降解柴油嗜鹽菌的篩選、鑒定及其降解特性

高文靜，肖麗嬌，王順民，韓秋霞

(山東科技大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山東 青島 266590)

柴油是石油煉制過程中產(chǎn)生的輕質(zhì)石油產(chǎn)品，是復(fù)雜烴類的混合物[1]，柴油導(dǎo)致的污染是世界各國普遍關(guān)注和需要面對的環(huán)境問題，生物法治理柴油污染具有成本低和安全等優(yōu)點[2]，成為柴油污染治理的常用方法。然而，柴油污染常伴隨著高鹽環(huán)境，采用一般的生物處理法處理柴油污染時，高濃度的鹽離子會妨礙微生物的生長及其對柴油的降解，影響處理效果[3]。因此，研究能耐受一定鹽濃度的柴油降解菌，對柴油污染而形成的鹽漬化土壤和高鹽度的柴油廢水進行生物修復(fù)具有重要的指導(dǎo)意義[4]。吳濤等[3]從被柴油污染的土壤中篩選到一株耐鹽柴油降解菌BM38，在高鹽環(huán)境下能降解柴油。目前尚未見專門針對鹽場區(qū)域的柴油降解菌的研究[5]。

柴油降解的第一步是以某種方式將碳氫化合物從油相輸送到細胞表面，從而實現(xiàn)有效的細胞表面接觸，并最終實現(xiàn)跨細胞膜的有效輸送[6]。但是柴油大部分組成成分不溶或難溶于水，使得微生物不能與之充分接觸，成為微生物治理環(huán)境污染的一大阻礙。生物表面活性劑是由微生物細胞代謝產(chǎn)生的一類具有表面活性的產(chǎn)物[7]。有關(guān)分析認為，向純培養(yǎng)物中添加生物表面活性劑能促進多種碳氫化合物的生物降解[8]，其主要通過增加烴類物質(zhì)的溶解度和提高生物利用率2個途徑來提高微生物對柴油的降解[9]。然而，通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生提取到的生物表面活性劑產(chǎn)量有限，很難通過投加大量生物表面活性劑來提高柴油降解率，因此，需要篩選高產(chǎn)生物表面活性劑的嗜鹽菌，將其與柴油降解菌配合投加來處理柴油污染，以加快柴油的生物降解，但目前關(guān)于耐高鹽的復(fù)合菌系降解特性的研究較少[10]。

本研究從鹽場分離純化得到的145株嗜鹽菌中篩選出1株高產(chǎn)生物表面活性劑嗜鹽菌B-2和1株高效柴油降解嗜鹽菌B-18，對菌株進行鑒定和降解碳鏈烴類的特性研究，同時研究其降解特性構(gòu)建復(fù)合菌系，確定最適柴油降解條件，并通過掃描電鏡觀察研究降解柴油前后菌體的形態(tài)變化，以期為高鹽環(huán)境下柴油污染的生物修復(fù)和工業(yè)化菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

菌株分離自山東昌邑鹽場(37°02′2.48″N，119°22′18.12″E)NaCl質(zhì)量體積分數(shù)為12%～26%的曬鹽水，分離純化得到145株嗜鹽菌。

1.2 培養(yǎng)基

Gibbons培養(yǎng)基(GM)：NaCl 100.0 g，酵素水解物5.0 g，酵母浸出物10.0 g，檸檬酸鈉3.0 g，MgSO4·7H2O 20.0 g，KCl 2.0 g，加蒸餾水至1 L，pH 7.0。

無機鹽培養(yǎng)基(MSM)：FeSO4·7H2O 2.5×10-5g，(NH4)2SO410.0 g，KH2PO43.4 g，K2HPO44.4 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.11 g，EDTA 1.0 g，NaCl 100.0 g，加蒸餾水至1 L，pH 7.0，添加體積分數(shù)3%柴油(0#柴油)作為唯一碳源。

血平板培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，NaCl 100.0 g，牛肉粉3.0 g，瓊脂20.0 g，加蒸餾水至1 L，pH 7.0，滅菌后冷卻至50 ℃，加入50 mL無菌脫纖維羊血搖勻后倒平板。

1.3 菌株篩選與生物學(xué)特性分析

1.3.1 柴油降解菌的分離篩選

將實驗室保藏的145株嗜鹽菌單菌接種于以體積分數(shù)3%柴油為唯一碳源的MSM中，37 ℃，200 r·min-1恒溫搖床培養(yǎng)120 h，選取長勢良好的菌株作進一步研究。

