/mL。因此，最終確定誘導(dǎo)劑IPTG的最佳濃度為0.4 mmol/L。

圖5 不同濃度的誘導(dǎo)劑IPTG對(duì)單位菌體產(chǎn)酶量和產(chǎn)酶水平的影響Fig.5 Effects of different IPTG concentration on the enzyme production per unit and production level of recombinant E. coli

2.3.4 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

本次實(shí)驗(yàn)的重組大腸桿菌菌株的最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間以9 h為誘導(dǎo)時(shí)間中間值，分別設(shè)置5個(gè)時(shí)間梯度，由圖6可知，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，單位菌體產(chǎn)酶量和產(chǎn)酶水平在誘導(dǎo)2～10 h均呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，10 h后均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此以10 h誘導(dǎo)時(shí)間作為最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間。

圖6 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)單位菌體產(chǎn)酶量和產(chǎn)酶水平的影響Fig.6 Effects of induced time on the enzymic production per unit and production level of recombinant E. coli

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化重組大腸桿菌產(chǎn)乙酰乳酸合成酶

2.4.1 回歸模型的建立和方差分析

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 5 Results of response surface design and corresponding analysis

從分析軟件Box-Behnken 程序擬合獲得的交互二次回歸方程F檢驗(yàn)和失擬檢驗(yàn)(表6)，模型P= 0.000 2 < 0.01(極顯著)，說(shuō)明模型呈現(xiàn)極顯著；失擬項(xiàng)P= 0.057 > 0.05(不顯著)，說(shuō)明該模型與試驗(yàn)擬合程度好，誤差較小，可以用此模型進(jìn)行乙酰乳酸合成酶的產(chǎn)酶水平分析和預(yù)測(cè)。從各個(gè)因素顯著性水平差異可知，對(duì)乙酰乳酸合成酶的產(chǎn)酶水平影響順序依次為IPTG濃度>pH>溫度，特別是IPTG濃度對(duì)乙酰乳酸合成酶的產(chǎn)酶水平影響達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)，而pH和溫度2個(gè)因素對(duì)產(chǎn)酶水平的影響不顯著。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)的回歸方程方差分析Table 6 Results of response surface design based on the ANOVA of the regression equation

2.4.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)分析軟件Box-Behnken 程序擬合獲得的交互二次回歸方程得出不同因素的響應(yīng)面和等高線分析結(jié)果如圖7所示。由各模型參數(shù)可知，X1、X2、X3的二次方項(xiàng)對(duì)重組大腸桿菌產(chǎn)乙酰乳酸合成酶有極顯著的影響，而各因素之間的相互作用對(duì)乙酰乳酸合成酶量影響不顯著。根據(jù)響應(yīng)面圖和等高線圖趨勢(shì)，經(jīng)對(duì)比分析得出，在追求高水平產(chǎn)酶效率時(shí)，在因素pH(X1)保持穩(wěn)定的情況下，應(yīng)考慮溫度(X2) 與IPTG濃度(X3)的交互作用。

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)回歸方程和響應(yīng)面預(yù)測(cè)重組大腸桿菌產(chǎn)乙酰乳酸合成酶的發(fā)酵最優(yōu)條件為pH 7.0、溫度30.2 ℃，IPTG濃度為0.42 mmol/L，該優(yōu)化條件下乙酰乳酸合成酶產(chǎn)酶水平為237.081 U/mL。經(jīng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以預(yù)測(cè)條件做3次平行實(shí)驗(yàn)，得到最高的產(chǎn)酶水平為242.567 U/mL，與模型的預(yù)測(cè)值相近，無(wú)顯著性差異，說(shuō)明該模型能夠準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)重組大腸桿菌產(chǎn)乙酰乳酸合成酶的發(fā)酵條件，也可以獲得較高產(chǎn)酶水平。

2.4.4 最優(yōu)誘導(dǎo)條件下不同培養(yǎng)基中菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶比較

前述實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的優(yōu)化條件組合后，利用最佳優(yōu)化條件確定了最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分如下：葡萄糖10 g/L，蛋白胨15 g/L，檸檬酸鈉 0.25 g/L，KH2PO40.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.025 g/L，NaCl 0.1 g/L。根據(jù)優(yōu)化后的誘導(dǎo)條件進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，對(duì)比重組菌在發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基中菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶情況，結(jié)果顯示優(yōu)化后培養(yǎng)基的菌體質(zhì)量濃度、單位菌體產(chǎn)酶量和產(chǎn)酶水平均優(yōu)于LB培養(yǎng)基(表7)，分別達(dá)到1.623 g/L、164.299 kU/g和266.657 U/mL，是原LB培養(yǎng)基的1.35、1.31和1.77倍。

a-pH與溫度交互圖；b-pH與溫度平面圖；c-pH與IPTG濃度交互圖；d-pH與IPTG濃度平面圖；e-溫度與IPTG濃度交互圖；f-溫度與IPTG濃度平面圖圖7 各因素交互作用對(duì)產(chǎn)酶水平影響的響應(yīng)面Fig.7 Response surface analysis for interactive effects of pH,induced temperature and IPTG concentration on enzymic production level of recombinant E. coli

表7 不同培養(yǎng)基中菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)酶水平Table 7 Bacterial growth and enzyme production in different media

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基各組分后，確定重組大腸桿菌產(chǎn)乙酰乳酸合成酶的最適發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：葡萄糖12 g/L，蛋白胨10 g/L，檸檬酸鈉0.25 g/L，KH2PO40.05，MgSO4·7H2O 0.025 g/L，NaCl 0.1 g/L；最佳條件為pH=7.0，誘導(dǎo)溫度30.2 ℃，IPTG濃度0.42 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間10 h。在此條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，單位菌體產(chǎn)酶量(164.299 kU/g)和產(chǎn)酶水平(266.657 U/mL)分別是LB培養(yǎng)基的1.31和 1.77倍。本實(shí)驗(yàn)為提高具有活性的乙酰乳酸合成酶產(chǎn)量，及增強(qiáng)雙乙酰的合成代謝流及低成本大量生產(chǎn)酶制劑增補(bǔ)一些數(shù)據(jù)和資料基礎(chǔ)。