中草藥復(fù)配液在臍橙保鮮中的應(yīng)用研究

盧 山 ，楊 坤 ，黃 超，占 晨，黃長(zhǎng)干,*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，功能材料與農(nóng)業(yè)應(yīng)用化學(xué)研究所，江西 南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校友辦，江西 南昌 330045）

臍橙屬蕓香科柑橘屬植物，果實(shí)色澤鮮艷光滑、品質(zhì)優(yōu)良，是世界各國(guó)競(jìng)相栽培的柑橘良種，因富含大量對(duì)人體有益的必需元素及功效成分深受人們喜愛[1]。在我國(guó)的江西、湖北、重慶等省市都有廣泛種植。而江西的贛南地區(qū)已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)臍橙的主要產(chǎn)地，每年都有大量的臍橙銷往各地[2]。臍橙易在采摘、貯藏到加工銷售等環(huán)節(jié)中受機(jī)械損傷，加劇了呼吸作用和代謝反應(yīng)，引發(fā)一系列生理生化變化[3]，從而造成病原微生物侵染產(chǎn)生病害，其中又以意大利青霉和指狀青霉引起的青霉病和綠霉病為最主要的病害[4]。因此，如何對(duì)采后臍橙進(jìn)行抑菌保鮮，減少損失成為亟需解決的重大問題。目前，果農(nóng)主要使用化學(xué)合成殺菌劑如抑霉唑、噻菌靈及苯并咪唑來控制青霉病與綠霉病[5]，但長(zhǎng)期使用化學(xué)合成殺菌劑，易危害人體健康，也易污染環(huán)境和提高病原菌的耐藥性[6]。因此，研發(fā)廣譜、高效、低毒的天然防腐保鮮劑，便成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)之一[7]。

中草藥提取物的成分復(fù)雜多樣，可生物降解、無污染，而且中草藥資源豐富、安全無毒、價(jià)格低廉，有較好的抑菌殺菌作用，因此愈發(fā)受到國(guó)內(nèi)外科研人員的重視和青睞，為研發(fā)植物源保鮮劑奠定了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)[8]，同時(shí)催生了許多對(duì)中草藥提取物的研究，如丁香精油能顯著抑制意大利青霉和指狀青霉的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)[9-10]，石榴皮提取物對(duì)意大利青霉菌的抑制效果與化學(xué)殺菌劑抑霉唑無顯著性差異[11]，埃塞俄比亞植物Withania somnifera和Acaciaseyal的甲醇提取物對(duì)“巴倫西亞”柑橘的防腐保鮮效果與化學(xué)合成殺菌劑噻苯達(dá)唑無顯著性差異[12]。課題組以指狀青霉和意大利青霉為靶標(biāo)菌種，根據(jù)前期篩選結(jié)果得知：肉桂、丁香、細(xì)辛、丹皮、五倍子五種中藥的提取液對(duì)指狀青霉和意大利青霉的抑制作用最為顯著[13]，并且肉桂提取液具有最強(qiáng)的抑菌活性[14]。因此，本試驗(yàn)對(duì)這五種提取液中的三種提取液進(jìn)行1∶1∶1 的比例復(fù)配研究，選出最佳復(fù)配液，考察其穩(wěn)定性及其在采后臍橙中的保鮮效果，為復(fù)配液的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

供試菌種：指狀青霉（Penicillium digitatum，菌種編號(hào)為ACCC30389）、意大利青霉（Penicilliumitalicum，菌種編號(hào)為ACCC 30399），均購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心。

肉桂、丁香、細(xì)辛、丹皮、五倍子，均購(gòu)于樟樹市華豐藥業(yè)有限公司；臍橙摘自江西安遠(yuǎn)金贛豐果園。

試劑：丙酮、鹽酸、氫氧化鈉、蒽酮、2,6-二氯酚靛酚、TW-80、滅菌水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

