四川寶興圈養(yǎng)綠尾虹雉的人工孵化技術(shù)研究

張敬，馬紅，安俊輝，李非平，李淑紅，鄧江宇，張成林，侯蓉，John Corder

(1.北京動(dòng)物園圈養(yǎng)野生動(dòng)物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100044；2.四川寶興蜂桶寨國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，四川寶興625700；3.成都大熊貓繁育研究基地，成都610081；4.世界雉類協(xié)會(huì)，英國(guó)諾森伯蘭郡NE47 8DL)

綠尾虹雉Lophophoruslhuysii屬雞形目Galliformes雉科Phasianidae虹雉屬，為我國(guó)特有高山雉類，分布于甘肅東南部、西藏東北部、青海東南部、云南西北部和四川；終年生活于林線以上，多見于海拔3 500～4 200 m的高山草甸、灌叢和裸巖地帶，尤其偏好多陡崖和巖石的高山灌叢和灌叢草甸(盧汰春，1991)。世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)瀕危物種紅色名錄將綠尾虹雉列為易危(VU)物種，瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約(CITES)將其列入附錄Ⅰ；綠尾虹雉被列為我國(guó)國(guó)家Ⅰ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，被《中國(guó)脊椎動(dòng)物紅色名錄》評(píng)估為瀕危(EN)物種(蔣志剛等，2016)。遷地保護(hù)方面，1955年綠尾虹雉最早在北京動(dòng)物園圈養(yǎng)展出并逐漸開始繁殖(李福來，1989)，隨后的幾十年間國(guó)內(nèi)外研究人員相繼在人工繁育技術(shù)、繁殖行為和疾病的預(yù)防治療等方面開展了一些研究(Rimlinger &Witman，1986；Kuehler &Lieberman，1989；程彩云等，1993，1996；陶玉靜，陳輝，1999)。由于綠尾虹雉的高原特性，多年來在遷地保護(hù)過程中面臨著諸多難點(diǎn)，2014年后，除四川寶興維持一個(gè)小規(guī)模人工種群外，其他地區(qū)的圈養(yǎng)個(gè)體相繼死亡(張敬等，2019a)。因此，有必要繼續(xù)加強(qiáng)綠尾虹雉人工繁育的研究，為將來開展遷地保護(hù)提供條件。

四川寶興蜂桶寨綠尾虹雉保護(hù)研究中心(簡(jiǎn)稱研究中心)成立于1992年，2017年有11只個(gè)體，由于孵化設(shè)備和技術(shù)的限制，卵的孵化率一直較低(張敬等，2019a)。2018—2019年進(jìn)行了綠尾虹雉卵人工孵化研究，探索卵的最佳孵化方案并積累經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 種鳥及飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用卵來自研究中心圈養(yǎng)的4組種鳥，由2004年野外個(gè)體及其后代組成。飼養(yǎng)方式：非繁殖期，1只雄鳥與1～3只雌鳥同籠飼養(yǎng)；繁殖期，1雌 1雄配對(duì)后同籠單獨(dú)飼養(yǎng)。產(chǎn)卵后將卵撿出，進(jìn)行人工孵化和育雛。飼養(yǎng)籠舍長(zhǎng)10.0 m×寬3.5 m×高2.8 m。每日喂食2次，飼料有：雞蛋、面包蟲、白菜、折耳根、西紅柿、洋蔥、大蒜、玉米、商品顆粒飼料，繁殖期前補(bǔ)充鈣質(zhì)。

