ISA 61 VG佐劑增強單核細胞增生李斯特氏菌滅活疫苗的保護性免疫應答

朱騰飛，孟凡增，姚浩，王玉婷，焦新安，殷月蘭

·醫(yī)藥生物技術·

ISA 61 VG佐劑增強單核細胞增生李斯特氏菌滅活疫苗的保護性免疫應答

朱騰飛*，孟凡增*，姚浩，王玉婷，焦新安，殷月蘭

教育部農(nóng)業(yè)和農(nóng)產(chǎn)品國際合作聯(lián)合實驗室/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質量安全生物性危害因子 (動物源) 控制重點實驗室/江蘇省動物重要疫病和人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省人獸共患病重點實驗室/揚州大學 生物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009

單核細胞增生李斯特氏菌 (，) 是重要的人獸共患李斯特氏菌病的致病菌，疫苗免疫是預防該病原菌感染的有效手段之一。本研究研制了添加礦物油佐劑MontanideTMISA 61 VG的新型滅活細菌疫苗，并對其安全性和免疫應答特性進行了研究。結果表明，ISA 61 VG佐劑疫苗具有較好的安全性；誘導小鼠產(chǎn)生的抗李斯特氏菌溶血素O抗體滴度以及IgG2a/IgG1比值顯著高于無佐劑免疫組；在致死劑量攻毒下，能對小鼠提供100%的免疫保護。因此，ISA 61VG佐劑能顯著增強滅活疫苗誘導宿主產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫應答的能力，從而提高滅活疫苗的保護性免疫應答作用，是預防人和動物感染的潛在疫苗候選株。

單核細胞增生李斯特氏菌，佐劑，滅活疫苗，安全性，免疫效力

單核細胞增生李斯特氏菌(，) 是一種革蘭氏陽性、兼性胞內(nèi)寄生菌，能通過污染的食物感染人類和動物導致李斯特氏菌病[1-2]。在自然界中廣泛分布，能感染40多種動物，是重要的人獸共患致病菌，已經(jīng)引起多個國家暴發(fā)李斯特氏菌病。2017–2018年南非暴發(fā)李斯特氏菌病，最終導致216人死亡，總死亡率27%[2]；2011–2017年，我國報道了562例李斯特菌病病例，總死亡率約為27.4%[3]。能跨越腸道屏障，感染免疫功能低下人群，引起孕婦流產(chǎn)、敗血癥、腦膜炎等嚴重并發(fā)癥[4]，死亡率為25%–30%。為了預防和控制李斯特氏菌病發(fā)生，開發(fā)一種安全有效的李斯特氏菌疫苗的工作意義重大。

為胞內(nèi)寄生菌，通過表達的李斯特菌溶血素O、磷脂酶PI-PLC等毒力因子裂解宿主巨噬細胞吞噬泡，進入細胞質中并進行繁殖[5]；在其表達的肌動蛋白聚集因子ActA的作用下進行極向運動，從而逃逸至相鄰細胞中，在宿主體內(nèi)進行擴散和傳播[6]。針對胞內(nèi)感染和致病的特性，要求李斯特菌疫苗能夠誘導強烈的細胞免疫應答。多年來，許多研究者在減毒活疫苗[7]、滅活但代謝活性(KBMA) 疫苗[8]、亞單位疫苗[9]和納米疫苗[10]等方面開展了相關研究[11]，在預防和治療李斯特氏菌病方面取得了一定的進展。通過敲除強毒野生型菌株的多個毒力基因，能顯著降低的毒力，并能較好地誘導細胞免疫應答[12]，但減毒活疫苗具有毒力返祖現(xiàn)象，具有導致免疫低下的個體患李斯氏特菌病的風險[13-14]。滅活但有代謝活性(KBMA) 疫苗中的具有代謝能力，不能在宿主體內(nèi)存活和復制，有一定的安全性[8]，能誘導宿主體液免疫同時誘導保護性細胞免疫[7,15]；目前KBMA疫苗研究僅局限于小鼠實驗，尚未進入臨床試驗[16]。亞單位疫苗缺乏穩(wěn)定性且免疫原性較弱，不能有效刺激免疫系統(tǒng)[9]。此外，新型納米疫苗是一個可探索的研究方向，其穩(wěn)定性和免疫保護作用有待于深入開展研究[17]。滅活疫苗問世相當長時間，經(jīng)大量臨床使用證實滅活疫苗有良好的免疫刺激效應，同時病原體不能在宿主體內(nèi)復制傳播從而具有良好的安全性[18]?？紤]到李斯特氏菌病的易感人群是免疫系統(tǒng)功能低下的人群，因此具有較高安全性的滅活疫苗是預防感染的理想候選疫苗。

