抗菌肽的抗生物膜機(jī)理研究進(jìn)展

汪文博，王冠男，蔡莎莎

·綜 述·

抗菌肽的抗生物膜機(jī)理研究進(jìn)展

汪文博，王冠男，蔡莎莎

濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院 醫(yī)藥工程學(xué)院 醫(yī)藥組織工程實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)寧 272000

生物膜，也稱為生物被膜，是指附著于有生命或無(wú)生命物體表面被細(xì)菌胞外大分子包裹的有組織的細(xì)菌群體。與浮游菌相比，生物膜內(nèi)的細(xì)菌對(duì)抗生素的耐受性提高了10–1 000倍，是造成目前細(xì)菌耐藥的主要原因之一。作為一種新型抗菌制劑，抗菌肽的使用為生物膜感染的治療提供了一種新的思路和手段?？咕脑谝种粕锬ば纬?、殺滅生物膜內(nèi)細(xì)菌以及消除成熟生物膜的過(guò)程中發(fā)揮了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。文中分析了近30年的數(shù)據(jù)，從細(xì)菌生物膜的結(jié)構(gòu)入手，對(duì)抗菌肽可能的抗生物膜機(jī)理進(jìn)行了綜述，以期為抗菌肽臨床治療生物膜感染提供一定參考。

抗菌肽，細(xì)菌生物膜，機(jī)理

隨著細(xì)菌耐藥性的發(fā)展，尤其是當(dāng)耐藥性同時(shí)出現(xiàn)在細(xì)胞水平和群體水平時(shí)，針對(duì)耐藥菌感染的治療已經(jīng)成為一項(xiàng)全球性的挑戰(zhàn)。細(xì)胞水平的細(xì)菌耐藥主要包括3個(gè)方面：細(xì)菌修飾抗生素作用的靶標(biāo)蛋白，產(chǎn)生相應(yīng)的酶滅活抗生素或者將抗生素類藥物外排到細(xì)胞外，降低細(xì)菌體內(nèi)藥物的濃度[1]。在群體水平上，細(xì)菌耐藥的主要機(jī)制是細(xì)胞聚集形成生物膜，產(chǎn)生一個(gè)天然屏障，阻斷抗生素[1-2]。

生物膜是指微生物為適應(yīng)周圍環(huán)境，粘附于生命或非生命的介質(zhì)表面，并被其自身分泌的胞外基質(zhì)(Extracellular polymeric substances，EPS)包裹而形成的一種穩(wěn)定復(fù)雜的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[3-5]。幾乎所有的細(xì)菌都可以形成生物膜。1999年Costerton等在雜志上明確提出細(xì)菌生物膜是引起細(xì)菌持續(xù)性感染的常見(jiàn)致病機(jī)制，且60%以上的臨床感染病例都與細(xì)菌生物膜的形成有關(guān)。現(xiàn)在已知，細(xì)菌可在人體組織如牙齒、皮膚、肺、尿道等器官表面形成生物膜，引起一系列的頑固和復(fù)發(fā)性的感染性疾病，如齲齒、慢性支氣管炎、難治性肺部感染、血栓性靜脈炎和心內(nèi)膜炎等[1]。與浮游細(xì)菌相比，生物膜內(nèi)的細(xì)菌對(duì)抗菌藥物和宿主免疫系統(tǒng)具有很強(qiáng)的耐受性，用抗生素治療很難將其徹底殺滅或者清除，且加大抗生素的用量不僅對(duì)生物膜內(nèi)的細(xì)菌無(wú)效，還可能引起無(wú)法預(yù)知的毒副作用[1]。因此尋找一種安全有效的抗生物膜藥物或方法一直是醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題。

將抗菌肽作為新型抗生物膜制劑應(yīng)用于臨床治療越來(lái)越多地引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[6-7]?？咕氖巧矬w在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中為適應(yīng)環(huán)境、求得生存而最早產(chǎn)生的一類活性分子，是宿主先天免疫防御的重要組成成分。這類活性多肽多是一些陽(yáng)離子小肽，由5–100個(gè)氨基酸殘基組成，分子量在1–5 kDa之間[6-9]。由于抗菌肽具有多靶點(diǎn)、非特異性作用機(jī)制，不易引起細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，其被認(rèn)為是目前最有前途的抗生素替代品。除了廣譜高效的殺菌活性，抗菌肽對(duì)多重耐藥的細(xì)菌生物膜還表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性[6,10]。大量研究表明，抗菌肽不僅能在細(xì)菌生物膜形成的早期進(jìn)行干擾，防止細(xì)菌最初的粘附，還能通過(guò)促使微生物細(xì)胞脫離或殺死微生物細(xì)胞來(lái)破壞成熟的生物膜[11-12]。本文從生物膜的結(jié)構(gòu)入手，結(jié)合其形成過(guò)程，對(duì)抗菌肽可能的抗生物膜機(jī)制進(jìn)行了歸納和總結(jié)，以期為抗菌肽臨床治療生物膜感染提供參考。