1.2 研究方法

我國(guó)動(dòng)物園鳥卵人工孵化始于20世紀(jì)60年代，孵化溫度主要采用家禽孵化中“看胎施溫”的方法控制，用測(cè)量卵的水分散失率和氣室大小調(diào)節(jié)孵化濕度(李福來，1989；張敬等，2017)。對(duì)多種鳥卵孵化的實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)鳥卵在孵化過程中水分散失，會(huì)減少初始重量的12%～15%，如果通過稱量卵失重的方法來監(jiān)測(cè)孵化，增加或減少孵化機(jī)內(nèi)部濕度，將這個(gè)損失控制在個(gè)別物種的要求范圍內(nèi)，卵成功孵化的可能性將會(huì)大大提高(Harvey，1993；Brown &Robbins，2002；張敬等，2019b)。人工孵化時(shí)使用2臺(tái)或多臺(tái)孵化機(jī)，在不同的濕度下運(yùn)行，根據(jù)卵的質(zhì)量曲線讀數(shù)將卵轉(zhuǎn)移到不同濕度孵化機(jī)中孵化。這種技術(shù)被應(yīng)用在鸚鵡、雉類、企鵝和走禽類的人工孵化中，都取得了理想的效果(Brown &Robbins，2002；張敬等，2019b)。因此，本研究采用不同濕度孵化綠尾虹雉卵，旨在探索不同濕度對(duì)卵孵化結(jié)果的影響，同時(shí)尋找綠尾虹雉成功孵化的最佳卵失重范圍。

1.3 卵的收集、保存和入孵前的準(zhǔn)備

研究期間一共收集了37枚卵進(jìn)行人工孵化，其中僅有17枚受精卵，其中，2018年8枚，2019年9枚。對(duì)卵進(jìn)行編號(hào)、測(cè)量，保存在17～21 ℃、相對(duì)濕度50%～60%的室內(nèi)，垂直放置在已消毒的蛋托盤上，保存時(shí)間不超過24 h。卵的入孵在每天13∶00。入孵前對(duì)卵表面進(jìn)行清潔，清潔后的卵放入事先調(diào)試好的預(yù)熱箱中預(yù)熱2～3 h，預(yù)熱箱30～35 ℃，相對(duì)濕度50%，然后轉(zhuǎn)入孵化機(jī)內(nèi)孵化。

1.4 孵化設(shè)備和方法

孵化設(shè)備有孵化機(jī)、出雛機(jī)(8015 Compact MP GTFS 84型，Grumbach)、預(yù)熱機(jī)(8104 BSS MP GTFS 160型，Grumbach)、電子天平(精確度0.000 1 g)、除濕機(jī)(MD-150E，美菱)。

孵化機(jī)分別命名為主孵化機(jī)、1號(hào)和2號(hào)孵化機(jī)。孵化溫度均設(shè)定為37.5 ℃；孵化濕度分別設(shè)定為：主孵化機(jī)50%～55%，1號(hào)和2號(hào)孵化機(jī)分別為30%和80%。卵側(cè)放在蛋架上，自動(dòng)翻卵設(shè)置為：每2 h 1次，每次30 min，翻動(dòng)180°。5枚卵孵化失敗，因此將12枚卵分為2組，梯度濕度組的6枚卵先放在主孵化機(jī)中孵化，在孵化過程中以15%卵失重率計(jì)算值和曲線作為標(biāo)準(zhǔn)，比較每天卵的質(zhì)量變化，用主孵化機(jī)、1號(hào)和2號(hào)孵化機(jī)孵化：在每次稱量卵質(zhì)量后計(jì)算出卵的實(shí)際質(zhì)量損失，如果卵每日質(zhì)量損失大于15%失重率理論計(jì)算值，就將卵轉(zhuǎn)移到2號(hào)孵化機(jī)中，若實(shí)際質(zhì)量損失小于理論計(jì)算值，則將卵轉(zhuǎn)移到1號(hào)孵化機(jī)中，當(dāng)實(shí)際質(zhì)量損失趨于或與理論計(jì)算值相符，則移回或仍在主孵化機(jī)中繼續(xù)孵化；均衡濕度組的6枚卵一直在主孵化機(jī)中孵化。

孵化期間，每日13∶00稱量卵質(zhì)量。孵化7 d后使用照蛋器驗(yàn)卵，每2 d 1次，肉眼觀察并記錄胚胎發(fā)育情況。稱量和驗(yàn)卵過程一般不超過 1 min。晾卵隨每天稱重或驗(yàn)卵進(jìn)行，時(shí)間一般為5～10 min。卵孵化26 d左右，胚胎喙進(jìn)入氣室后，卵被轉(zhuǎn)入出雛機(jī)中直到雛鳥出殼，出雛機(jī)溫度設(shè)定為36.5 ℃，濕度70%～80%。原則上胚胎啄殼48 h 后不能自行出殼時(shí)進(jìn)行人工輔助出殼。