滅活疫苗是將病原微生物通過加熱或甲醛等理化方法進行滅活，使其喪失感染性和毒性后仍保持良好的免疫原性，但是刺激宿主免疫應答的能力降低。因此，滅活細菌疫苗中必須加入佐劑，包裹滅活疫苗的抗原，使其長時間刺激抗原提呈細胞[19]，從而增強滅活疫苗的免疫效力以及免疫保護作用[20]。疫苗佐劑主要分為凝膠佐劑、礦物油佐劑、乳膠佐劑和脂質體佐劑幾大類[21]。疫苗佐劑的作用機制是“抗原庫”效應，可在注射部位儲存免疫原，可長時間刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應答[22]。鋁佐劑疫苗是最早應用于人體的疫苗，但鋁佐劑疫苗具有激發(fā)抗體的時間較短、需多次免疫以及不能有效誘導細胞免疫應答等不足[23-24]。礦物油佐劑和抗原乳化聯(lián)合使用，在制備成滅活疫苗后，可增強疫苗本身的免疫原性，促進抗原刺激宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應答[25-26]。MontanideTMISA 61 VG油包水(W/O) 礦物油佐劑混合疫苗乳化，能夠有效增強小鼠的免疫保護水平，具有替代氫氧化鋁凝膠佐劑的潛力[27-28]。

本研究采用油包水佐劑ISA 61 VG混合滅活乳化制備滅活疫苗的方案，研制了混合佐劑滅活李斯特氏菌疫苗，通過對小鼠進行安全性、體液免疫與細胞免疫以及保護性免疫應答等的測定，初步探究了ISA 61 VG作為李斯特氏菌疫苗佐劑的有效性以及安全性。

1 材料與方法

1.1 菌株與實驗動物

LM4是一株從綿羊中分離得到的血清型為1/2a的單核細胞增生李斯特氏菌，由揚州大學江蘇省人獸共患病學重點實驗室保存。動物實驗使用體重13–15 g的雌性6周齡BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。所有實驗程序均經(jīng)揚州大學比較醫(yī)學中心批準，符合小鼠福利和倫理道德的要求。

1.2 儀器與試劑

腦心浸液培養(yǎng)基Brain Heart Infusion (BHI，Becton Dickinson and Company，US)；磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)；40%甲醛(中國醫(yī)藥集團公司，中國上海)；MontanideTMISA 61 VG (賽彼科特殊化學品(上海) 有限公司贈送)；羊抗鼠酶標二抗(Goat Anti-mouse IgG，IgG1-HRP，IgG2a-HRP，Southern Biotech Inc. US)；酶標儀(Bio Tek Instruments，US)。

1.3 甲醛滅活細菌的制備

將LM4菌株接種于BHI液體培養(yǎng)基，在37 ℃搖床培養(yǎng)箱內(nèi)180 r/min振搖培養(yǎng)過夜。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS) 洗滌培養(yǎng)物3次，并用PBS重懸菌體，調(diào)整菌液光密度濁度600 nm (600) 為0.8，計算細菌數(shù)量(CFU)，再次離心后，終濃度0.4%甲醛溶液重懸細菌，濃度為1×109CFU/mL，在37 ℃滅活24 h。分別用BHI平板以及5%色氨酸血平板在37 ℃下孵育5 d，對制備的滅活疫苗進行無菌檢查。將滅活疫苗在20 ℃保存以待進一步使用。