1.3.2 柴油降解率的測定

柴油濃度的測定采用紫外法[11]，待測嗜鹽菌接種于含有體積分數(shù)3%柴油的MSM中，37 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)120 h后，加入10 mL石油醚(60～90 ℃沸程)萃取發(fā)酵液中未降解的柴油，萃取液8 000×g冷凍離心10 min，加入無水硫酸鈉除水，過濾至25 mL容量瓶中，用石油醚定容，754紫外可見分光光度計測定柴油殘油量。

式中：m0是空白培養(yǎng)基柴油的質(zhì)量；m1是實驗培養(yǎng)基柴油的質(zhì)量。

1.3.3 生物表面活性劑初篩

選擇長勢良好的嗜鹽菌株接種于以體積分數(shù)3%柴油為唯一碳源的MSM中，37 ℃，恒溫搖床培養(yǎng)96 h后，將發(fā)酵液離心得上清液。取直徑為90 mm的培養(yǎng)皿，加入20 mL蒸餾水，在蒸餾水表面滴加200 μL經(jīng)蘇丹Ⅲ染色的液體石蠟形成油膜，在油膜中心小心滴加200 μL上清液，形成排油圈，測定排油圈的直徑[12]。

將菌株點種到血平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)2～3 d，觀察單菌落周圍有無透明的溶血圈，確定是否有表面活性物質(zhì)產(chǎn)生[13]。

將柴油降解菌接種到含有體積分數(shù)3%柴油的MSM中發(fā)酵，以不接菌的培養(yǎng)基作為空白對照，37 ℃培養(yǎng)96 h，將發(fā)酵液離心得上清液，室溫下用JK99B全自動張力儀測定菌液表面張力。

1.4 菌株鑒定

通過形態(tài)學(xué)觀察[14]和16S rRNA序列分析，對所得菌株進行鑒定。將嗜鹽菌株送交到生工生物工程(上海)股份有限公司測定，把測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性比較，獲得與實驗菌株序列相似的其他相關(guān)菌株的16S rRNA序列。用MEGA version5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 柴油降解菌降解柴油組分的GC-MS測定

將柴油降解菌接種到以體積分數(shù)3%柴油為唯一碳源的MSM中，培養(yǎng)5 d后提取剩余柴油組分，進行GC-MS測定(安捷倫，HP-5MS柱)，檢測柴油的降解情況。色譜條件：高純度氦氣(99.999%)，進樣口溫度290 ℃，平衡時間為0.25 min，進樣量1 μL，程序升溫條件：起始溫度100 ℃(維持2 min)，以10 ℃·min-1升溫至300 ℃，維持10 min。

1.6 影響柴油降解因素實驗

1.6.1 柴油單一碳源實驗

將菌株接種到以柴油為唯一碳源的MSM中，搖床37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)96 h。初始柴油體積分數(shù)分別設(shè)置為5%、10%、15%，每12 h測定菌體濃度和柴油降解率。

1.6.2 單菌株柴油降解實驗

將菌株接種到GM中，搖床37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)48 h后分別加入體積分數(shù)5%、10%、15%、20%、30%、40%的柴油，搖床37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每12 h測定柴油降解率。

1.6.3 復(fù)合菌株柴油降解實驗

將高產(chǎn)生物表面活性劑嗜鹽菌與高效柴油降解菌接種到GM中，搖床37 ℃、200 r·min-1混合培養(yǎng)48 h后分別加入體積分數(shù)5%、10%、15%、20%、30%、40%的柴油，搖床37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每12 h測定柴油降解率，每隔24 h測發(fā)酵液表面張力。

1.6.4 培養(yǎng)條件對復(fù)合菌株降解柴油的影響

向GM中接種復(fù)合菌株，分析以下環(huán)境因素對柴油降解的影響：(1)NaCl質(zhì)量體積分數(shù)分別為0、5%、10%、15%、20%；(2)培養(yǎng)溫度分別為20、28、37、45 ℃；(3)培養(yǎng)基初始pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。200 r·min-1混合培養(yǎng)48 h后加入體積分數(shù)5%的柴油，測其生長狀況與柴油降解率。

1.7 掃描電鏡觀察

對在添加柴油和未添加柴油的GM中生長4 d的嗜鹽菌進行掃描電子顯微鏡(SEM)觀察，分析菌體降解柴油前后的形態(tài)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 柴油降解菌的篩選

