紫薯花色苷提取及穩(wěn)定性研究

趙國瑜，田亞萍，巫 丹，周崇銀，李 晗，范方宇

（西南林業(yè)大學生命科學學院，云南 昆明 650224）

紫薯（Ipomoea batatasL.）屬旋花科一年生草本植物，薯肉呈紫色至深紫色，根莖含豐富的花色苷[1-2]。紫薯花色苷是一種水溶性天然花青素類紅色素[3]，花色苷具有較強的抗腫瘤、抗氧化、降血脂、降血壓、保護肝臟、延緩人體衰老等生理活性功能[4]，是理想的天然食用色素。目前，研究者開展了相關紫薯花色苷提取及穩(wěn)定性的研究，如王玲等[5]對紫薯色素的pH、溫度、光照進行了穩(wěn)定性研究；孫欣等[6]研究了pH 和溫度對紫薯花色苷穩(wěn)定性的影響；石雙妮等[7]對紫薯花色苷熱穩(wěn)定性進行了研究。研究表明，紫薯花色苷在加工與儲藏過程中色澤和性質會發(fā)生變化和破壞，因此花色苷穩(wěn)定性的研究可為最大限度地保護紫薯花色苷提供參考[8-9]。目前對紫薯花色苷穩(wěn)定性研究中，一般從pH、溫度、光等這幾方面考慮，但色素加工與使用過程復雜，如氧化還原劑、金屬離子、常用食品添加劑等也對其穩(wěn)定性有重要影響。

基于此，以紫薯粉為原料，酸醇為提取劑，研究紫薯花色苷的最佳提取工藝，并對紫薯花色苷粗提液在光、溫度、pH、氧化劑/還原劑、食品添加劑和金屬離子中的穩(wěn)定性展開研究，為紫薯花色苷的提取與利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

紫薯：購于云南昆明農貿市場。

檸檬酸、氯化鈉（食品級）由云南鹽化股份有限公司提供；碳酸氫鈉（食品級）由云南云鐘工貿有限公司提供；山梨酸鉀（食品級）由寧波王龍科技股份有限公司提供；D-異抗壞血酸鈉（食品級）由江西省德興市百勤異VC 鈉有限公司提供；鹽酸、95%乙醇、冰醋酸、氫氧化鈉（分析純）、氯化鎂、三氯化鋁、三氯化鐵、30%過氧化氫、亞硫酸氫鈉（分析純）由天津市風船化學試劑科技有限公司提供；氯化鉀、氯化鈣（分析純）由提供廣東省化學試劑工程技術研究開發(fā)中心提供；氯化鋅（分析純）由天津市致遠化學試劑有限公司提供。

1.1.2 儀器與設備

DT-1 型電子天平，DZKW-D-V 型電子恒溫水浴鍋，DHG-9240A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，UV-2600型紫外可見分光光度計，A10 型多功能臺式高速冷凍離心機。

1.2 方法

1.2.1 紫薯預處理

紫薯清洗去皮，切厚度約2 mm 的薄片，50 ℃干燥36 h。粉碎，過80 目篩，取篩下樣品，4 ℃密封保存。

1.2.2 紫薯花色苷提取

紫薯粉→浸提→離心（5 500 r/min，20 min）→取上清液→花色苷粗提液

1.2.3 提取劑與最大吸收波長選擇

分別將質量濃度0.3%檸檬酸、0.3%鹽酸、0.3%冰醋酸、蒸餾水按照體積比1∶1 加入到95%乙醇中制成4 種提取劑。稱取一定質量紫薯粉，以提取時間30 min，提取溫度 50 ℃，料液比 1∶5（g/mL），分別在配制的四種提取劑中提取，確定最佳提取劑。花色苷粗提液用相應提取劑稀釋，200～700 nm 分析花色苷吸光值，確定最大吸收波長，根據朗伯-比爾定律A=K×C×L(K 消光系數，C為色素濃度，L 比色皿光程），隨著色素濃度增加吸光度增大，因此在此波長下吸光值與提取率呈正相關，吸光值可反映提取率的高低[10]。參考文獻[11-15]，以吸光值為考察指標，通過比較吸光值大小考察其對紫薯花色苷提取率的影響。

式中：A329為 329 nm 處吸光值；V為提取液體積（mL）；n為稀釋倍數；98.2 為消光系數；m為樣品質量（g）。

1.2.4 紫薯花色苷提取的單因素試驗設計

將花色苷粗提液使用相應提取劑稀釋，在最大吸收波長處測定吸光值，并以吸光值為指標，考察酸醇比、提取溫度、提取時間、料液比對花色苷提取效果的影響。所有試驗均進行三次，結果取平均值。