1.4 佐劑混合疫苗的制備

將LM4在BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收獲培養(yǎng)物并用PBS洗3遍，再使用分光光度計將菌液調(diào)整至一定濃度，使用油包水礦物油佐劑MontanideTMISA 61 VG制備滅活疫苗。將滅活細菌抗原懸液與ISA 61 VG佐劑按35︰65體積比混合，用1 mL玻璃注射器反復抽打乳化，利用佐劑快速通過針筒將佐劑與細菌進行乳化，細菌乳化后終濃度為6.66×109CFU/mL，即109CFU/只。

1.5 疫苗動物實驗

將18只6周齡健康雌性13–15 g BALB/c小鼠隨機分為3組，每組6只，飼養(yǎng)于25 ℃環(huán)境。在第0天皮下免疫疫苗，疫苗分組以及疫苗劑量見表1。持續(xù)對小鼠接種疫苗后的精神、活動、食欲和體重的變化以及小鼠接種部位有無異常病變觀察2周。

表1 小鼠分組及免疫和攻毒劑量

Mice were divided into three groups; each group was immunized by the number of bacteria used in the vaccine and the number of immune doses used in the challenge. A: ISA 61 VG + PBS; B: ISA 61 VG + Inactivated LM4; C: Inactivate LM4.

1.6 間接ELISA檢測法測定抗LLO抗體以及抗體分型

分別在免疫后7 d、21 d、28 d采集小鼠血樣，并制備血清，采用間接ELISA檢測稀釋后血清中的抗體。酶標板中使用李斯特氏菌溶血素(LLO) 蛋白質(由揚州大學江蘇省人畜共患病重點實驗室制備和保存)，使用碳酸鹽緩沖液(CBS) 稀釋至0.64 μg/孔封閉；一抗血清從1︰400倍比稀釋至1︰102 400，使用加入0.05%吐溫的PBS配制TPBS溶解牛血清白蛋白 (BSA) 的溶液稀釋血清，BSA的終濃度為1%，每孔100 μL，同時分別使用1︰10 000倍稀釋的IgG1與IgG2a酶標二抗測定小鼠血清中IgG1與IgG2a抗體亞型的滴度，計算二者比值；顯色液TMB 37 ℃孵育顯色10 min后，用450酶標儀檢測吸光值，同時設定陰性血清對照孔，讀數(shù)值/陰性值≥2.1判定為陽性孔。

1.7 攻毒試驗

各實驗組小鼠第0 天皮下免疫，第14 天加強免疫。在第35天即第二次免疫后的第3周，通過腹腔注射10×LD50野生株LM4攻毒小鼠，攻毒細菌劑量為2.5×106CFU/只。隔離飼養(yǎng)觀察小鼠14 d，記錄臨床癥狀及死亡情況。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗結果數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism5軟件對免疫組小鼠血清中抗體滴度的差異進行統(tǒng)計學分析，<0.05即認為用于比較的兩組存在顯著性差異，<0.01判斷為非常顯著差異，<0.001判斷為極顯著差異。IgG、IgG1、IgG2a的滴度表示為Log10 (平均值)±標準差(SEM)。

2 結果與分析

2.1 疫苗制備

24 h后觀察無菌檢驗BHI瓊脂固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基表面未見微生物生長。ISA 61 VG佐劑與滅活細菌乳化制成的疫苗形成油包水乳化微滴包裹抗原，在水表面并未稀散，與理論上油包水佐劑效果相符。取內(nèi)口直徑為1.2 mm的滴管，室溫下吸滿1 mL疫苗乳劑，垂直放出0.4 mL所需時間為6 s。疫苗于37 ℃貯存21 d未破乳，表明該疫苗物理性狀良好。