1.5 數(shù)據(jù)采集和分析

孵化過程中采集和記錄：卵指數(shù)(長(zhǎng)徑、短徑、卵質(zhì)量)、開始孵化日期、出殼日期、啄殼時(shí)間、是否進(jìn)行人工輔助出殼等，并記錄每次驗(yàn)卵情況。使用Excel 2013對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和分析，繪制卵失重曲線；采用配對(duì)樣本的t檢驗(yàn)對(duì)梯度濕度組和均衡濕度組卵的胚胎的啄殼時(shí)間、卵孵化期、卵的失重率和初始雛重?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析；用一元線性回歸進(jìn)行 2組卵失重率與初始雛重之間的相關(guān)性分析，以及卵平均質(zhì)量與孵化天數(shù)之間的相關(guān)性分析。所有數(shù)據(jù)均在SPSS中進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 卵質(zhì)量比較

卵呈卵圓形，卵殼呈暗棕黃色或土黃色，具有大小不同的紫褐色斑點(diǎn)。將37枚卵的卵指數(shù)與前人研究(李福來等，1985；Kuehler &Lieberman，1989；程彩云等，1993；陶玉靜，陳輝，1999)、野外記錄(盧汰春等，1986；Heetal.，1988)進(jìn)行了比較(表1)，其中有3枚卵由于破損，缺少數(shù)據(jù)。

表1 不同圈養(yǎng)單位和野外綠尾虹雉卵指數(shù)對(duì)比Table 1 Comparison of the egg index of Lophophorus lhuysii in captivity and wild

2.2 孵化數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

17枚受精卵中有5枚卵孵化失敗，卵的孵化率為70.6%。12只雛鳥3個(gè)月內(nèi)的成活率為100%。12枚卵的啄殼時(shí)間最早出現(xiàn)在第26.1天，最晚為第28.3天，平均為(27.4±0.6) d。雛鳥從啄殼到完全出殼的時(shí)間最短為36.5 h，最長(zhǎng)為58.5 h，平均為(48.7±6.8) h。孵化期最短為28.1 d，最長(zhǎng)為30.2 d，平均為(29.5±0.6) d；自然出殼的有4枚，自然出殼率為33%；失重率最小為10.7%，最大為17.6%，平均為14.0%±2.0%(表2，圖1)。

圖1 12枚圈養(yǎng)綠尾虹雉卵的質(zhì)量曲線Fig.1 Mass curve of 12 eggs of Lophophorus lhuysii during incubation

孵化期間，卵質(zhì)量(y)與孵化天數(shù)(x)呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系：y=-0.414 8x+82.882 0(r2=0.999 6，P<0.01)(圖2)。

2.3 不同濕度對(duì)孵化的影響

梯度濕度組和均衡濕度組在胚胎啄殼時(shí)間和卵孵化期的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在卵的失重率(P=0.034)和初始雛重(P=0.015)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。卵失重率與初始雛重之間存在極顯著負(fù)相關(guān)性關(guān)系(r=-0.797，P=0.002)。

2.4 胚胎發(fā)育過程概述

通過驗(yàn)卵對(duì)12枚卵的胚胎發(fā)育進(jìn)行觀察和記錄。參照家雞卵胚胎發(fā)育特征描述(鐘兆紅，羅明玉，2011)，不同時(shí)期綠尾虹雉卵胚胎發(fā)育特征概括如下：