1.2.4.1 酸醇比篩選

以提取溫度50 ℃，提取時間30 min，料液比1∶5（g/mL），考察酸醇比 2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4（V/V）對提取效果的影響。

1.2.4.2 提取溫度篩選

確定酸醇比 1∶1（V/V），提取時間 30 min，料液比1∶5（g/mL），考察提取溫度 30、40、50、60、70 ℃對提取效果的影響。

1.2.4.3 提取時間篩選

確定酸醇比 1∶1（V/V），提取溫度 50 ℃，料液比1∶5（g/mL），考察提取時間 6、12、18、24、30 min 對提取效果的影響。

1.2.4.4 料液比篩選

確定酸醇比 1∶1（V/V），提取溫度 50 ℃，提取時間30 min，考察料液比 1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5（g/mL）對提取效果的影響。

1.2.5 正交試驗設計

在單因素試驗結果基礎上，以酸醇比、提取溫度、提取時間、料液比為主要影響因素，以吸光值為考察指標進行L9（34）正交試驗，優(yōu)化紫薯花色苷提取條件，正交試驗因素水平見表1。

表1 L（934）正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of L（934）orthogonal test

1.2.6 紫薯花色苷的穩(wěn)定性研究

1.2.6.1 光照對紫薯花色苷穩(wěn)定性的影響

取100 mL 容量瓶，加入0.4 mL 粗提液，稀釋定容至100 mL，搖勻后密封。分別于光照和避光環(huán)境下靜置5 d，每隔1 d 觀察溶液顏色變化并在329 nm 處測定吸光值。

1.2.6.2 溫度對紫薯花色苷穩(wěn)定性的影響

取2 mL 粗提液于1 L 容量瓶中稀釋定容。取100 mL 容量瓶，各加入5 mL 稀釋溶液，分別于20、30、40、50、60、70、80、90 ℃水浴鍋中靜置 30 min，觀察溶液顏色變化并在329 nm 處測定吸光值。

1.2.6.3 pH 對紫薯花色苷穩(wěn)定性的影響

取50 mL 小燒杯，加入8 mL 粗提液，調節(jié)pH 為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，吸取 1 mL 溶液于比色管中，稀釋定容，避光靜置30 min，觀察溶液顏色變化并在329 nm 處測定吸光值。

1.2.6.4 食品添加劑對紫薯花色苷穩(wěn)定性的影響

取1 mL 粗提液于500 mL 容量瓶中稀釋定容。取20 mL 稀釋后花色苷液于錐形瓶中，分別加入2 mL濃度為3%的氯化鈉、檸檬酸、山梨酸鉀、碳酸氫鈉、D-異抗壞血酸鈉，等量蒸餾水作空白，避光靜置1 d，觀察溶液顏色變化并在329 nm 處測定吸光值。

1.2.6.5 氧化劑/還原劑對紫薯花色苷穩(wěn)定性的影響

配制 1%、2%、3%、4%H2O2溶液 20 mL，分別吸取7 mL 于50 mL 錐形瓶中，再加入3 mL 粗提液，等量蒸餾水作空白，避光靜置1.5 h，每隔30 min 振蕩一次，觀察溶液顏色變化并在329 nm 處測定吸光值。

分別稱取 0.2、0.4、0.6、0.8 g NaHSO3溶于 20 mL蒸餾水中，各取7 mL 于50 mL 錐形瓶中，再加入3 mL粗提液，等量蒸餾水作空白，避光靜置1.5 h，每隔30 min 振蕩一次，觀察溶液顏色變化并在329 nm 處測定吸光值。

1.2.6.6 金屬離子對紫薯花色苷穩(wěn)定性的影響

取粗提液1 mL 于50 mL 容量瓶中，分別用濃度0.01、0.02、0.03 mol/L 的 Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Al3+、Fe3+金屬溶液定容，等量蒸餾水作空白，避光靜置1 h，觀察溶液顏色變化并在329 nm 處測定吸光值。

1.2.7 數據處理

采用Excel 軟件統(tǒng)計處理數據，Origin 軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 最佳提取劑及最大特征吸收波長的確定