2.2 實驗動物觀察

在整個試驗過程中，各組小鼠均處于正常體溫范圍內(nèi)(37.5–39.5 ℃)，皮毛顏色正常，精神狀態(tài)良好，能夠在健康的狀態(tài)下生存。與對照組相比，免疫組注射部位僅輕微發(fā)紅，無膿液及結痂痕，說明疫苗較為安全。增重實驗結果(圖1A、1B) 免疫后4周，免疫組與空白健康對照組體重無顯著差異。在攻毒后2周，ISA 61 VG混合滅活LM4組的體重顯著高于滅活LM4組，而空白對照組的體重顯著低于滅活LM4組。

圖1 疫苗免疫(A) 和LM4攻毒(B) 后的小鼠體重變化

2.3 血清中抗LLO IgG與亞型抗體

小鼠接種疫苗后血清中LLO IgG抗體水平的變化情況如圖2A所示。第一次免疫一周后，所有小鼠血清中均檢測到李斯特氏菌溶血素(LLO)特異性抗體。在接下來的試驗階段，各實驗組血清抗體滴度均有明顯的上升趨勢，每組的抗體滴度在21 d達到最高水平，并維持一定的時間，各組抗體滴度隨著時間的延長而逐漸降低，符合抗體消長規(guī)律，各疫苗組小鼠抗體的動態(tài)趨勢基本相同。在免疫后的7 d、14 d和21 d，ISA 61 VG混合滅活LM4組誘導的抗體水平均顯著高于滅活LM4組。

圖2 小鼠血清抗體檢測。(A) 小鼠血清中LLO抗體的動態(tài)測定和(B) 免疫組血清抗體亞型測定

為了探究新型滅活疫苗對小鼠血清中Th1和Th2細胞因子介導的免疫應答的促進或抑制作用，我們測定了免疫期間各組小鼠血清IgG1/IgG2a的比值(圖2B)。新型佐劑滅活疫苗可誘導不同IgG亞型(IgG1、IgG2a) 抗體的產(chǎn)生，在第7、21、28天明顯高于無佐劑滅活疫苗免疫組。結果表明，新型滅活疫苗抗原可持續(xù)刺激宿主產(chǎn)生偏向性Th1細胞毒免疫反應，有效消除細胞內(nèi)病原菌感染。

2.4 免疫保護實驗

野生株LM4腹腔注射2.5×106CFU/150 μL每只小鼠。圖3實驗結果表明，PBS混合甲醛以及ISA 61 VG組小鼠免疫保護率為0%，ISA 61 VG混合滅活LM4組小鼠免疫保護率為100%，滅活LM4組小鼠免疫保護率僅為17%。免疫保護試驗結果表明，佐劑為ISA 61 VG的滅活疫苗免疫保護效果較好，具有潛在的應用前景。

3 討論

單核細胞增生李斯特氏菌() 是人獸共患李斯特氏菌病的病原菌，近幾年在全世界多個國家暴發(fā)李斯特氏菌病[2-3,29]。我國每年都有多例李斯特氏菌病的發(fā)生，因此迫切需要開發(fā)一種可以有效預防和治療李斯特氏菌病的疫苗。研究表明，雖然福爾馬林滅活疫苗可以誘導產(chǎn)生一定的免疫應答，預防細菌感染[30-31]，但單獨的滅活疫苗不能刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生較強的免疫應答，往往需要添加佐劑以增強疫苗的免疫原性[32]。MontanideTMISA佐劑可誘導小鼠產(chǎn)生持久的體液免疫和細胞免疫[33]。我們研發(fā)的疫苗使用的ISA 61 VG佐劑是一種弗氏不完全佐劑(IFA)[34]，該佐劑疫苗進入臨床Ⅱ期試驗[35]。本研究使用經(jīng)過福爾馬林滅活的LM4作為疫苗免疫原，加入油包水佐劑ISA 61 VG混合乳化后制成滅活疫苗，并在動物實驗中檢測該滅活疫苗的安全性以及免疫保護作用。實驗中未觀察到小鼠接種疫苗后的不良反應。單核細胞增生李斯特氏菌是胞內(nèi)寄生菌，單純的無佐劑滅活細菌無法對清除胞內(nèi)寄生菌起到顯著作用，攻毒使用的LM4毒性較強，且達到10 LD50的致死劑量，免疫組佐劑疫苗組對致死劑量野生株的攻毒保護率高達100%，而無佐劑滅活疫苗的攻毒保護率只有17%，初步證實該滅活疫苗具有良好的安全性與免疫保護效果。