AUY220 型電子天平，UV755B 型紫外分光光度計(jì)，日本YAMATO 高溫滅菌鍋，TS-111C 型恒溫培養(yǎng)搖床，TG20 型高速冷凍離心機(jī)，HH-1 型恒溫水浴鍋，F(xiàn)orma-86C ULT Freezer 超低溫冰箱。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制備

取菌種接種于試管斜面培養(yǎng)基，在30 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)2～3 d 后，用無菌水將培養(yǎng)基中的菌種沖入裝有250 mL 無菌水的錐形瓶中，搖勻，制成孢子菌懸液，使菌液濃度達(dá)106/mL。

1.2.2 供試藥材提取液的制備

對(duì)于上述五種中草藥，在60 ℃下烘干，粉碎，過40 目篩，加入4 倍體積的丙酮，置于避光陰涼處，每隔24 h 振蕩提取一次，共3 次，搖床搖速為140 r/min，合并濾液后，減壓濃縮，用丙酮定容至濃度為1 g/mL。

1.2.3 最佳復(fù)配液的篩選

1.2.3.1 復(fù)配提取物的抑菌活性測(cè)定

對(duì)肉桂、丁香、細(xì)辛、丹皮、五倍子的提取液任取三種以1∶1∶1 的比例進(jìn)行復(fù)配，各植物提取液濃度均為1 g/mL，一共10 組復(fù)配組合，即CM-1（肉桂、丁香、細(xì)辛）、CM-2（肉桂、丁香、丹皮）、CM-3（肉桂、丁香、五倍子）、CM-4（肉桂、細(xì)辛、丹皮）、CM-5（肉桂、細(xì)辛、五倍子）、CM-6（肉桂、丹皮、五倍子）、CM-7（丁香、細(xì)辛、丹皮）、CM-8（丁香、細(xì)辛、五倍子）、CM-9（丁香、丹皮、五倍子）、CM-10（細(xì)辛、丹皮、五倍子）。采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定復(fù)配液對(duì)供試病原菌的抑制作用，把制好的菌液，吸取5 mL 混入冷卻至60 ℃左右查氏培養(yǎng)基，制備帶毒培養(yǎng)基。對(duì)稱放置無菌牛津杯，分別于牛津杯中加入200 μL 生藥濃度為1 000 mg/mL的植物提取液，用丙酮作為溶劑對(duì)照，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24～72 h，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈的大小[15]。以不加入復(fù)配液的帶毒培養(yǎng)基為對(duì)照組，觀察抑菌效果，如果復(fù)配液能殺死或抑制培養(yǎng)皿中試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)，則在牛津杯周圍會(huì)出現(xiàn)一個(gè)無菌生長(zhǎng)的透明帶即抑菌圈，抑菌圈直徑越大，說明浸提液對(duì)此種試驗(yàn)菌的抑制效果越好。通過各組復(fù)配組合的抑菌效果對(duì)比，最終選出最佳復(fù)配組合。

1.2.3.2 復(fù)配液穩(wěn)定性的測(cè)定

以指狀青霉和意大利青霉分別作為供試菌。

（1）將肉桂提取液與最佳復(fù)配液分別在日光下放置 0、2、4、8、16、24、48、72 h，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

（2）將肉桂提取液與最佳復(fù)配液分別在-18、5、30、60、80、100 ℃下處理 1 h 和經(jīng)高溫濕熱滅菌（121 ℃）處理30 min 后以進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

（3）將肉桂提取液與最佳復(fù)配液的pH 值用HCl溶液或 NaOH 溶液調(diào)成 2、4、5、6、8、10 六個(gè)梯度，放置24 h 后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

（4）將在常溫25 ℃下保存的肉桂提取液以及最佳復(fù)配液，每5 d 進(jìn)行一次抑菌試驗(yàn)，記錄其抑菌活性的變化。

1.2.4 供試復(fù)配液的制備

將效果最好的復(fù)配液用0.2%的TW-80 乳化劑稀釋成100 mg/mL 的溶液，該濃度為課題組前期根據(jù)采用二倍稀釋法[16]測(cè)出的最小抑菌濃度。

