CD8+T淋巴細胞表面抑制性受體NKG2A高表達在肺腺癌組織中的臨床研究

馬名揚　原翔　劉怡文　孫江濤

[摘要] 目的 分析CD8+T淋巴細胞表面抑制性受體NKG2A表達與肺腺癌患者臨床病理特征及5年生存期的相關性，并探討其臨床意義及預后價值。 方法 選擇2014年1月～2015年3月河南科技大學第一附屬醫(yī)院手術切除的130例表皮生長因子受體（EGFR）為陽性的肺腺癌患者癌組織及相應癌旁肺組織石蠟包埋標本為研究對象，采用免疫組織化學方法檢測其組織中浸潤的CD8+T淋巴細胞表面NKG2A蛋白表達情況，并分析NKG2A的表達與肺腺癌患者臨床病理特征及5年生存期的相關性;采用Cox回歸法分析各因素對預后的影響;采用Kaplan-Meier法分析NKG2A蛋白高表達與生存時間之間相關性。 結果 肺腺癌及相應癌旁肺組織中浸潤的CD8+T淋巴細胞胞膜均可見NKG2A蛋白表達，在肺腺癌組織中，中、低分化NKG2A免疫組化評分高于高分化，且低分化高于中分化（P < 0.05）。NKG2A蛋白高表達與肺腺癌患者的分化程度、淋巴結轉移、臨床分期及5年生存情況具有相關性（P < 0.05）。NKG2A蛋白高表達為影響肺腺癌患者預后的獨立危險因素。且NKG2A蛋白高表達患者的5年生存率及中位生存時間均明顯低于低表達，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。 結論 CD8+T淋巴細胞表面抑制性受體NKG2A高表達，可能通過削弱其抗腫瘤免疫，促進了肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。抑制NKG2A表達可能為肺腺癌的免疫治療提供新的思路和有效治療手段。

[關鍵詞] 肺腺癌;CD8+T淋巴細胞;自然殺傷細胞表面抑制性受體A;預后

[中圖分類號] R734.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）06（c）-0015-05

[Abstract] Objective To analyze the correlation between expression of CD8+T cell surface inhibitory receptor NKG2A and clinicopathological characteristics and 5-year survival in patients with lung adenocarcinoma， and to explore its clinical significance and prognostic value. Methods From January 2014 to March 2015， 130 cases of lung adenocarcinoma with epidermal growth factor receptor （EGFR） （+） were resected in the First Affiliated Hospital of He′nan University of Science and Technology， and the paraffin-embedded samples of the carcinema tissues and adjacent lung tissues of patients with lung adenocarcinoma were selected as the research objects， immunohistochemistry was used to detect the expression of NKG2A protein on the surface of infiltrated CD8+T lymphocytes， and the correlation between NKG2A expression and clinicopathological characteristics and 5-year survival in patients with lung adenocarcinoma was analyzed. The influence of each factor on prognosis was analyzed by Cox regression method. The correlation between NKG2A protein expression and survival time was analyzed by Kaplan-Meier method. Results The expression of NKG2A protein was observed in the membrane of infiltrated CD8+T lymphocytes in lung adenocarcinoma and corresponding adjacent lung tissues， in lung adenocarcinoma tissues， the immunohistochemical score of NKG2A was higher than that of high differentiation and low differentiation than that of medium differentiation （P < 0.05）. High expression of NKG2A protein was associated with differentiation， lymph node metastasis， clinical stage and 5-year survival in patients with lung adenocarcinoma （P < 0.05）. The degree of differentiation， lymph node metastasis， clinical stage and high expression of NKG2A protein were independent risk factors for the prognosis of patients with lung adenocarcinoma. Moreover， the 5-year survival rate and median survival time of patients with high NKG2A protein expression were significantly lower than those with low expression， with statistically significant differences （P < 0.05）. Conclusion The high expression of the inhibitory receptor NKG2A on the surface of CD8+T lymphocytes may promote the development of lung adenocarcinoma by weakening its anti-tumor immunity. Inhibition of NKG2A expression may provide a new idea and an effective treatment for lung adenocarcinoma.