圖3 不同實驗組小鼠攻毒后生存曲線(%)

宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性IgG抗體能夠有效抵御感染，抗李斯特氏菌溶血素(LLO) 抗體可中和毒素并保護宿主免受感染[36]，同時針對其他蛋白產(chǎn)生的抗體對宿主同樣具有保護作用[37]。有實驗表明滅活的全菌疫苗可以誘導體液免疫應答[38]，加入ISA 61 VG佐劑能顯著提高抗體效價從而增強體液免疫效應[27]。在本研究中，ISA 61 VG混合疫苗組在免疫21 d后達到峰值，LLO免疫原抗體水平明顯高于無佐劑組，證明佐劑疫苗能夠刺激產(chǎn)生較強的體液免疫。實驗結果顯示，混合ISA 61 VG佐劑乳化疫苗誘導的抗體水平顯著升高，對降低感染者的細菌載量發(fā)揮重要作用。

能夠侵襲巨噬細胞及多種非吞噬細胞，逃避宿主的體液免疫應答[39]，因此清除需要T淋巴細胞介導的細胞免疫應答參與。輔助T淋巴細胞是一種細胞免疫中重要的淋巴細胞，主要有Th1與Th2兩種類型[40]。Th1細胞激活巨噬細胞，促進B細胞分泌針對細胞內(nèi)感染細菌的IgG2a抗體，而Th2細胞通過刺激產(chǎn)生針對細胞外感染的IgG1，輔助體液免疫反應。通常IgG2a/IgG1的比值可以反映免疫應答的類型[41]，動物血清中相同抗原特異性抗體IgG2a/IgG1的比值大于1，則相應的疫苗抗原誘導Th1型免疫應答[42]。本研究中ISA 61 VG佐劑疫苗免疫組IgG2a/IgG1顯著高于無佐劑免疫組，且誘導產(chǎn)生了Th1型傾向性的免疫應答。因此，ISA 61 VG佐劑滅活李斯特氏菌疫苗在誘導體液免疫應答的同時誘導產(chǎn)生較強的細胞免疫應答，作為消除細胞內(nèi)病原菌的單核細胞增生李斯特氏菌的先決條件，為李斯特氏菌病的預防和控制提供了實驗基礎。

綜上所述，我們采用混合乳化滅活與ISA 61 VG佐劑的方法制備滅活疫苗，評價了疫苗的安全性和保護性免疫應答特性。研究結果表明，ISA 61 VG對滅活疫苗刺激宿主產(chǎn)生細胞和體液免疫應答具有顯著的增強作用，提示該滅活疫苗是一種安全有效的預防感染的疫苗，為預防動物和人的李斯特氏菌病奠定了基礎。

[1] Winter P, Schilcher F, Bagò Z, et al. Clinical and histopathological aspects of naturally occurring mastitis caused byin cattle and ewes. J Vet Med B, 2004, 51(4): 176–179.

[2] Smith AM, Tau NP, Smouse SL, et al. Outbreak ofin South Africa, 2017–2018: Laboratory activities and experiences associated with whole-genome sequencing analysis of isolates. Foodborne Pathog Dis, 2019, 16(7): 524–530.