第1天：卵黃表面有1個(gè)顏色較深、周圍稍亮的圓點(diǎn)。

第7天：卵黃表面可見明顯的“蜘蛛狀血管”。

第8天：胚胎邊緣出現(xiàn)許多紅點(diǎn)。

第9天：卵黃囊血管區(qū)形狀似櫻桃。

第10天：卵黃囊血管區(qū)形狀像蚊子。

第11天：轉(zhuǎn)動(dòng)卵時(shí)卵黃不易跟隨轉(zhuǎn)動(dòng)，舌開始形成，機(jī)體的器官均形成。

第12天：可見黑色的眼點(diǎn)，可分辨出雌雄性腺，心臟完全形成。

第13天：胚胎形狀像“電話筒”，一端是頭部，一端是軀干部，可見胚胎有規(guī)律運(yùn)動(dòng)，喙和卵齒開始形成。

第14天：胚胎沉在羊水中。

第17天：尿囊血管在卵小頭合攏，除氣室外，整個(gè)卵都布滿了血管，胚胎腿上的鱗片和腳趾開始形成。

第24天：以小頭對(duì)準(zhǔn)光源，已看不到發(fā)亮的部分，肺血管形成，但無血液循環(huán)。

第25天：氣室向一側(cè)傾斜，胚胎眼睛開始睜開，轉(zhuǎn)身，喙朝向氣室。

第27～28天：卵黃囊全部被吸入腹腔內(nèi)，喙刺破殼膜，深入氣室內(nèi)，肺呼吸開始，隨后啄殼。

第29～30天：聽見叫聲，胚胎繞卵殼繼續(xù)啄殼1圈，雛鳥破殼而出。

3 討論

3.1 卵失重范圍

在卵孵化開始設(shè)定濕度時(shí)，如果不確定，可以從相對(duì)濕度55%開始(Brown &Robbins，2002；張敬等，2019b)。對(duì)于一些雉類卵來說，從孵化開始到胚胎喙進(jìn)入氣室之前這段時(shí)間，可以維持這個(gè)濕度；但對(duì)于一些特定物種或特殊卵，如厚殼卵或卵殼孔隙度低的卵，要達(dá)到理想的卵失重率，實(shí)際孵化時(shí)采用的濕度可能會(huì)有很大差異(Brown &Robbins，2002；張敬等，2019b)。在人工孵化時(shí)應(yīng)該為特定物種或某些特殊卵殼的卵提供不同的孵化濕度，以保證卵達(dá)到理想的失重率。通過查閱文獻(xiàn)，本研究為綠尾虹雉卵提供了高低不同的梯度式孵化濕度，在一定范圍內(nèi)對(duì)卵的失重進(jìn)行了控制，2018—2019年成功孵化的12枚卵的平均卵失重率為14.0%。綜上所述，綠尾虹雉卵在人工孵化時(shí)可保持卵失重率在10%～15%，使失重趨近于12%。

3.2 不同孵化方法對(duì)雛鳥出殼時(shí)間的影響

梯度濕度組和均衡濕度組的差異性分析結(jié)果顯示，綠尾虹雉卵失重率越小，雛鳥初生質(zhì)量越大，這必定影響出殼期間胚胎在卵殼內(nèi)的旋轉(zhuǎn)和破殼的進(jìn)程，從而對(duì)雛鳥的出殼時(shí)間產(chǎn)生較大影響，但在孵化末期，卵殼內(nèi)胚胎的喙頂破卵胎膜進(jìn)入氣室的時(shí)間較難觀察記錄，雛鳥完全出殼的時(shí)間也有可能記錄不夠精確，而影響最后的分析結(jié)果，所以本研究沒有涉及2組的出殼時(shí)間的差異性分析，這有待在今后的孵化試驗(yàn)中進(jìn)行比較和驗(yàn)證。

致謝：世界雉類協(xié)會(huì)專家Richard Edgell、David Rimlinger、Laurent Fontaine、Alain Hennache和Bernard Giboin；北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張正旺、王鵬程為項(xiàng)目的研究、方法和數(shù)據(jù)分析提供了幫助；四川寶興蜂桶寨國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局楊玉君、左琳為項(xiàng)目開展提供了支持，侯艷、陳黎參與了項(xiàng)目工作；北京大興瀕危動(dòng)物馴養(yǎng)繁殖中心程彩云、陶玉靜，北京動(dòng)物園孟彤提供了孵化技術(shù)經(jīng)驗(yàn)；北京動(dòng)物園重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室賈婷、由玉巖為項(xiàng)目提供了幫助，謹(jǐn)此一并致謝。