通過體積分數(shù)3%柴油為唯一碳源的MSM篩選，共得到35株可以降解柴油的嗜鹽菌。編號為B-1至B-35，其降解率在3.90%～54.00%(圖1)。生物表面活性劑初篩結(jié)果見表1。篩選實驗得到35株嗜鹽菌，其中，B-2的排油圈直徑可達6 cm(圖2-A)，表面活性劑性質(zhì)最為突出，在血平板上可產(chǎn)生較為明顯的透明圈(圖2-B)，其表面張力(27.15 mN·m-1)與對照(74.88 mN·m-1)相比，大幅度降低；同時，B-2的柴油降解率達到44.80%。B-18對柴油的降解率最高，達到54.00%，其表面活性劑性質(zhì)也較為突出，溶血實驗結(jié)果為陽性，表面張力降至28.14 mN·m-1。對比其他菌株的相關(guān)數(shù)據(jù)，判斷嗜鹽菌表面活性劑的產(chǎn)量與降解柴油能力之間存在高相關(guān)性。因此，選擇B-2和B-18菌株進行下一步實驗。

圖1 三十五株嗜鹽菌的柴油降解率Fig.1 Diesel degradation rates of 35 halophilic strains

表1 三十五株嗜鹽菌表面活性劑初篩結(jié)果

續(xù)表1 Continued Table 1

圖2 B-2菌株的排油圈(A)和溶血效果(B)Fig.2 Oil spreading (A) and hemolysis result (B) of B-2

2.2 菌株鑒定

B-2和B-18在GM平板上培養(yǎng)48～72 h后，如圖3所示，B-2菌落為圓形，呈淡黃色，凸起，表面光滑濕潤，邊緣整齊，不透明；革蘭氏染色陰性，菌體細胞為桿狀，(0.2～0.5)μm×(0.6～2.0)μm，單生或簇生。B-18菌落為橘紅色圓形，菌落凸起，表面光滑較干燥，邊緣整齊，不透明；革蘭氏染色陽性，菌體細胞為球狀，直徑0.5～1.0 μm，單生或?qū)ι?/p>

對B-2和B-18菌株的16S rRNA序列進行比對分析，選取同源性高的16S rRNA序列，利用MEGA 5軟件對菌株及其近緣屬種進行遺傳距離分析，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示。B-2與嗜鹽鹽漬微菌屬(Salimicrobiumsp.)的幾種細菌的模式菌株位于進化樹的同一類群，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，B-2與菌株Salimicrobiumgeotgalistrain MJ3 (NR134168)的相似度為99%。B-18與鹽水球菌屬(Salinicoccussp.)的菌株Salinicoccussiamensisstrain PN1-2(NR_041459)的相似度為99%。結(jié)合細菌表型特征，將菌株B-2鑒定為嗜鹽鹽漬微菌屬(Salimicrobiumsp.)，B-18為鹽水球菌屬(Salinicoccussp.)。

圖4 菌株B-2(A)和B-18(B)的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of B-2(A) and B-18 (B) based on 16S rRNA sequences

2.3 B-18對柴油降解的GC-MS分析

采用GC-MS法對柴油降解后的殘留組分進行分析。在GC-MS分析中，未接菌的原始柴油中存在正構(gòu)烷烴(C14-C29)和支鏈烷烴峰，而在接種了柴油降解菌降解后提取的柴油中，嗜鹽菌可以降解柴油(C14-C29)中幾乎所有的碳氫化合物，但是對短烷烴、長鏈烷烴和芳香烴的利用能力較差(圖5)，這與已經(jīng)報道的結(jié)果相一致[15]。因此，推測B-18適合于柴油和其他碳氫化合物污染的生物修復(fù)。

2.4 影響柴油降解的因素

2.4.1 柴油單一碳源

當B-2和B-18分別接種于以柴油為唯一碳源的MSM中時，柴油體積分數(shù)變化對B-2和B-18降解柴油效率的影響十分顯著。如圖6和圖7所示，在未添加柴油的GM中菌體生長最旺盛，當MSM中柴油體積分數(shù)為5%時，嗜鹽菌生長較旺盛，B-2對柴油降解率為35.62%，B-18對柴油降解率為45.62%。隨著柴油濃度增加，降解率下降。分析認為適宜濃度的柴油為菌體生長提供碳源，菌體生長旺盛，促進了對柴油的降解，而柴油過多時對微生物具有一定的毒性，不利于微生物的生長[16]，從而使降解率下降。