[3] Fan ZL, Xie J, Li Y, et al. Listeriosis in mainland China: A systematic review. Int J Infect Dis, 2019, 81: 17–24.

[4] Lamont RF, Sobel J, Mazaki-Tovi S, et al. Listeriosis in human pregnancy: a systematic review. J Perinat Med, 2011, 39(3): 227–236.

[5] Jia YY, Yin YL, Tan WJ, et al. Construction and characterization of an attenuated recombinantvector vaccine delivering HPV16 E7. Chin J Biotech, 2016, 32(5): 683–692 (in Chinese)賈艷艷, 殷月蘭, 談衛(wèi)軍, 等. 減毒李斯特菌載體運送 HPV16 E7 基因重組疫苗的構建及其生物學特性. 生物工程學報, 2016, 32(5): 683–692.

[6] Pizarro-Cerdá J, Kühbacher A, Cossart P. Entry ofin mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harb Perspect Med, 2012, 2(11): 705–709.

[7] Lauer P, Hanson B, Lemmens EE, et al. Constitutive activation of the PrfA regulon enhances the potency of vaccines based on live-attenuated and killed but metabolically activestrains. Infect Immun, 2008, 76(8): 3742–3753.

[8] Brockstedt DG, Bahjat KS, Giedlin MA, et al. Killed but metabolically active microbes: a new vaccine paradigm for eliciting effector T-cell responses and protective immunity. Nat Med, 2005, 11(8): 853–860.

[9] Ansari MA, Zubair S, Tufail S, et al. Ether lipid vesicle-based antigens impart protection against experimental listeriosis. Int J Nanomedicine, 2012, 7: 2433–2447.

[10] Calderon-Gonzalez R, Marradi M, Garcia I, et al. Novel nanoparticle vaccines for listeriosis. Hum Vaccin Immunother, 2015, 11(10): 2501–2503.

[11] Ansari MA, Zia Q, Kazmi S, et al. Efficacy of cell wall-deficientagainst experimental murine listeriosis. Scand J Immunol, 2015, 82(1): 10–24.

[12] Darji A, Mohamed W, Domann E, et al. Induction of immune responses by attenuated isogenic mutant strains of. Vaccine, 2003, 21(S2): S102–S109.

[13] Sacco JJ, Evans M, Harrington KJ, et al. Systemic listeriosis following vaccination with the attenuatedtherapeutic vaccine, ADXS11-001. Hum Vaccin Immunother, 2015, 12(4): 1085–1086.

[14] Fares E, McCloskey CB, Gutierrez A, et al. Vaccine strainbacteremia occurring 31 months after immunization. Infection, 2018, 47(3): 489–492.

[15] Dubensky TW, Skoble J, Lauer P, et al. Killed but metabolically active vaccines. Curr Opin Biotechnol, 2012, 23(6): 917–923.

[16] Flickinger JC Jr, Rodeck U, Snook AE.as a vector for cancer immunotherapy: Current understanding and progress. Vaccines (Basel), 2018, 6(3): 48.

[17] Skwarczynski M, Toth I. Recent advances in peptide-based subunit nanovaccines. Nanomedicine (Lond), 2014, 9(17): 2657–2669.

[18] Delany I, Rappuoli R, de Gregorio E. Vaccines for the 21st century. EMBO Mol Med, 2014, 6(6): 708–720.

[19] Heegaard PM, Fang YX, Jungersen G. Novel adjuvants and immunomodulators for veterinary vaccines. Methods Mol Biol, 2016, 1349: 63–82.

[20] Dong H, Jiao XA, Pan ZM, et al. Immunogenicity comparision ofinactivated by gamma-irradiation or traditional treatments. Acta Microbiol Sin, 2009, 49(2): 269–273 (in Chinese). 董慧, 焦新安, 潘志明, 等. γ-輻射與常規(guī)方法滅活產(chǎn)單核細胞李斯特菌對小鼠免疫原性的比較. 微生物學報, 2009, 49(2): 269–273.