1.2.5 最佳復(fù)配液在臍橙保鮮中的應(yīng)用

臍橙的保鮮處理需要選擇大小一致、無病蟲害、成熟度一致和無表面損傷的臍橙。用100 mg/mL 供試復(fù)配液浸泡30 s，對(duì)照組用清水浸泡30 s，自然晾干。用聚乙烯塑料薄膜袋（32 cm×45 cm，厚度 80 μm）扎口裝袋并分別裝入2 個(gè)塑料水果筐內(nèi)，先在10～11 ℃環(huán)境下貯藏3 d，再搬進(jìn)冷庫(kù)（溫度為6～7 ℃，相對(duì)濕度為85%）進(jìn)行低溫貯藏。定期測(cè)定各項(xiàng)生理生化指標(biāo)。

1.2.6 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.2.6.1 總糖含量

采用蒽酮比色法進(jìn)行測(cè)定[17]。

1.2.6.2 可滴定酸含量

采用酸堿滴定法測(cè)定[18]。

1.2.6.3 VC 含量

采用2,6-二氯酚靛酚法測(cè)定[17]。

1.2.6.4 失重率

1.2.6.5 腐爛率

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，采用軟件SPSS Statistic 25 進(jìn)行方差分析，采用軟件Excel 2010 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳復(fù)配液的篩選

根據(jù)課題組前期篩選已發(fā)表的肉桂提取液抑菌效果得知：肉桂提取液對(duì)指狀青霉和意大利青霉的抑菌圈直徑為39 mm 和38 mm[13]。從表1 中可看出，10組復(fù)配提取液與肉桂單提取液對(duì)指狀青霉顯現(xiàn)出不同程度的抑制效果，其中以CM-7（丁香、細(xì)辛、丹皮）復(fù)配提取液抑制作用最佳，復(fù)配液CM-7 對(duì)指狀青霉和意大利青霉的抑菌圈直徑分別為40.97 mm 和39.03 mm。CM-7 組與其他9 組復(fù)配液的抑菌效果相比，差異均顯著（P＜0.05）。將復(fù)配液CM-7（丁香、細(xì)辛、丹皮）組對(duì)指狀青霉及意大利青霉的抑菌效果與肉桂提取液對(duì)指狀青霉及意大利青霉的抑菌效果相比，CM-7 組效果更好且差異顯著（P＜0.05）。因此，從10 組復(fù)配液中篩選出最佳抑菌效果的復(fù)配液CM-7組比前期已發(fā)表的肉桂提取液抑菌效果更好，為最佳抑菌復(fù)配液。

表1 復(fù)配提取液的抑菌效果Table 1 Fungistasis effect of compound extract 單位：mm

2.2 復(fù)配液穩(wěn)定性研究

2.2.1 光照對(duì)CM-7 穩(wěn)定性的影響

由圖1 可知，隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，各組中藥提取液的抑菌效果逐漸下降。但在16 h 前，CM-7 復(fù)配液和肉桂提取液的抑菌效果下降趨勢(shì)基本一致。16 h以后，肉桂提取液的抑菌效果急劇下降，24 h 之后下降速率趨于平穩(wěn)，從對(duì)指狀青霉、意大利青霉抑菌圈直徑最大的39 mm 和38 mm 分別降為20 mm和23 mm；而CM-7 復(fù)配液抑菌效果的下降速率一直很平穩(wěn)且相對(duì)較高，從對(duì)指狀青霉、意大利青霉抑菌圈直徑最大的41 mm 和39 mm 分別降為31 mm 和32 mm。由此可知，光照時(shí)間在20 h 以上時(shí)，CM-7 對(duì)指狀青霉和意大利青霉的抑菌效果極顯著高于肉桂提取液（P＜0.01）。