圖7 柴油體積分數(shù)對B-18在MSM中柴油降解率和生長曲線的影響Fig.7 Effect of diesel concentration on diesel degradation rates and growth curve of B-18 in MSM

圖6 柴油體積分數(shù)對B-2在MSM中柴油降解率和生長曲線的影響Fig.6 Effect of diesel concentration on diesel degradation rates and growth curve of B-2 in MSM

A，B-2的菌落形態(tài)；B，B-2革蘭氏染色；C，B-2掃描電鏡下菌株形態(tài)；D，B-18的菌落形態(tài)；E，B-18革蘭氏染色；F，B-18掃描電鏡下菌株形態(tài)。A，Colony morphology of B-2; B，Gram staining of B-2; C，SEM photo of B-2; D，Colony morphology of B-18 ; E，Gram staining of B-18; F，SEM photo of B-18.圖3 菌株B-2和B-18的形態(tài)特征Fig.3 Morphology characteristics of B-2 and B-18

A，降解前的柴油組分；B，B-18降解后的柴油組分。A，Diesel components before degradation; B，Diesel components after degradation by B-18.圖5 柴油降解菌B-18降解前后的柴油GC-MS譜圖Fig.5 GC-MS analysis of diesel components after degradation by B-18

2.4.2 單菌株培養(yǎng)柴油降解效果

由柴油單一碳源實驗結(jié)果可知，在MSM中，高濃度柴油抑制B-2和B-18的生長，從而使其柴油降解率大幅度降低。因此，將嗜鹽菌B-2和B-18分別在GM中培養(yǎng)至48 h，達到穩(wěn)定期后，再加入不同濃度的柴油，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，測定柴油降解率，結(jié)果如圖8所示。在GM中，將各菌培養(yǎng)至對數(shù)末期，此時菌體濃度最高、活性最強，然后加入柴油，嗜鹽菌對柴油的降解能力顯著提高。柴油體積分數(shù)為5%時，B-2的柴油降解率提高至49.08%，B-18的柴油降解率提高至53.46%。隨著柴油濃度增加，柴油降解率逐漸下降。分析認為GM中微生物多使柴油降解率高，但是柴油體積分數(shù)過高使微生物降解酶活性受到抑制[17]，從而使降解率下降。因此，降解菌在營養(yǎng)豐富的GM中生長到一定濃度后再投加適宜量的的柴油，能有效提高菌株對柴油的降解率。

圖8 柴油體積分數(shù)對B-2(A)和B-18(B)在GM中柴油降解率的影響Fig.8 Effect of diesel concentration on diesel degradation rates of B-2 (A) and B-18 (B) in GM

2.4.3 復(fù)合菌株的柴油降解效果

同時接種B-2和B-18復(fù)合菌株，分析復(fù)合菌株對柴油的降解情況。由圖9-A可知，同時接種B-2和B-18的培養(yǎng)基中，柴油降解率顯著提高，柴油體積分數(shù)為5%時，柴油降解率高達68.50%，比單菌B-2提高了39.6%，比單菌B-18提高了28.1%；柴油體積分數(shù)為15%時，復(fù)合菌的降解率達40.57%；柴油體積分數(shù)為40%時，降解率仍達17.22%。現(xiàn)有文獻未見柴油濃度為40%時仍有降解能力的菌株[18]。研究表明，柴油的憎水性能阻礙微生物與其接觸并進行降解，而某些微生物可在柴油的誘導(dǎo)下產(chǎn)生生物表面活性劑，促進柴油進入細胞內(nèi)使其被降解[19-20]。如圖9-B所示，未添加柴油的GM發(fā)酵液表面張力沒有明顯變化，而添加柴油后，隨著發(fā)酵時間的增加發(fā)酵液表面張力逐漸降低，且在降解第2天，表面張力驟減，說明菌株在有柴油的培養(yǎng)基內(nèi)產(chǎn)生了表面活性劑，降低了發(fā)酵液表面張力，促進了菌體對柴油的攝取和降解。另有研究表明[21]，復(fù)合菌株對柴油的降解效果顯著優(yōu)于單菌株。

圖9 柴油體積分數(shù)對復(fù)合菌株在GM中柴油降解率和發(fā)酵液表面張力的影響Fig.9 Effect of diesel concentration on diesel degradation rates and surface tension of fermentation broth of the microbial consortium in GM