1 抗菌肽抗生物膜的作用機(jī)理

1.1 抑制細(xì)菌細(xì)胞對(duì)附著表面的初始粘附

細(xì)菌生物膜的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，主要分為細(xì)菌可逆性的粘附定殖階段、不可逆性的粘附集聚階段、生物被膜的成熟階段和細(xì)菌的脫落與再定殖階段。其中，浮游細(xì)菌對(duì)物體表面的粘附是啟動(dòng)細(xì)菌生物膜形成的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽能抑制細(xì)菌細(xì)胞對(duì)附著表面的初始粘附，發(fā)揮抗生物膜活性[11]。Cathelicidin家族抗菌肽LL-37能夠上調(diào)與Ⅰ型菌毛生物合成相關(guān)的基因的表達(dá)，增加細(xì)菌的蹭行運(yùn)動(dòng)，降低其對(duì)塑料薄膜 表面的黏附，從而抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成[13-14]。細(xì)菌素Bovicin HC5和Nisin可通過(guò)改變金黃色葡萄球菌生物膜表面的疏水性，降低其在食物表面的黏附作用[15]。而抗菌肽Citropin[16]和Mmelimine[17]已被證明作為包埋材料能有效抑制病原菌在一些醫(yī)療器械表面的黏附，包括尿道管和隱形眼鏡。葡萄球菌生物膜的形成是一個(gè)積聚而成的過(guò)程，這一過(guò)程主要依賴于葡萄球菌基因編碼的多糖胞間黏附素(Polysaccharide intercellular adhesion，PIA) 分子的合成。研究表明，人源防御素HBD-3能夠通過(guò)下調(diào)表皮葡萄球菌ATCC 35984細(xì)胞內(nèi)、以及基因的表達(dá)，抑制PIA的表達(dá)，進(jìn)而抑制其生物膜的形成[18]。此外，抗菌肽還可通過(guò)干擾細(xì)菌細(xì)胞與細(xì)胞之間的接觸，抑制生物膜的形成。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被報(bào)道與生物膜形成過(guò)程中細(xì)胞與材料以及細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用有關(guān)[19-20]。Wang等研究顯示抗菌肽Nal-P-113能夠通過(guò)影響ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因 (PG0280–PG0282) 的表達(dá)，減少細(xì)菌細(xì)胞之間的接觸，從而抑制牙齦卟啉單胞菌生物膜的形成[20]。

1.2 干擾生物膜形成相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)

1.2.1 調(diào)節(jié)細(xì)菌生物膜群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorum sensing，QS)

當(dāng)游離細(xì)菌粘附到附著物表面后，其會(huì)通過(guò)分泌QS信號(hào)分子監(jiān)測(cè)周圍環(huán)境的變化，調(diào)控自身相關(guān)基因的表達(dá)，分泌大量的EPS填充生物膜中細(xì)菌與細(xì)菌之間的空隙，為細(xì)菌生物膜提供機(jī)械穩(wěn)定性[21]。研究表明，QS系統(tǒng)與細(xì)菌生物膜的形成、致病性相關(guān)毒力因子的表達(dá)以及多種耐藥途徑等密切相關(guān)[22]。銅綠假單胞菌主要存在兩種特征性的QS系統(tǒng)：Las系統(tǒng)和Rh1系統(tǒng)[23]。研究發(fā)現(xiàn)，人源抗菌肽LL-37能夠通過(guò)抑制QS關(guān)鍵信號(hào)分子的表達(dá)，顯著下調(diào)包括和在內(nèi)的50多個(gè)生物膜形成相關(guān)基因的表達(dá)，抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成[14]。

1.2.2 抑制細(xì)菌的嚴(yán)緊應(yīng)答反應(yīng)(Stringent response)