[Key words] Lung adenocarcinoma; CD8+T lymphocytes; NKG2A; Prognosis

肺癌已成為世界發(fā)病率增幅最大的癌癥之一，且在相當長的時間內(nèi)，它將穩(wěn)居癌癥死亡原因之首位[1]，主要分為兩大組織學類型，小細胞肺癌與非小細胞肺癌。肺腺癌為非小細胞肺癌的重要組織學亞型，早期多表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)疾病的一般癥狀，如咳嗽、低熱、胸痛等，易被忽略，確診時多發(fā)展至晚期，預后極差[2]。隨著醫(yī)學研究的不斷發(fā)展、進步，靶向治療逐漸成為一種新的治療方式。前期研究大都集中在癌細胞自身，有關腫瘤微環(huán)境的作用則探討不多。實際上，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤微環(huán)境密切相關[3-4]。

腫瘤微環(huán)境是腫瘤細胞賴以生長的特殊環(huán)境，研究顯示腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境之間的互相作用可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且對免疫細胞抑制性受體表達進行調(diào)節(jié)，導致腫瘤的免疫逃逸[4]。著名的NKG2A屬于C型（鈣依賴型）凝集素超家族的Ⅱ型糖蛋白，基因定位于人12號染色體短臂，胞內(nèi)段含有2個ITIM，因而具有抑制功能，傳遞負反應信號。相關研究[5-6]表明，特異CD8+T淋巴細胞表面都會表達NKG2A等抑制性受體，從而削弱其抗腫瘤免疫，增加腫瘤微環(huán)境免疫抑制狀態(tài)，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本研究通過免疫組織化學方法檢測肺腺癌患者癌組織及相應癌旁肺組織中浸潤的CD8+T淋巴細胞NKG2A蛋白表達情況，并分析其高表達與肺腺癌患者臨床病理特征及5年生存期之間相關性，發(fā)現(xiàn)NKG2A蛋白高表達與肺腺癌的惡性進展之間存在相關性，抑制NKG2A蛋白的表達可以作為靶向治療的一個新途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年1月～2015年3月河南科技大學第一附屬醫(yī)院手術切除的表皮生長因了受體（EGFR）為陽性的肺腺癌患者癌組織及相應癌旁肺組織石蠟包埋標本為觀察對象，納入標準：①治療性肺腺癌切除術后，同時具備癌組織及相應癌旁肺組織（距癌組織邊緣> 5 cm）;②術前均未接受免疫治療及放、化療;③術后病理診斷為肺腺癌;④隨訪時間為5年。共納入組織標本130例，其中男73例，女57例;年齡≤60歲57例，年齡>60歲73例;高、中及低分化分別有34、70及26例;有淋巴結轉移51例，無淋巴結轉移79例;臨床分期Ⅰ～Ⅱ期75例，Ⅲ～Ⅳ期55例。本研究經(jīng)河南科技大學第一附屬醫(yī)院及河南科技大學腫瘤研究所醫(yī)學倫理委員會審核批準，并于術前獲得患者書面知情同意。

1.2 試劑與儀器

免疫組織化學試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，SP-9000）;磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、檸檬酸抗原修復液與二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑（北京索萊寶生物技術有限公司，P1010、C1010與DA1010）;CD8兔多克隆抗體（美國abcam公司，ab4055）與NKG2A兔多克隆抗體（美國abcam公司，ab96319）。光學顯微鏡（日本尼康公司，E100+ISH500）。

1.3 免疫組織化學法檢測組織中浸潤的CD8+T淋巴細胞表面抑制性受體NKG2A蛋白的表達

每例患者癌組織及相應癌旁肺組織各取兩張石蠟包埋標本連續(xù)切片，片厚2 μm;常規(guī)溶蠟脫蠟，梯度乙醇水化（體積分數(shù)100%、90%、80%與70%）;檸檬酸抗原修復15 min;PBS沖洗;過氧化物酶阻斷劑封閉20 min;PBS沖洗;山羊血清封閉30 min;于兩張連續(xù)切片上分別加入CD8+T淋巴細胞抗體與NKG2A抗體（PBS稀釋比1∶200）各50 μL，4℃孵育過夜;PBS沖洗;山羊抗鼠/兔聚合物室溫下孵育20 min;PBS沖洗;鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶室溫封閉15 min;PBS沖洗;DAB顯色10 min;蒸餾水終止顯色;蘇木精復染10 min;梯度乙醇脫水（體積分數(shù)70%、80%、90%與100%）;二甲苯透明;封片;使用光學顯微鏡觀察兩張連續(xù)切片中同一位置CD8+T淋巴細胞與NKG2A蛋白的表達，以兩張連續(xù)切片同一位置細胞膜出現(xiàn)淺黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達，隨機取5個高倍鏡視野（400×）評分均值為最終免疫組織化學評分（評分細則見參考文獻[7]）。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。各因素對預后的影響采用Cox回歸分析;生存曲線繪制采用Kaplan-Meier法;生存時間之間差異分析采用Log-rank檢驗（生存時間為入院時間至最后一次隨訪日期或死亡），以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌及癌旁肺組織中CD8+T淋巴細胞表面抑制性受體NKG2A蛋白的表達

