染色體微陣列分析技術(shù)在胎兒頸項透明層增厚中的應(yīng)用

丁小瑞 劉愛菊 楊曉彥 張俊繪

[摘要] 染色體微陣列分析（CMA）是新近發(fā)展的產(chǎn)前診斷技術(shù)，憑著巨大的優(yōu)勢得到了廣泛的應(yīng)用。其優(yōu)點(diǎn)為分辨率達(dá)到Kb級別、靈敏度和特異性高、較高程度的自動化操作以及高效率等，不僅能檢測染色體數(shù)目異常及非平衡性結(jié)構(gòu)異常，還能檢測染色體組亞顯微結(jié)構(gòu)水平上不平衡重排引起的拷貝數(shù)變異（CNV）。因此，在臨床檢測中取得青睞，成為現(xiàn)在臨床遺傳學(xué)常規(guī)診斷的工具，并被引入到產(chǎn)前胎兒遺傳疾病檢測中。頸項透明層（NT）測量作為常規(guī)的早孕期篩查項目之一已被人們廣泛采用，大量研究發(fā)現(xiàn)NT增厚是胎兒染色體異常的一項敏感性指標(biāo)。CMA已作為產(chǎn)前診斷遺傳篩查的一線診斷技術(shù)，在超聲檢測出NT異常時，染色體異常的被檢出率，CMA較常規(guī)核型分析明顯增高，但CMA技術(shù)可否作為產(chǎn)前診斷的一線檢測方法目前尚不明確，在應(yīng)用中特別要重視對臨床意義不明的基因CNV的解釋和遺傳咨詢。本文將對CMA技術(shù)在胎兒NT增厚中的應(yīng)用、優(yōu)勢和面臨的挑戰(zhàn)等作一個詳細(xì)的綜述。

[關(guān)鍵詞] 頸項透明層增厚;染色體微陣列分析技術(shù);產(chǎn)前診斷

[中圖分類號] R714.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）06（b）-0045-05

Application of chromosome microarray analysis in thickening of transparent layer of fetal neck

DING Xiaorui1? ?LIU Aiju2▲? ?YANG Xiaoyan2? ?ZHANG Junhui2

1.Graduate School， Inner Mongolia Medical University， Inner Mongolia Autonomous Region， Hohhot? ?010000， China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology， Inner Mongolia Maternal and Child Health Hospital， Inner Mongolia Autonomous Region， Hohhot? ?010000， China

[Abstract] Chromosomal microarray analysis （CMA） is a newly developed prenatal diagnosis technology， which has been widely used due to its huge advantages. Its advantages are Kb level resolution， high sensitivity and specificity， high degree of automation and high efficiency etc.， it can not only detect chromosome number and unbalanced structural abnormalities， but also detect copy number variation （CNV） caused by unbalanced rearrangement at the level of chromosomal sub microstructure. Therefore， it has gained favor in clinical detection， become the tool of clinical genetic routine diagnosis， and has been introduced into prenatal fetal genetic disease detection. The measurement of nuchal translucency （NT） has been widely used as one of the routine screening items in early pregnancy. Many studies have found that NT thickening is a sensitive index of fetal chromosomal abnormalities. CMA has been used as a first-line diagnostic technique for prenatal genetic screening. In the detection rate of chromosomal abnormalities when NT abnormality is detected by ultrasound， CMA is significantly higher than that of conventional karyotype analysis. However， it is not clear whether CMA can be used as a first-line detection method for prenatal diagnosis. In application， it is necessary to pay special attention to the explanation and inheritance of gene CNV of clinical significance consultation. In this paper， we will review the application， advantages and challenges of microarray analysis in the thickening of NT.

[Key words] Thickening of nuchal transparent; Chromosome microarray analysis technique; Prenatal diagnosis