由圖1 可見，0.3%檸檬酸-乙醇和0.3%鹽酸-乙醇波長掃描圖幾乎重合且峰值最大，47.5%乙醇水溶液峰值次之，0.3%冰醋酸-乙醇峰值最小。表明酸化乙醇提取率高于乙醇水溶液，原因為酸破壞了紫薯細胞壁，使其中花色苷充分釋放并與乙醇最大限度混合，在二者的相互作用下，花色苷提取率達到最高。冰醋酸易溶于乙醇，混合后酸性減弱，破壞細胞壁能力減弱，提取率不如0.3%檸檬酸-乙醇和0.3%鹽酸-乙醇，而47.5%乙醇水溶液中水分較多，色素溶解性較差，會損失較大一部分花色苷。因此，適宜的提取劑為0.3%檸檬酸-乙醇和0.3%鹽酸-乙醇。由于本試驗提取的色素主要用于食品工業(yè)，而檸檬酸為常用的酸性食品添加劑，因此選取0.3%檸檬酸-乙醇溶液作為提取劑較好。紫薯花色苷在紫外光區(qū)275～290 nm、可見光區(qū)465～530 nm 處均有有最大吸收波長。紫薯花色苷可分為兩類：矢車菊素和芍藥素，這兩類組分糖基上的羥基與一個或幾個分子的羥基肉桂酸衍生物和脂肪酸通過酯基形成?；幕ㄉ誟16]，從而形成了紫薯花色苷。與其他非?；烊簧叵啾龋鲜砘ㄉ辗€(wěn)定性更強。花色苷發(fā)生?；?，300～340 nm 范圍內的紫外光波段也會產生特征吸收峰。由圖1 可見，紫薯花色苷在329 nm 處有特征吸收峰，發(fā)生?；諒姸茸畲?。這與王和才等[17]的研究結果相似。因此，本試驗選擇最大吸收波長為329 nm 進行花色苷測定。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 酸醇比對花色苷吸光值的影響

由圖2 可見，紫薯花色苷吸光值隨乙醇含量的增加呈先上升后下降的趨勢，吸光值在酸醇比為1∶1（V/V）時出現最大值，為 1.396。當酸醇比為 2∶1（V/V）時，檸檬酸-乙醇溶液中檸檬酸濃度偏高，一定程度上破壞了花色苷結構；而酸醇比為 1∶1（V/V）時，檸檬酸-乙醇溶液為花色苷提供了一個維持穩(wěn)定的pH 環(huán)境，同時乙醇經酸化處理后，使花色苷與金屬離子間的絡合鍵、多糖和蛋白質的離子鍵以及本身所含的氫鍵發(fā)生斷裂，促進花色苷溶出，吸光值增加。另一方面，隨著乙醇濃度逐漸增加，溶液環(huán)境逐漸變?yōu)橹行?，外界環(huán)境影響花色苷的溶解，并且在花色苷溶出的過程中，一些醇溶性雜質、親脂性強的成分也隨之溶出減弱花色苷與提取劑的結合能力，導致吸光值降低[12]。因此在正交試驗中，選擇酸醇比 2∶1、1∶1、1∶2（V/V）較為適宜。

2.2.2 提取溫度對花色苷吸光值的影響

由圖3 可見，紫薯花色苷吸光值隨著提取溫度的升高逐漸增大，提取溫度由40 ℃升至50 ℃，吸光值增大了0.137；提取溫度50 ℃時吸光值為1.396，超過此溫度后吸光值的增長趨勢逐漸平緩，相比50 ℃，70 ℃下的吸光值僅增大0.031。在提取溫度升高的過程中，紫薯花色苷溶出速度加快，吸光值隨之快速增加。根據分子運動學說，隨著溫度的不斷升高，分子熱運動加快，在滲透、擴散、溶解上的速度也加快，更易轉移到溶劑中[13]；提取溫度超過50 ℃，熱運動趨于平穩(wěn)，且較高溫度下花色苷的穩(wěn)定性低，易發(fā)生降解。因此，正交試驗中，提取溫度選擇50、60、70 ℃比較適宜。

2.2.3 提取時間對花色苷色素吸光值的影響

由圖4 可見，不同提取時間得到的紫薯花色苷吸光值的變化呈現不同的趨勢。提取時間為6～12 min，吸光值隨時間的延長逐漸升高。提取12 min 時，得到的花色苷吸光值最大，為1.409；提取時間為12～30 min，隨提取時間的延長吸光值變化平緩，這表明提取時間過長對花色苷吸光值的增加沒有顯著影響。因此，為防止長時間提取可能會導致對花色苷的破壞，同時從節(jié)約時間、提高試驗效率和最大程度保護花色苷角度考慮，選擇適宜提取時間為9、12、15 min。