以上分析說明，當高產(chǎn)生物表面活性劑菌B-2與高效柴油降解菌B-18混合培養(yǎng)降解柴油時，柴油誘導(dǎo)嗜鹽菌產(chǎn)生了生物表面活性劑，其具有良好的乳化和增溶性能，降低液體表面張力，因此，可以大大提高柴油的分散度，從而使得柴油與細胞充分接觸，加快柴油進入菌體細胞并被降解，因此，柴油降解能力顯著提高。

2.4.4 培養(yǎng)條件對復(fù)合菌株柴油降解率的影響

如圖10-A所示，NaCl質(zhì)量體積分數(shù)為10%是復(fù)合菌株降解柴油的最適鹽濃度，降解率為68.50%，過低或過高的鹽濃度都不同程度地抑制菌體的生長，NaCl質(zhì)量體積分數(shù)為5%和15%時的降解率仍為47.65%和30.21%，可見復(fù)合菌株具備一定的耐鹽能力。培養(yǎng)溫度對復(fù)合菌株柴油降解率影響較明顯(圖10-B)，當溫度為12 ℃時，發(fā)酵液較澄清，柴油降解率較低，僅為6.40%，隨著溫度的升高，菌株生長旺盛，柴油降解能力逐漸提升，28 ℃時柴油降解率為47.85%，37 ℃時菌株的生長量達到最大，并且柴油降解率達到最高(68.50%)；溫度繼續(xù)升高，菌體生長量與降解率都呈下降趨勢，因為微生物主要通過細胞內(nèi)的降解酶系對柴油進行降解，溫度過高或過低，都會抑制微生物的代謝活動。復(fù)合菌株最適的生長pH在7.5左右(圖10-C)，此時對柴油的降解率也最大，達到70.45%；pH為8.0時，對柴油的降解率低于7.0而高于6.5，這可能是因為當pH在7.0～8.0的弱堿性環(huán)境下，微生物代謝較為旺盛，從而加快對柴油的降解[22]。

A，NaCl對柴油降解率的影響；B，溫度對柴油降解率的影響；C，pH對柴油降解率的影響。A，Effect of NaCl concentration on diesel degradation rates; B，Effect of temperature on diesel degradation rates; C，Effect of pH value on diesel degradation rates.圖10 培養(yǎng)條件對復(fù)合菌株柴油降解率的影響Fig.10 Effect of culture conditions on diesel degradation rates of the microbial consortium in GM

2.5 降解柴油的SEM分析

對在含柴油培養(yǎng)基中生長4 d的嗜鹽菌進行掃描電鏡觀察，B-2菌體形態(tài)由桿狀變成弧狀，并且菌體細胞變大而顯得更加飽滿(圖11-A)，在未添加柴油培養(yǎng)基中生長的嗜鹽菌與之相比，菌體要小(圖3-C)；B-18細胞表面形成黏性聚合物，將單個細胞連接成復(fù)雜的凝聚體，并且連接緊密以致形成膜內(nèi)陷(圖11-B)，在體積分數(shù)40%柴油培養(yǎng)基中生長的B-18細胞表面的復(fù)合物分布更密集(圖11-C)，可能柴油促進這種復(fù)合物的形成，而在未添加柴油的培養(yǎng)基中生長的菌體相對分散，相對連接不緊密(圖3-F)。有研究表明，掃描電鏡觀察到的胞外聚合物可能是柴油和生物表面活性劑的復(fù)合物，這種復(fù)合物可以加速細胞對柴油的攝取，從而提高柴油降解率[23]。