隨著國家“二孩”政策的放開，孕婦年齡和環(huán)境因素的影響，新生兒的出生缺陷率也隨之增加。新生兒的出生缺陷主要是由染色體異常引起的，不但影響出生人口質(zhì)量，而且多數(shù)無法治愈。為了減少新生兒的先天缺陷導(dǎo)致的家庭和社會負(fù)擔(dān)，提高人口素質(zhì)，產(chǎn)前診斷也在以迅猛的速度發(fā)展。研究[1-2]表明，頸項透明層（nuchal translucency，NT）增厚不僅是21-三體綜合征的重要標(biāo)志，而且與其他染色體異常有關(guān)。因此，NT篩查已成為懷孕期間的常規(guī)檢查項目之一。核型分析G顯帶技術(shù)已應(yīng)用40年，曾經(jīng)一度被認(rèn)為是染色體異常診斷的“標(biāo)尺”，只有非整倍體染色體數(shù)和較大的結(jié)構(gòu)異常才能被檢測出來，缺點(diǎn)是無法發(fā)現(xiàn)較小片段的異常，例如拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV），并且G顯帶技術(shù)材料受限，染色體亞端粒區(qū)域診斷率較低，培養(yǎng)時間長等，使得其作為產(chǎn)前診斷一線檢查的地位受到挑戰(zhàn)。自2004年染色體微陣列分析技術(shù)（chromosomal microarray analysis，CMA）應(yīng)用于產(chǎn)前診斷以來，染色體檢出率顯著增高，逐漸得到廣泛應(yīng)用。近年來有許多學(xué)者[3-6]對NT增厚染色體正常的胎兒進(jìn)行CNVs分析，所獲得具有臨床意義的染色體微缺失/微重復(fù)檢出率為7.7%～8.3%。它可以確定異常片段的染色體核型的來源和性質(zhì)，有效診斷染色體核型分析無法識別的較小片段，如染色體微缺失和微重復(fù)，從而提高染色體異常的檢測成功率和診斷率。

1 NT的闡述

1.1 NT的定義

NT的厚度是指胎兒正中矢狀切面，頸椎水平皮膚與結(jié)締組織之間的半透明軟組織的液體積聚的厚度，這是胎兒發(fā)育中的一種特殊聲象圖[7]反應(yīng)在超聲圖上為胎兒頸部皮下組織中的無回聲帶。

1.2 NT增厚與胎兒染色體異常的關(guān)系

1.2.1 NT增厚與染色體核型異常的關(guān)系? 1990年，NT異常會導(dǎo)致出現(xiàn)21-三體綜合征被首次提出[8]。1992年Nicolaides等[9]選取827例病例進(jìn)行研究，首次提出胎兒早孕期NT增厚是預(yù)測染色體異常的一個重要指標(biāo)。Sun等[10]研究NT增厚與染色體異常的關(guān)系，118例病例中91.5%進(jìn)行了侵入性核型分析，其中20例染色體核型是異常的，檢出率為18.5%。Yang等[11]對296例NT增厚的病例進(jìn)行核型分析，顯示存在染色體異常的病例占19.9%。董媛等[12]研究的218例NT增厚的病例中，48例染色體異常，占總?cè)旧w異常的22.02%。劉偉明[13]研究156例NT增厚孕婦，檢出染色體異常27例，且隨著NT厚度的增加，核型異常發(fā)生率也增高。張春榮等[14]對61份NT增厚樣本研究，發(fā)現(xiàn)染色體異常11例，異常檢出率為18.0%。綜上表明，NT增厚與染色體核型異常有著明顯的關(guān)聯(lián)，可以作為產(chǎn)前診斷有創(chuàng)性篩查的依據(jù)。

1.2.2 NT增厚與染色體核型正常的關(guān)系? NT增厚，但染色體核型正常，胎兒出生缺陷的概率有多大呢？Bilardo等[15]回顧性總結(jié)，對于NT增厚但核型正常的胎兒，最終不良結(jié)果的發(fā)生率約是20%。侯莉等[16]研究NT增厚，419例胎兒行染色體核型分析，結(jié)果核型異常55例，核型正常的病例中出現(xiàn)自然流產(chǎn)或胚胎停育15例。事實上，染色體核型正常但發(fā)生不良結(jié)局的NT增厚胎兒的基因組可能發(fā)生了微小的不平衡畸變，其中微缺失和微重復(fù)是最常見的類型[17]。傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)尚不能解決此問題，是臨床咨詢中的難點(diǎn)。因此，需要更加精細(xì)及準(zhǔn)確的基因技術(shù)，來解決此類問題。

2 CMA技術(shù)

CMA技術(shù)又名“分子核型分析”，分為基于微陣列的比較基因組雜交aCGH技術(shù)和單核苷酸多態(tài)性SNP技術(shù)。aCGH芯片可以追蹤定位DNA拷貝數(shù)量變化及其在基因組的位置。SNP芯片能檢測出單親二倍體與三倍體，對SNP基因型進(jìn)行分析，提高染色體改變在亞顯微層面上的分辨率和覆蓋率。因此結(jié)合二者，使其優(yōu)勢最大程度地發(fā)揮，檢測出更多有意義的臨床病例。