2.2.4 料液比對花色苷吸光值的影響

由圖5 可見，隨著料液比的增加，紫薯花色苷提取量逐漸增加。當料液比由1∶1.5（g/mL）增加到1∶3 時，花色苷提取量顯著增加。結果表明，在一定范圍內增加提取劑的用量，有利于色素的溶出[14]。與 1∶2（g/mL）的溶液相比，料液比 1∶1.5（g/mL）過于濃稠和渾濁；當料液比大于1∶3 時，花色苷提取量增加緩慢，表明在料液比1∶3（g/mL）時已足夠提取紫薯中花色苷。為降低紫薯花色苷提取成本和提高效率，同時又能較大程度地將色素提取出來，選擇適宜料液比為 1∶2、1∶2.5、1∶3（g/mL）。

2.3 正交試驗結果

根據單因素試驗結果，確定稀釋體積相同的情況下，以吸光值為評價指標，酸醇比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、料液比（D）四個因素進行正交試驗優(yōu)化工藝參數。

由表2 可見，影響紫薯花色苷吸光值各因素的主次順序為：料液比（D）＞酸醇比（A）＞提取時間（C）＞提取溫度（B）；花色苷提取的最佳工藝為A3B3C2D1，即酸醇比 1∶2（V/V），提取溫度 70 ℃，提取時間 12 min，料液比 1∶2（g/mL），此時吸光值最高，為 3.026。

表2 正交試驗結果Table 2 Result of orthogonal experiments

2.4 花色苷穩(wěn)定性研究結果

2.4.1 光照

由圖6 可見，光照和避光條件下的紫薯花色苷均出現了不同程度的降解?；ㄉ赵诠庹諚l件下，吸光值的變化較大，5 d 后吸光值由1.235 降到0.582，降低了52.9%，花色苷溶液顏色變淺且渾濁；而在避光條件下，5 d 后吸光值由1.235 降到0.924，降低了25.2%，花色苷溶液顏色無明顯變化且清澈。造成這種現象的原因為：一方面，光照強度加大使得紫薯花色苷2、4 位的C 原子活性增大，從而易受親水攻擊發(fā)生反應，花色苷容易出現酰基脫落的情況，加速花色苷降解，花色苷出現褪色現象[5,15]；另一方面，光照可以引起花色苷降解生成查爾酮,查爾酮快速降解成苯甲酸及2,4,6-三羥基苯甲醛等產物，且花色苷屬于類黃酮化合物，其含有不飽和鍵，因此可能在光照射下易降解損失致使穩(wěn)定性降低[18]。試驗結果表明，光照降低了紫薯花色苷的穩(wěn)定性。因此，應當避光儲藏以保持花色苷的顏色及穩(wěn)定性。

2.4.2 溫度

由圖7 可見，低于50 ℃時，隨溫度的升高，紫薯花色苷吸光值增加，提取液顏色均為玫紅色；50 ℃時，花色苷吸光值達到最大，為0.050；高于50 ℃后，花色苷吸光值下降，提取液顏色變?yōu)榈凵＝Y果表明，紫薯花色苷在20～50 ℃穩(wěn)定，可以耐受一般食品加工的熱處理過程。紫薯花色苷在60～90 ℃進行提取時，隨著溫度的升高，提取率增加。色素有部分在高溫下可能被降解，但提取過程中色素不斷溶出，提取率大于降解率，所以只考慮提取溫度下的提取率。而在溫度穩(wěn)定性的研究中，色素是定量的，隨加溫度增加，花色苷發(fā)生熱降解，所以吸光值變化大，花色苷結構向查爾酮結構轉化，導致顏色褪色，穩(wěn)定性降低[7,19]。結果表明，花色苷的耐熱性差。因此，在儲存、加工時要注意溫度的控制，不宜用長時間的高溫食品加工。

2.4.3 pH

由圖8 可見，當pH 為1～5，溶液由酸性向弱酸性轉變，吸光值隨之增加，最大值為0.622，顏色由鮮紅色變?yōu)樯钭仙?，花色苷化學結構隨著pH 的變化也相應發(fā)生改變[20]，在此區(qū)間，主要以紅色的吡喃型陽離子結構存在。pH 為6～7 時，溶液由弱酸性向中性轉變，吸光值下降，花色苷主要以無色的查爾酮結構存在，溶液的顏色由紫色變?yōu)樽纤{色。pH 為7～10 時，溶液由弱堿性向堿性轉變，顏色變化較大，從紫藍色→深藍色→深綠色→深灰色，在這個過程中花色苷主要以藍色醌型結構存在；藍色的醌型結構不穩(wěn)定，會脫去質子形成共振穩(wěn)定的醌型陰離子[6]。結果表明，花色苷在偏酸性介質中較為穩(wěn)定，在偏堿性介質中極不穩(wěn)定，同時pH 對花色苷呈色效果也有影響。食品加工的pH 多在3～5 范圍內，故該色素可作為食品著色劑，也適宜作為酸性食品的添加劑。