2.2.2 溫度對(duì)CM-7 穩(wěn)定性的影響

由圖2 可知，CM-7 與肉桂提取液在30 ℃以下的抑菌效果是逐漸上升的，30 ℃時(shí)達(dá)到頂峰，但是肉桂提取液的穩(wěn)定性在30～60 ℃之間急劇下降，60 ℃之后下降速率趨于平穩(wěn)，而CM-7 在30 ℃之后的抑菌效果下降一直都很平穩(wěn)而且相對(duì)較高。溫度達(dá)30 ℃以上時(shí)，CM-7 對(duì)指狀青霉和意大利青霉的抑菌效果顯著高于肉桂提取液（P＜0.05）。

2.2.3 pH 對(duì)CM-7 穩(wěn)定性的影響

由圖3 可以得知，CM-7 與肉桂提取液的抑菌效果在pH 2～pH 5 是逐漸上升的，且都在pH 為5 時(shí)抑菌效果到達(dá)頂峰，隨著pH 的升高，CM-7 與肉桂提取液的抑菌效果以大致相同的速率下降。不論pH 如何變化，CM-7 對(duì)指狀青霉和意大利青霉的抑菌效果與肉桂提取液對(duì)指狀青霉和意大利青霉的抑菌效果相比，差異性未達(dá)顯著水平。由此可知，不同pH 對(duì)復(fù)配液與單提取液穩(wěn)定性的影響基本一致。

2.2.4 貯藏時(shí)間對(duì)CM-7 穩(wěn)定性的影響

由圖4 可知，在貯藏20 d 之前，肉桂提取液與CM-7 的抑菌效果大致穩(wěn)定且保持在較高的水平。但在20 d 之后，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，肉桂提取液對(duì)意大利青霉、指狀青霉的抑菌圈直徑最大的39 mm 和38 mm 分別降至24 mm 和20 mm；而CM-7 的抑菌效果略有下降，分別從對(duì)意大利青霉、指狀青霉抑菌圈直徑最大的41 mm 和39 mm 降至36 mm 和33 mm。在貯藏時(shí)間達(dá)25 d 以上時(shí)，CM-7 對(duì)指狀青霉和意大利青霉的抑菌效果顯著高于肉桂提取液（P＜0.05）。由此可知，貯藏時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)單提取液穩(wěn)定性的影響高于對(duì)CM-7 穩(wěn)定性的影響。

2.3 CM-7 在臍橙保鮮中的應(yīng)用

2.3.1 CM-7 對(duì)臍橙總糖含量的影響

由圖5 可知，在50 d 之前，對(duì)照組與CM-7 處理組的總糖含量隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而升高，且變化趨勢(shì)大致一致。但對(duì)照組臍橙總糖含量在50 d 時(shí)達(dá)到最大值，為15.86%，之后大幅度下降至90 d 時(shí)的11.59%；而CM-7 處理組則是繼續(xù)上升至60 d 時(shí)才達(dá)到峰值16.26%，之后小幅度下降至90 d 的14.73%。貯藏時(shí)間在50 d 以上時(shí)，CM-7 處理組臍橙總糖含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），這與陳東杰等[19]研究生物保鮮劑對(duì)櫻桃貯藏中總糖的影響相似。

2.3.2 CM-7 對(duì)臍橙可滴定酸含量的影響

由圖6 可知，對(duì)照組與CM-7 處理組果實(shí)中的可滴定酸一直隨時(shí)間變化而降低，但在70 d 之后對(duì)照組中可滴定酸的下降幅度變大，而復(fù)配液處理組的下降幅度基本保持不變，對(duì)照組中的可滴定酸含量由0.71%（初值）下降至 0.51%（貯藏 90 d）；CM-7 處理組則由0.71%（初值）下降至0.56%（貯藏90d）。隨貯藏時(shí)間的變化，CM-7 處理組臍橙可滴定酸含量與對(duì)照組相比差異不顯著。由此可見，CM-7 復(fù)配液對(duì)臍橙貯藏過程中可滴定酸的影響不大。