高度磷酸化的鳥(niǎo)苷四磷酸和五磷酸(簡(jiǎn)稱(p)ppGpp) 是介導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞對(duì)環(huán)境脅迫產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)的重要胞內(nèi)信號(hào)分子，通過(guò)控制一系列重要的細(xì)胞活動(dòng)使細(xì)菌得以生存。(p)ppGpp含量的任何變化都會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)菌生物膜的形成和維持。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽可通過(guò)作用于在革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌中普遍存在的嚴(yán)緊應(yīng)激反應(yīng)而發(fā)揮抗生物膜活性[24]?？咕腎DR1018、DJK-5和DJK-6可通過(guò)阻止(p)ppGpp的生物合成，并促進(jìn)其降解，進(jìn)而抑制生物膜的形成[25]。此外，抗菌肽DJK-5和IDR-1018還可通過(guò)抑制spoT啟動(dòng)子的活性影響細(xì)菌的嚴(yán)緊應(yīng)答，抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成[26]。

1.3 消除細(xì)菌生物膜內(nèi)的胞外基質(zhì)(EPS)

大多數(shù)生物膜中，微生物僅占干重的10%，其胞外基質(zhì)(EPS) 的含量卻高達(dá)90%以上。EPS多是由胞外多糖、核酸、蛋白質(zhì)以及脂類等物質(zhì)組成，其致密的結(jié)構(gòu)構(gòu)成了抗菌藥物滲透的生理屏障，加之抗菌藥物經(jīng)常被EPS所捕獲并滯留，極大降低了抗菌藥物對(duì)生物膜內(nèi)細(xì)菌的殺傷作用。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽能夠通過(guò)對(duì)EPS組分的清除或破壞，發(fā)揮抗生物膜活性。蜱蟲(chóng)抗凍蛋白來(lái)源的多肽P1可降解鏈球菌產(chǎn)生的EPS，消除其在聚苯乙烯或唾液包被的羥磷灰石材料上形成的生物膜[27]。來(lái)源于紅頭麗蠅蛆蟲(chóng)的一種抗生物膜肽能夠降解由耐藥性的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生的生物膜基質(zhì)，但其具體的抗生物膜機(jī)制還未知[28]。人肝源性抗菌肽Hepcidin-20可通過(guò)靶標(biāo)多糖胞間黏附素，降低表皮葡萄球菌的胞外基質(zhì)含量，改變其生物膜的構(gòu)架組成[29]。另一類抗菌肽S4 (1-16) M4Ka被證明可通過(guò)分解膜脂、分散細(xì)菌以及抑制生物膜形成等發(fā)揮抗銅綠假單胞菌生物膜活性[30]。魚(yú)抗菌肽Piscidin-3則被報(bào)道可通過(guò)其N末端氨基酸與Cu2+形成共價(jià)鍵，發(fā)揮核酸酶活性，破壞銅綠假單胞菌胞外DNA，發(fā)揮抗生物膜活性[31]。

1.4 殺死生物膜內(nèi)的細(xì)菌細(xì)胞

作為小分子陽(yáng)離子多肽，抗菌肽所具有的兩親性分子結(jié)構(gòu)使得其既能透過(guò)脂雙層結(jié)構(gòu)，又能溶解在水環(huán)境中?？咕膶?duì)細(xì)菌的殺菌作用通常始于其通過(guò)靜電作用與帶負(fù)電的革蘭氏陰性菌外膜中的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS) 或革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中的脂磷壁酸(Lipoteichoic acid，LTA) 的相互作用[6,32-34]。一旦抗菌肽分子穿過(guò)細(xì)菌的外膜/細(xì)胞壁，或在外膜/細(xì)胞壁上形成孔洞，細(xì)菌細(xì)胞就會(huì)因細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化死亡[6,35]。PTP-7就是一類典型的具有細(xì)胞膜裂解作用的抗生物膜肽，它是Gaegurin 5的合成衍生物。研究表明，盡管PTP-7是一類陽(yáng)離子小肽，但其活性不受生物膜基質(zhì)中的酸性pH環(huán)境、帶負(fù)電荷的胞外多糖或者是高金屬離子濃度的影響。此外，PTP-7還能穿透進(jìn)入生物膜內(nèi)部，并有效殺死生物膜內(nèi)的細(xì)菌細(xì)胞[36]。細(xì)菌素Nisin A、Lacticin Q和Nukacin ISK-1等則被發(fā)現(xiàn)能夠通過(guò)破壞耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant，MRSA) 生物膜內(nèi)細(xì)胞的膜電位，引起細(xì)胞內(nèi)ATP的釋放，發(fā)揮抗生物膜活性[37]。來(lái)源于嗜酸性粒細(xì)胞的陽(yáng)離子肽RN3 (5-17P22-36) 可通過(guò)引起生物膜內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞膜去極化發(fā)揮抗生物膜活性，但是其作用強(qiáng)度僅為對(duì)浮游細(xì)菌的1/3–1/2[38-40]。此外，Luca等研究發(fā)現(xiàn)蛙皮來(lái)源的抗菌肽Esc (1-21) 還能穿透生物膜內(nèi)細(xì)胞的質(zhì)膜，引起β-半乳糖苷酶的釋放，發(fā)揮抗銅綠假單胞菌PAO1生物膜活性[41]。