[21] Burakova Y, Madera R, McVey S, et al. Adjuvants for animal vaccines. Viral Immunol, 2017, 31(1): 11–22.

[22] Hem SL, Hogenesch H. Relationship between physical and chemical properties of aluminum-containing adjuvants and immunopotentiation. Expert Rev Vaccines, 2007, 6(5): 685–698.

[23] Golo? A, Lutyńska A. Aluminium-adjuvanted vaccines--A review of the current state of knowledge. Prz Epidemiol, 2015, 69(4): 731–734, 871–874.

[24] Carroll EC, Jin L, Mori A, et al. The vaccine adjuvant chitosan promotes cellular immunity via DNA sensor cGAS-STING-dependent induction of type I interferons. Immunity, 2016, 44(3): 597–608.

[25] Doel TR. Natural and vaccine-induced immunity to foot and mouth disease: the prospects for improved vaccines. Rev Sci Tech, 1996, 15(3): 883–911.

[26] Zhang JQ, Miao JF, Han XG, et al. Development of a novel oil-in-water emulsion and evaluation of its potential adjuvant function in a swine influenza vaccine in mice. BMC Vet Res, 2018, 14: 415.

[27] Khorasani A, Madadgar O, Soleimanjahi H, et al. Evaluation of the efficacy of a new oil-based adjuvant ISA 61 VG FMD vaccine as a potential vaccine for cattle. Iran J Vet Res, 2016, 17(1): 8–12.

[28] Aguilar FF, Barranco JJ, Fuentes EB, et al. Very small size proteoliposomes (VSSP) and Montanide combination enhance the humoral immuno response in a GnRH based vaccine directed to prostate cancer. Vaccine, 2012, 30(46): 6595–6599.

[29] Self JL, Conrad A, Stroika S, et al. Multistate outbreak of listeriosis associated with packaged leafy green salads, United States and Canada, 2015–2016. Emerg Infect Dis, 2019, 25(8): 1461–1468.

[30] Mckenzie R, Walker RI, Nabors GS, et al. Safety and immunogenicity of an oral, inactivated, whole-cell vaccine for: preclinical studies and a Phase I trial. Vaccine, 2006, 24(18): 3735–3745.

[31] McConnell MJ, Pachón J. Active and passive immunization againstusing an inactivated whole cell vaccine. Vaccine, 2010, 29(1): 1–5.

[32] Petrovsky N, Aguilar JC. Vaccine adjuvants: current state and future trends. Immunol Cell Biol, 2004, 82(5): 488–496.

[33] Subharat S, Shu DR, Zheng T, et al. Vaccination of sheep with a methanogen protein provides insight into levels of antibody in saliva needed to target ruminal methanogens. PLoS ONE, 2016, 11(7): e0159861.

[34] Qin SX, Sun T. Evaluation of novel adjuvant for swine foot-and-mouth disease type O synthetic peptide vaccine (polypeptide 2600+2700+2800). Abstract Anim Husbandry Vet Med Sin, 2018, 34(2): 65–66 (in Chinese)秦守賢, 孫濤. 豬口蹄疫O型合成肽疫苗(多肽2600＋2700＋2800)新佐劑評估試驗. 中國畜牧獸醫(yī)文摘, 2018, 34(2): 65–66.

[35] Thakur A, Andrea A, Mikkelsen H, et al. Targeting the Mincle and TLR3 receptor using the dual agonist cationic adjuvant formulation 9 (CAF09) induces humoral and polyfunctional memory T cell responses in calves. PLoS ONE, 2018, 13(7): e0201253.

[36] Edelson BT, Unanue ER. Intracellular antibody neutralizesgrowth. Immunity, 2001, 14(5): 503–512.