2.3.3 CM-7 對(duì)臍橙中VC 含量的影響

由圖7 可知，對(duì)照組與CM-7 處理組果實(shí)的VC含量在10 d 時(shí)達(dá)到最大值，分別為53.81 mg/100 g 和53.04 mg/100 g，之后兩組VC 含量都逐漸下降。但是在90 d 時(shí)，對(duì)照組中VC 含量降低至42.97 mg/100 g，而CM-7 處理組VC 含量降低至46.49 mg/100 g。貯藏時(shí)間達(dá)30 d 以上時(shí)，CM-7 處理組臍橙VC 含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.3.4 CM-7 對(duì)臍橙失重率的影響

由圖8 可知，前30 d 對(duì)照組和CM-7 處理組果實(shí)失重率逐漸上升且速率大致相同。但在30～40 d 之間，對(duì)照組的失重率急劇上升，40～90 d 之間，對(duì)照組失重率變化趨勢(shì)趨于平穩(wěn)，最終90 d 時(shí)失重率為5.22%；而CM-7 處理組失重率變化則始終相對(duì)平緩，到達(dá)90 d 時(shí)失重率為2.65%。貯藏時(shí)間30 d 后，CM-7 處理組臍橙失重率顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。由此可見，CM-7 復(fù)配液在臍橙貯藏過程中能減少果實(shí)的失重。

2.3.5 CM-7 對(duì)臍橙腐爛率的影響

由圖9 可知，在貯藏前20 d，對(duì)照組與CM-7 處理組均未出現(xiàn)腐爛個(gè)體。對(duì)照組在30 d 開始出現(xiàn)腐爛個(gè)體，而CM-7 處理組則在60 d 時(shí)出現(xiàn)腐爛個(gè)體。當(dāng)貯藏時(shí)間到達(dá)90 d 時(shí)，對(duì)照組的腐爛率高達(dá)15.56%，而CM-7 處理組則僅有6.67%，二者間差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。由此可見，貯藏時(shí)間越長(zhǎng)，CM-7 復(fù)配液越能大幅度延緩果實(shí)的腐爛。

3 結(jié)論

篩選試驗(yàn)表明，在由5 種中草藥提取液中的三種提取液以1∶1∶1 比例配成的 10 種復(fù)配液中，CM-7 復(fù)配液（丁香、細(xì)辛、丹皮）對(duì)指狀青霉以及意大利青霉的抑菌效果顯著高于其余9 組，與肉桂單提取液對(duì)指狀青霉和意大利青霉的抑菌效果相比也有顯著差異。而在長(zhǎng)時(shí)間光照（＞20 h）、高溫（＞30 ℃）或長(zhǎng)時(shí)間貯藏（＞20 d）條件下，CM-7 復(fù)配液的穩(wěn)定性都顯著強(qiáng)于肉桂單提取液，而pH 的變化對(duì)兩者的影響基本一致。

在貯藏中后期（40～90 d），CM-7 復(fù)配液可以明顯降低果實(shí)的腐爛率和失重率，保證果實(shí)的外觀；也能延緩果實(shí)總糖、可滴定酸和VC 含量的降低，能夠保持果實(shí)良好的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和風(fēng)味，延長(zhǎng)臍橙的貨架期和減少腐爛損失。而總糖、可滴定酸、VC 含量為衡量果實(shí)口感的重要因素[20-21]，因此CM-7 復(fù)配液能有效維持低溫貯藏期間臍橙的品質(zhì)。但本次試驗(yàn)只研究了復(fù)配液的穩(wěn)定性及其對(duì)采后臍橙的保鮮效果，未研究復(fù)配液發(fā)揮抑菌保鮮作用的主要成分；并且試驗(yàn)提取溶劑為丙酮，雖然以丙酮為溶劑，有著有溶解性好、對(duì)細(xì)胞穿透力強(qiáng)、成分提取徹底、大多數(shù)有效成分均能溶解等優(yōu)點(diǎn)，但是丙酮也具有毒性，因此選取替代丙酮的低毒溶劑以及復(fù)配液中抑菌保鮮的具體成分是什么還有待進(jìn)一步的研究。