肺腺癌及癌旁肺組織中均可見間質(zhì)淋巴細胞胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒，為浸潤的CD8+T淋巴細胞（圖1A、C、E、G），在右側連續(xù)切片中可見同一位置淋巴細胞胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒，為CD8+T淋巴細胞NKG2A蛋白表達陽性（圖1B、D、F、H）。高、中、低分化肺腺癌組織CD8+T淋巴細胞表面抑制性受體NKG2A蛋白免疫組織化學評分中、低分化評分高分化，且低分化高于中分化（P < 0.05）。見圖1（封三）、表1。

2.2 肺腺癌患者CD8+T淋巴細胞表面抑制性受體NKG2A蛋白表達與其臨床病理特征相關性

CD8+T淋巴細胞表面抑制性受體NKG2A蛋白高表達與肺腺癌患者的分化程度、淋巴結轉移、臨床分期及5年生存情況具有相關性（P < 0.05）。見表2。

2.3 肺腺癌患者預后影響因素的Cox回歸分析

以生存和死亡作為因變量，NKG2A蛋白表達為自變量（陽性=1，陰性=0），結果顯示CD8+T淋巴細胞表面抑制性受體NKG2A蛋白表達陽性為影響肺腺癌患者預后的獨立危險因素（β = 0.85，Wald = 7.78，HR = 2.35，95%CI：1.29～4.28，P < 0.05）。

2.4 CD8+T淋巴細胞NKG2A蛋白表達與肺腺癌患者5年生存預后相關性

130例肺腺癌患者中CD8+T淋巴細胞NKG2A蛋白表達陽性者的5年生存率及中位生存時間均明顯低于表達陰性者，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表3、圖2～3。

3 討論

肺腺癌是一種臨床上較為常見的惡性腫瘤，雖然目前已有手術、放療、化療等治療手段，但治療效果仍不理想。因此，尋找與肺腺癌惡性進展密切相關的因素，為治療提供可能的新靶點意義重大[8]。鮮有關于腫瘤微環(huán)境作用的相關報道。腫瘤的發(fā)生和轉移與腫瘤細胞所處的內(nèi)外環(huán)境密切相關[9-13]。研究表明腫瘤細胞與宿主之間的相互作用是腫瘤生長與存活的起始選擇壓力，這種相互作用可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3，14-16]。同時腫瘤細胞對免疫細胞抑制性受體表達的調(diào)節(jié)，是腫瘤削弱宿主微環(huán)境中免疫細胞殺傷力、誘導免疫耐受甚至功能耗竭，最終導致腫瘤免疫逃逸的重要機制[17-19]。

本研究顯示肺腺癌組織中CD8+T淋巴細胞表面抑制性受體NKG2A蛋白表達顯著升高，提示腫瘤組織中可聚集大量不具備殺傷能力的CD8+T淋巴細胞，從而增加腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)。且NKG2A蛋白表達隨分化程度降低而逐漸升高，提示隨著腫瘤惡性程度的增加，NKG2A蛋白表達逐漸升高;同時淋巴結有轉移患者及臨床分期為Ⅲ/Ⅳ期患者的NKG2A蛋白表達顯著增高，提示NKG2A蛋白高表達與肺腺癌的惡性進展密切相關。本研究還顯示NKG2A蛋白表達陽性者的5年生存率及中位生存時間均顯著低于表達陰性者，提示NKG2A蛋白可作為免疫治療的新靶點，有效抑制其表達可能延長肺腺癌患者的生存期。

綜上所述，在肺腺癌中，NKG2A通過負性調(diào)控CD8+T淋巴細胞活性，從而增加腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，抑制NKG2A可能是肺腺癌免疫治療的潛在靶點之一，在肺腺癌的臨床治療方面具有十分重要的科學理論意義和廣泛的應用前景。

[參考文獻]

[1]? 李媛秋，劉劍君，么鴻雁.肺癌發(fā)病和死亡流行情況與人類發(fā)展指數(shù)的關系分析[J].中國腫瘤，2019，28（9）：646-650.