2.1 CMA的優(yōu)勢及缺點(diǎn)

更快和更早發(fā)現(xiàn)胎兒缺陷是產(chǎn)科領(lǐng)域的關(guān)注重點(diǎn)。當(dāng)常規(guī)檢查檢測到可疑陽性體征時，需要醫(yī)院提供更精確的檢測。常用的染色體檢測有染色體核型分析、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、CMA等。最經(jīng)典的方法是傳統(tǒng)的染色體G顯帶核型分析技術(shù)，其最主要的缺點(diǎn)是不能發(fā)現(xiàn)基因組CNVs。而FISH用于單細(xì)胞分析，一次只能對幾個或者一個候選位點(diǎn)進(jìn)行檢測，而且不能檢測雜合子缺失（LOH）/單親二倍體（UPD）。FISH的最大缺陷在于檢測依賴探針，缺乏覆蓋全基因篩查的能力。近年來研究表明，針對染色體的拷貝數(shù)變異，CMA技術(shù)能對其進(jìn)行精準(zhǔn)檢測。CMA有如下優(yōu)勢：分辨率更高，在核型分析中，大部分被研究出來的微缺失/微重復(fù)綜合征病變范圍為1.5～3.5 Mb，而CMA能夠發(fā)現(xiàn)0.1～0.3 Mb范圍的微缺失/微重復(fù)病變，廣泛應(yīng)用于腫瘤、遺傳性疾病及產(chǎn)前診斷等多個領(lǐng)域[18-19];直觀準(zhǔn)確性，明確追蹤定位DNA拷貝數(shù)量變化及其在基因組的位置;不需要細(xì)胞培養(yǎng)，可直接檢測血液、羊水和絨毛膜絨毛樣本;出報告速度更快，結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，并且實驗的流程經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處置，結(jié)果應(yīng)用軟件系統(tǒng)分析，取代了主觀判斷，降低了人為誤差[20-21];利用高密度的單核苷酸芯片檢測基因組基因的多態(tài)性，鑒定LOH和UPD的分析;結(jié)合全基因擴(kuò)增技術(shù)，可以進(jìn)行胚胎全染色體組的檢測。但是，CMA也存在一定的缺點(diǎn)：不能檢測到染色體平衡性的結(jié)構(gòu)改變級異位，不能檢測點(diǎn)突變以上的多倍體等。最為關(guān)鍵的是，隨著CMA技術(shù)的日新月異，凸顯了我們認(rèn)識水平提高緩慢的缺陷，使得臨床意義不明拷貝數(shù)變異的出現(xiàn)，對結(jié)果的正確解讀及遺傳咨詢成為我們最嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[22]。

2.2 CMA在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

隨著臨床研究的發(fā)展，CMA應(yīng)用于產(chǎn)前診斷一直在進(jìn)行中，直至2009年，美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會首次提出把CMA技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)前診斷中，但附帶說明：傳統(tǒng)的常規(guī)核型分析作為主要細(xì)胞遺傳學(xué)工具，CMA不能替代。2010年，CMA首次被細(xì)胞遺傳學(xué)確認(rèn)為檢測先天性畸形或發(fā)育異?；颊呷旧w突變的臨床診斷試驗[23]。2013年美國公布：如果超聲檢測發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常，建議直接進(jìn)行CMA檢測，取代傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)[24]。緊隨其后，我國在2014、2016年發(fā)布了CMA應(yīng)用于產(chǎn)前診斷及兒科遺傳疾病的臨床應(yīng)用[25-26]。這些指南的發(fā)布，提供了CMA在中國產(chǎn)前診斷中的指導(dǎo)方針及臨床地位。