2 總結(jié)與展望

隨著抗生素耐藥菌株的大量出現(xiàn)，細(xì)菌生物膜感染成為新世紀(jì)抗感染治療的新挑戰(zhàn)?？咕囊蚱鋸V譜、高效的優(yōu)點(diǎn)在生物膜感染治療方面展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景[6,42]。但是目前關(guān)于抗菌肽抗生物膜的研究資料還很有限，未來(lái)需要更深入的研究去解析抗菌肽明確的作用機(jī)制，比如抗菌肽是如何干擾QS信號(hào)抑制生物膜形成的，是否會(huì)干擾EPS組分合成相關(guān)的信號(hào)通路，又是否能夠靶標(biāo)一些病原菌的毒力因子發(fā)揮抗生物膜活性等。計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)的應(yīng)用或許將有助于我們深入探究抗菌肽的作用機(jī)理。

此外，雖然有很多報(bào)道顯示抗菌肽在體內(nèi)體外表現(xiàn)出強(qiáng)而有力的抑制生物膜形成活性，但是很少有抗菌肽被報(bào)道對(duì)成熟生物膜有很強(qiáng)的作用。而在實(shí)際的臨床治療中，醫(yī)生們經(jīng)常要面對(duì)的是已經(jīng)形成的生物膜，因此如何加速抗菌肽對(duì)成熟生物膜的清除作用必將成為未來(lái)急需解決的問(wèn)題之一。將藥物協(xié)同應(yīng)用或許提供了一種新的抗生物膜感染治療思路。且已有研究表明，聯(lián)合應(yīng)用抗菌肽和抗生素不僅可以抑制生物膜的形成，更能有效誘導(dǎo)降解成熟的生物膜基質(zhì)[43-44]。

同時(shí)，抗菌肽自身在臨床應(yīng)用中也面臨著一些問(wèn)題，如生理?xiàng)l件下活性降低，對(duì)血清、蛋白酶敏感等。因此，在抗菌肽生物合成時(shí)，用非天然和D型氨基酸分別替換活性肽分子中的天然和L型氨基酸，或者在給藥時(shí)將多肽利用模擬肽技術(shù)做成脂質(zhì)體納米粒子劑型，在保證活性不變的情況下，延長(zhǎng)其半衰期，或許是抗菌肽臨床應(yīng)用未來(lái)發(fā)展的方向。此外，真正將抗菌肽應(yīng)用于臨床抗生物膜感染治療之前，還需要反復(fù)進(jìn)行動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，確定其在體內(nèi)某一特定位點(diǎn)給藥時(shí)的最佳給藥途徑，以及給藥劑量。

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Current progress in antimicrobial peptides against bacterial biofilms

Wenbo Wang, Guannan Wang, and Shasha Cai

The Key Laboratory for Medical Tissue Engineering, College of Medical Engineering, Jining Medical University, Jining 272000, Shandong, China

Microbial biofilm, a consortium of microbial cells protected by a self-produced polymer matrix, is considered as one main cause of current bacterial drug resistance. As a new type of antimicrobial agents, antimicrobial peptides provide a new strategy for the treatment of antibiotic resistant bacteria biofilm infections. Antimicrobial peptides have shown unique advantages in preventing microbial colonization of surfaces, killing bacteria in biofilms or disrupting the mature biofilm structure. This review systemically analyzes published data in the recent 30 years to summarize the possible anti-biofilm mechanisms of antimicrobial peptides. We hope that this review can provide reference for the treatment of infectious diseases by pathogenic microbial biofilm.

antimicrobial peptides, bacterial biofilm, anti-biofilm mechanisms

10.13345/j.cjb.190511

November 13, 2019;

January 20, 2020

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31900328), College Students’ Innovative Training Program of Jining Medical University (No. S201910443031).

Shasha Cai. E-mail: biocaishasha@mail.jnmc.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 31900328)，濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(No. S201910443031) 資助。

汪文博, 王冠男, 蔡莎莎. 抗菌肽的抗生物膜機(jī)理研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(7): 1277–1282.

Wang WB, Wang GN, Cai SS. Current progress in antimicrobial peptides against bacterial biofilms. Chin J Biotech, 2020, 36(7): 1277–1282.

(本文責(zé)編 陳宏宇)