[37] Asano K, Sashinami H, Osanai A, et al. Passive immunization with anti-ActA and anti-listeriolysin O antibodies protects againstinfection in mice. Sci Rep, 2016, 6: 39628.

[38] Takahashi K, Hanamura Y, Tokunoh N, et al. Protective effects of oral immunization with formalin-inactivated whole-celloninfection in mice. J Microbiol Methods, 2019, 159: 62–68.

[39] Tilney LG, Portnoy DA. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite,. J Cell Biol, 1989, 109(4): 1597–1608.

[40] Atkins H, Davies BR, Kirby JA, et al. Polarisation of a T-helper cell immune response by activation of dendritic cells with CpG-containing oligonucleotides: a potential therapeutic regime for bladder cancer immunotherapy. Br J Cancer, 2003, 89(12): 2312–2319.

[41] Agrewala JN, Wilkinson RJ. Differential regulation of Th1 and Th2 cells by p91–110 and p21–40 peptides of the 16-kD alpha-crystallin antigen of. Clin Exp Immunol, 1998, 114(3): 392–397.

[42] Mcguirk P, Mills KHG. Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in the Th1/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol, 2002, 23(9): 450–455.

ISA61 VG adjuvant enhances protective immune response ofinactivated vaccine

Tengfei Zhu*, Fanzeng Meng*, Hao Yao, Yuting Wang, Xin’an Jiao, and Yuelan Yin

Yangzhou University, College of Bioscience and Biotechnology/Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis/Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses/Key Laboratory of Prevention and Control of Biological Hazard Factors (Animal Origin) for Agrifood Safety and Quality, Ministry of Agriculture of China/Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-product Safety of the Ministry of Education, Yangzhou 225009, Jiangsu, China

() is zoonotic pathogen that can cause listeriosis, and vaccine is one of the effective methods to prevent this pathogen infection. In this study, we developed a novel vaccine that is a mixture of inactivated bacteria and MontanideTMISA 61 VG, a mineral oil adjuvant, and evaluated the safety and immune response characteristics of this vaccine. The mice immunized with the ISA 61 VG adjuvant had high safety, and it could induce significantly higher titer of anti-listeriolysin O (LLO) antibody and higher value of IgG2a/IgG1 ratio compared with the group without the adjuvant. In particular, it could provide 100% immune protection against lethal doses ofchallenge in mice. In summary, ISA 61VG adjuvant significantly enhanced the ability of inactivated listeria vaccine to induce humoral and cellular immune responses, thereby enhanced the protective immune response in the host, and it is a potential vaccine candidate for the prevention ofinfection in humans and animals.

, adjuvant, inactivated vaccine, safety, vaccine potency

10.13345/j.cjb.190487

October 10, 2019;

April 20, 2020

Supported by: National Key R&D Program of China (No. 2017YFC1601201), National Natural Science Foundation of China (No. 31472193), Key Research and Development Program (Modern Agriculture) Project of Jiangsu Province (No. BE2017341).

Yuelan Yin. Tel: +86-514-87971136; Fax: +86-514-87971547; E-mail: yylan@yzu.edu.cn

*These authors contributed equally to this study.

國家重點研發(fā)計劃項目 (No. 2017YFC1601201)，國家自然科學基金 (No. 31472193)，江蘇省重點研發(fā)計劃 (現(xiàn)代農(nóng)業(yè)) 項目 (No. BE2017341)資助。

朱騰飛, 孟凡增, 姚浩, 等. ISA 61 VG佐劑增強單核細胞增生李斯特氏菌滅活疫苗的保護性免疫應答. 生物工程學報, 2020, 36(7): 1378–1385.

Zhu TF, Meng FZ, Yao H, et al. ISA61 VG adjuvant enhances protective immune response ofinactivated vaccine. Chin J Biotech, 2020, 36(7): 1378–1385.

(本文責編 陳宏宇)