2.3 CMA在NT增厚中的研究

早在2009年Law等[27]應(yīng)用CMA技術(shù)在1例NT增厚但核型正常胎兒中檢出16p13.11微缺失，考慮該微缺失可能會導(dǎo)致自閉癥或智力發(fā)育遲緩。2011年Leung等[28]對NT增厚但核型正常的48例胎兒進(jìn)行基于芯片的比較基因組雜交技術(shù)（aCGH）分析，4例證實為致病性CNVs。得出結(jié)論，在NT增厚且染色體核型分析正常的病例中應(yīng)用CMA技術(shù)可以額外檢出更多的致病性CNVs。王敏等[29]利用染色體微陣列聯(lián)合核型分析對NT增厚胎兒的研究中，51例標(biāo)本用SNP檢測，染色體異常有20例，其中染色體核型異常11例，得出NT異常的胎兒。采用染色體核型+染色體微陣列檢測，對檢測染色體微缺失微重復(fù)，具有重要的產(chǎn)前診斷意義。李志華[30]在其研究中表明隨著NT的增厚，CNV拷貝數(shù)變異發(fā)生率明顯升高，用aCGH技術(shù)可以明顯提高NT增厚胎兒的染色體異常檢出率。薛淑雅等[31]通過染色體微陣列CMA分析374例NT增厚病例，265例（70.9%）CMA結(jié)果正常，109例（29.1%）CMA結(jié)果顯示染色體異常，其中69例為常染色體數(shù)目異常，17例為性染色體數(shù)目異常，23例為拷貝數(shù)異常。由此可見，CMA技術(shù)在NT增厚的應(yīng)用中，可以更多地檢出有臨床意義的致病性疾病，在產(chǎn)前診斷學(xué)科中具有重要可行性意義。

但是，也有一些學(xué)者提出相反的觀點(diǎn)。Schou等[32]聯(lián)合高分辨比較基因組雜交（HR-CGH）技術(shù)和多重連接依賴探針擴(kuò)增（MLPA）技術(shù)對100例早孕期NT增厚但核型正常的胎兒進(jìn)行分析，結(jié)果未能檢出致病性CNVs。因此認(rèn)為NT增厚但核型正常胎兒中，HR-CGH和MLPA不能額外檢出致病性CNVs。Scott等[33]對90例NT增厚胎兒進(jìn)行分析研究，結(jié)果在41例核型正常的胎兒中僅發(fā)現(xiàn)1例致病性CNVs。因此認(rèn)為NT增厚與致病性CNVs無關(guān)。Huang等[34]對早孕期NT增厚但核型正常的215例活產(chǎn)病例進(jìn)行分析，其中199例未見任何其他異常，結(jié)果僅在3例中檢出CNVs，且最終均考慮為臨床意義不明的染色體拷貝數(shù)變異（VOUS）。未檢出任何致病性CNVs，認(rèn)為NT增厚可能與致病性CNVs無關(guān)，與傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)比較，aCGH并不能額外提高疾病檢出率。

2.4 CMA結(jié)果的解讀

2011年美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會發(fā)布了CNV解釋指南，建議采用5級報告系統(tǒng)，即致病性的、可能致病性的、不確定的、可能良性的或良性的。這5級報告系統(tǒng)中數(shù)據(jù)庫的不完善，給遺傳咨詢帶來相當(dāng)大的挑戰(zhàn)，督促我們盡快提高認(rèn)知水平，緩解認(rèn)知與CMA技術(shù)快速發(fā)展形成的矛盾，推動CMA的發(fā)展。

總之，近30年的研究表明，“NT增厚”已被確定為胎兒結(jié)構(gòu)異常的非特異性標(biāo)志物，NT厚度與胎兒畸形的發(fā)生有直接關(guān)系。CMA是目前檢測CNV和多態(tài)性的最佳技術(shù)。結(jié)合NT增厚，CMA可以檢測到更多的染色體異常。但是CMA是否可以用于NT增厚、染色體異常的侵入性檢測，以及作為產(chǎn)前診斷的一線檢測，從2005年研究至今，只能認(rèn)為CMA對微缺失/微重復(fù)的檢出率有重要意義，可以作為產(chǎn)前診斷的標(biāo)準(zhǔn)檢測，而不能得出結(jié)論作為一線檢測。這就需要我們進(jìn)行更大樣本、更多中心、更長時間的研究來確保其在產(chǎn)前診斷中的地位。盡管CMA存在不足，如缺失或擴(kuò)增的確切位置不能完全確定、低水平嵌合體的檢出率及最受爭議的VOUS的臨床意義不確定性等使其在產(chǎn)前診斷中面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。但不能否認(rèn)，CMA對微缺失/微重復(fù)的檢出率，提高疾病的臨床診斷，提供新的診斷檢測方法。隨著我們對數(shù)據(jù)庫的不斷完善，對CMA結(jié)果的認(rèn)知提高，逐漸發(fā)揮CMA的優(yōu)勢，使其成為臨床一線檢測手段，造福于社會。

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