[2]? Kichenadasse G，Miners JO，Mangoni AA，et al. Association Between Body Mass Index and Overall Survival With Immune Checkpoint Inhibitor Therapy for Advanced Non-Small Cell Lung Cancer [J]. JAMA Oncol，2019，124：248-261.

[3]? Phuengkham H，Ren L，Shin IW，et al. Nanoengineered immune niches for reprogramming the immunosuppressive tumor microenvironment and enhancing cancer immunotherapy [J]. Adv Mater，2019，31（34）：1803322.

[4]? Liu Z，Han C，Dong C，et al. Hypofractionated EGFR tyrosine kinase inhibitor limits tumor relapse through triggering innate and adaptive immunity [J]. Sci Immunol，2019， 4（38）：53-59.

[5]? Su S，Zhao J，Xing Y，et al. Immune Checkpoint Inhibition Overcomes ADCP-Induced Immunosuppression by Macrophages [J]. Cell，2018，175（2）：442-457.

[6]? Yao M，Ventura PB，Jiang Y，et al. Astrocytic trans-Differentiation Completes a Multicellular Paracrine Feedback Loop Required for Medulloblastoma Tumor Growth [J]. Cell，2020，180（3）：502-520.

[7]? 楊成軒，賈良，孫艷霞，等.共刺激因子B7同源體4在肺腺癌組織中的表達及臨床意義[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，2019， 36（9）：833-836.

[8]? Shi P，Oh YT，Deng L，et al. Overcoming acquired resistance to AZD9291，a third-generation EGFR inhibitor，through modulation of MEK/ERK dependent Bim and Mcl-1 degradation [J]. Clin Cancer Res，2017，23（21）：6567-6579.

[9]? 潘雅娜，王雪，羅清.腫瘤微環(huán)境影響腫瘤多藥耐藥的研究進展[J].重慶醫(yī)學，2018，47（4）：555-558.

[10]? Vivien Béziat，Hervier B，Achour A，et al. Human NKG2A overrides NKG2C effector functions to prevent autoreactivity of NK cells [J]. Blood，2011，117（16）：4394-4396.

[11]? Fausther-Bovendo，Wauquier N，Cherfils-Vicini J，et al. NKG2C is a major triggering receptor involved in the V[delta]1 T cell-mediatedcytotoxicity against HIV-infected CD4 T cells [J]. AIDS，2008，22（2）：217-226.

[12]? Gooden M，Lampen M，Jordanova ES，et al. HLA-E expression by gynecological cancers restrains tumor-infiltrating CD8+T lymphocytes [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（26）：10656-10661.

[13]? Wesch D，Kabelitz D. Differential expression of natural killer receptors on Vdelta1 gammadelta T cells in HIV-1-infected individuals [J]. J Acquir Immune Defic Syndr，2003，33（2）：420-425.

[14]? Handgretinger R，Schilbach K. The potential role of γδ T cells after allogeneic HCT for leukemia [J]. Blood，2018， 131（10）：1063-1072.

[15]? Zumwalde NA，Sharma A，Xu X，et al. Adoptively transferred Vγ9Vδ2 T cells show potent antitumor effects in a preclinical B cell lymphomagenesis model [J]. JCI Insight，2017，2（13）：11-72.

[16]? Qaqish A，Huang D，Chen CY，et al. Mycobacterium tuberculosis Adoptive Transfer of Phosphoantigen-Specific γδ T Cell Subset Attenuates Infection in Nonhuman Primates [J]. J Immunol，2017，198（12）：4753-4763.

[17]? Qin GM，Ao H，Zhang G，et al. Type 1 responses of human Vγ9Vδ2 T cells to influenza A viruses [J]. J Infect Dis，2011，85 （19）：10109-10116.

[18]? Tu W，Zheng J，Liu Y，et al. The aminobisphosphonate pa-midronate controls influenza pathogenesis by expanding a gammadelta T cell population in humanized mice [J]. J Exp Med，2011，208（7）：1511-1522.

[19]? Wang T，Welte T. Role of Natural Killer and Gamma-Delta T cells in West Nile Virus Infection [J]. Viruses，2013，5（9）：2298-2310.

（收稿日期：2020-03-09? 本文編輯：封? ?華）