3 討論

已有報道表明，常見的具有柴油降解性能的微生物主要是細菌類和真菌類[24]，大多是從被柴油污染的土壤或海水中獲得，關(guān)于從鹽場篩選得到的嗜鹽菌降解柴油的研究較少。本研究從鹽場分離得到的嗜鹽菌中篩選出1株高產(chǎn)生物表面活性劑嗜鹽菌B-2和1株高效柴油降解嗜鹽菌B-18。B-2可將培養(yǎng)液表面張力從74.88 mN·m-1降至27.15 mN·m-1。Souza等[25]篩選得到一株產(chǎn)生物表面活性劑的酵母菌，可以將發(fā)酵液表面張力降至30 mN·m-1，并且該菌不能耐鹽堿，而B-2能適應(yīng)高鹽環(huán)境，推測其應(yīng)用領(lǐng)域更為廣泛。柴油體積分數(shù)為3%時，B-2對柴油的降解率為44.80%，B-18對柴油的降解率為54.00%，與已報道菌株的降解率相比[26-27]，其降解能力處于中間水平。本研究篩選到的菌株分別屬于嗜鹽鹽漬微菌屬(Salimicrobiumsp.)和鹽水球菌屬(Salinicoccussp.)，本文首次報道了鹽水球菌屬的柴油降解作用。另有研究表明，一些微生物能夠通過產(chǎn)生生物表面活性劑，提高對柴油的攝取進而加快降解，且細菌產(chǎn)生表面活性劑的多少與降解柴油的能力呈正相關(guān)[28]，如菌株P(guān)seudomonassp. BP10通過產(chǎn)生生物表面活性劑降低了發(fā)酵液的表面張力，促進了柴油的乳化作用，但本研究的結(jié)果卻不同，雖然B-18生物表面活性劑的活性不如B-2強，但柴油降解能力強，這可能是因為B-18其他代謝產(chǎn)物對其有影響。GC-MS結(jié)果顯示，B-18可以降解柴油中幾乎所有的碳氫化合物，但是對短烷烴、長鏈烷烴和芳香烴的利用能力較差，這與已經(jīng)報道的結(jié)果相一致[15]。

混合接種B-2和B-18于GM中，復(fù)合菌對柴油的降解效果最好，柴油體積分數(shù)為5%時，對柴油的降解率提高至68.50%，降解率比單菌B-2提高了39.6%，比B-18提高了28.1%，高于張海玲等[29]的報道，柴油體積分數(shù)為2%時，其構(gòu)建的柴油降解復(fù)合菌的降解率為61.3%，當柴油體積分數(shù)為40%時，降解率仍為17.22%。當柴油體積分數(shù)為5%時，吳秉奇等[21]研究的復(fù)合菌系SQ1的降解率顯著下降。本研究中2株菌混合接種出現(xiàn)明顯的協(xié)同效應(yīng)，發(fā)酵液表面張力顯著降低，B-2高產(chǎn)生物表面活性劑，提高了復(fù)合菌系對柴油的攝取利用[30]。

A，在含有5%柴油的培養(yǎng)基中生長的B-2菌株細胞形態(tài)；B，在含有5%柴油的培養(yǎng)基中生長的B-18菌株細胞形態(tài)；C，在含有40%柴油的培養(yǎng)基中生長的B-18菌株細胞形態(tài)。A，Scanning electron microscopy (SEM) of B-2 grown on 5% diesel; B，SEM of B-18 grown on 5% diesel; C，SEM of B-18 grown on 40% diesel.圖11 B-2和B-18的掃描電鏡圖像Fig.11 Scanning electron microscopy photograph of B-2 and B-18

本研究發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)體系的鹽濃度、溫度和pH對復(fù)合菌系降解柴油的影響較為顯著，鹽濃度直接影響菌體的生長狀態(tài)，適宜的鹽濃度下菌株才能生長旺盛，溫度影響菌株的代謝活動，pH可能與菌體細胞內(nèi)降解柴油的酶系活力相關(guān)[31]?？傮w來看，復(fù)合菌系對鹽濃度、溫度和pH都具有較寬范圍的耐受能力，這與嗜鹽菌獨特的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)有關(guān)[32]。單因素實驗結(jié)果表明，柴油體積分數(shù)為5%時，復(fù)合菌株的最佳鹽濃度為10%，最佳溫度為37 ℃，最佳pH為7.5，在該條件下對柴油降解率達到最大(70.45%)。復(fù)合接種不僅能適應(yīng)高鹽的含油環(huán)境，而且能夠產(chǎn)生生物表面活性劑，對處理柴油污染并伴隨高鹽情況的生物修復(fù)具有重要的意義。

本研究篩選到的柴油降解菌是來自鹽場的嗜鹽菌，對環(huán)境的適應(yīng)能力優(yōu)于普通菌株，目前有關(guān)嗜鹽菌的研究主要集中在菌株的多相分類和功能酶作用研究等方面，本研究是首次對鹽水球菌屬降解柴油作用進行報道，對于混合接種B-2和B-18時柴油的降解代謝機理，如烴代謝途徑、烴降解酶系等有待進一步研究。另外，柴油降解菌一般應(yīng)用于被柴油污染的土壤或者海水區(qū)域，現(xiàn)場環(huán)境復(fù)雜，還需進行現(xiàn)場實驗來驗證復(fù)合菌系對柴油的降解效果。