2.4.4 食品添加劑

如圖9 所示，檸檬酸、山梨酸鉀、D-異抗壞血酸鈉、氯化鈉加入溶液后吸光值增加，其中D-異抗壞血酸鈉吸光值最高，為0.587；顏色分別呈現淡粉色、粉色、淡紫色、淡藍色。加入碳酸氫鈉后，顏色呈現綠色且吸光值下降。原因為檸檬酸、山梨酸鉀和D-異抗壞血酸鈉呈弱酸性，氯化鈉呈中性，花色苷色素在酸性至中性條件中較穩(wěn)定，且具有一定的增色效果；而碳酸氫鈉呈弱堿性，花色苷色素在弱堿性至堿性條件中極不穩(wěn)定[21]，且褪色明顯。因此花色苷與食品添加劑共存時，D-異抗壞血酸鈉穩(wěn)定性最好，檸檬酸、氯化鈉、山梨酸鉀次之，碳酸氫鈉最差，說明該色素可作為食品、飲料加工過程中的增色劑。

2.4.5 氧化劑/還原劑

如圖10 所示，隨著H2O2濃度逐漸增加，色素吸光值平緩下降。因為花色苷屬于多酚物質，氧化劑與花色苷色素的酚羥基發(fā)生反應導致花色苷降解，且氧化劑H2O2易使紫薯花色苷色素褪色；隨著H2O2濃度的增加，色素顏色逐漸由深紅色變?yōu)槊导t色、橘色、乳黃色。低濃度還原劑NaHSO3對紫薯花色苷色素穩(wěn)定性影響較?。划擭aHSO3濃度超過2.0%時，色素吸光值急劇下降，發(fā)生了明顯的褪色現象，顏色由深紅色變?yōu)辄S色、乳白色。這是因為酸性環(huán)境下，HSO3-與花色苷反應生成無色復合鹽，影響穩(wěn)定性[22]。結果表明，紫薯花色苷色素有一定的耐還原能力，而耐氧化能力較弱。

2.4.6 不同濃度的金屬離子溶液

如圖11 所示，隨著金屬離子Na+、K+濃度的增加，紫薯花色苷的吸光值和顏色均無明顯變化，呈淡紫色，說明其對花色苷的穩(wěn)定性無影響。Mg2+、Ca2+離子濃度逐漸增加，花色苷吸光值呈上升趨勢，并有增色效應。Zn2+、Fe3+離子濃度逐漸增加，花色苷吸光值增加，但低于對照樣品，且色素溶液顏色變化較大，分別為灰色和棕黃色，具有一定褪色作用。這表明Zn2+、Fe3+離子對于花色苷穩(wěn)定性的影響較大，應避免紫薯花色苷與這兩種離子混合。Al3+的加入使紫薯花色苷的吸光值低于對照樣品，但隨著濃度的增加，花色苷吸光值增加且顏色加深為紫色，原因是金屬離子與花色苷中的官能團或取代基發(fā)生絡合反應，形成較為穩(wěn)定的絡合物，因而起增色或褪色的作用[23]。結果表明，加工和儲藏紫薯花色苷時應盡量避免與金屬離子Mg2+、Ca2+、Zn2+、Fe3+、Al3+及其器皿接觸，但可在含Mg2+、Ca2+、Al3+的食品中作為增色劑。

3 結論與討論

（1）紫薯花色苷提取最佳工藝參數為：酸醇比為1∶2（V/V）、提取溫度 70 ℃、提取時間 12 min、料液比為1∶2（g/mL）。此條件下色素提取液吸光值達到最佳值，為 3.026。

（2）紫薯花色苷在溫度50 ℃以下較穩(wěn)定，可以耐受一般食品飲料的熱處理；對光敏感，應避光儲藏；在偏酸性介質中較為穩(wěn)定，在堿性介質中極不穩(wěn)定；食品添加劑對于穩(wěn)定性影響不大；色素對H2O2有一定的耐受性且強于還原劑NaHSO3；金屬離子Na+、K+、Ca2+對色素溶液的穩(wěn)定性無明顯影響，Mg2+、Ca2+、Al3+具有增色作用，但不宜與含有Fe3+、Zn2+的物質共存。