重組酶聚合酶擴增技術(shù)檢測新型隱球菌DNA

劉曄華，穆紅，張堅磊，江雁，劉萍，王猛

天津市第一中心醫(yī)院，天津300192

新型隱球菌是一種條件致病菌，存在于土壤、鴿糞等環(huán)境中，主要感染免疫力低下人群，感染后可侵犯患者皮膚、肺部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導致嚴重的肺部感染和腦膜炎[1]。隱球菌感染是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)性真菌感染，可發(fā)生在任何年齡組，免疫抑制或免疫缺陷患者易急性起病[2～5]，形成該菌的體內(nèi)播散性感染，致死率很高。因此，新型隱球菌快速診斷和及時治療對預(yù)后至關(guān)重要。目前臨床常用的新型隱球菌檢測方法為病原體培養(yǎng)法、墨汁染色法和隱球菌莢膜抗原檢測，培養(yǎng)法是診斷隱球菌感染的金標準，但是由于新型隱球菌生長緩慢，至少需要72 h給出結(jié)果。加之大多數(shù)情況通過培養(yǎng)并不能獲得陽性結(jié)果，因此該方法無法滿足臨床大量樣本的高效即時檢測(POC)，墨汁染色只適合腦脊液標本的檢測，且陽性率偏低，新型隱球菌莢膜多糖抗原的靈敏度和特異性均較好，但與類風濕因子、多種細菌病原體存在交叉反應(yīng)[6]，可導致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性。基于該病原體核酸檢測的方法尚未應(yīng)用于臨床。重組酶聚合酶擴增(RPA)技術(shù)是一種新型恒溫核酸擴增技術(shù)，利用T4噬菌體的重組酶介導核酸引物特異識別相應(yīng)的DNA位點，進而啟動聚合酶擴增反應(yīng)[7]，反應(yīng)總過程<1 h。2019年5月～2020年1月，本研究采用實時熒光RPA技術(shù)建立新型隱球菌的快速核酸檢測方法，旨在為急診診治可疑危重患者提供核酸層面的快速檢測新型隱球菌的方法?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株 ①是建立RPA反應(yīng)體系的新型隱球菌標準菌株ATCC32609(購自北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司)。②是RPA反應(yīng)體系的陰性質(zhì)量控制菌株，包括本實驗室的質(zhì)控菌株和臨床分離菌株，鑒于新型隱球菌的送檢標本主要為腦脊液、胸水、肺泡灌洗液等，我們針對性地選取了對應(yīng)標本的普通細菌培養(yǎng)常見的細菌和真菌共150株作為驗證RPA法特異性的臨床菌株，所有臨床菌株都經(jīng)過VITEK MS鑒定確證。上述陰性質(zhì)控菌株具體包括：金黃色葡萄球菌ATCC25923和ATCC29213、糞腸球菌ATCC29212、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、光滑念珠菌ATCC2950、白色假絲酵母菌10株、熱帶假絲酵母菌10株、光滑假絲酵母菌10株、近平滑假絲酵母菌5株、克柔假絲酵母菌1株、葡萄牙假絲酵母菌1株、煙曲霉菌7株、黃曲霉菌3株、紋帶棒狀桿菌5株、解葡萄糖醛酸棒狀桿菌2株、假結(jié)核分枝棒狀桿菌1株、表皮葡萄球菌5株、溶血葡萄球菌5株、人葡萄球菌5株、金黃色葡萄球菌10株、、糞腸球菌5株、屎腸球菌5株、星座鏈球菌3株、咽頰炎鏈球菌5株、大腸埃希菌20株、肺炎克雷伯菌10株、陰溝腸桿菌5株、奇異變形桿菌5株、銅綠假單胞菌5株、糞產(chǎn)堿桿菌1株。③是實驗室保存的經(jīng)質(zhì)譜鑒定為新型隱球菌的凍存菌株10株，分別來自血液標本、腦脊液和胸水。驗證試驗用的100份臨床標本包括：檢測新型隱球菌莢膜多糖抗原的腦脊液留存標本50份，其中30份莢膜多糖抗原檢測陰性，20份莢膜多糖抗原陽性(同時腦脊液培養(yǎng)陽性鑒定為新型隱球菌)；痰標本15份(其中5份新型隱球菌培養(yǎng)陽性，3份結(jié)核分枝桿菌PCR擴增陽性)；胸腹水15份(其中10份標本新型隱球菌培養(yǎng)陽性)；靜脈血標本20份(5份新型隱球菌血培養(yǎng)陽性，其余陰性)。

1.2 試劑和儀器 -80 ℃冰箱(青島海爾)、HHW-21600電熱恒溫水箱(天津中環(huán)電爐廠)、核酸提取儀DP1000(上?？迫A)、超微量紫外可見分光光度計ND5000(北京百泰克)、ABI7500實時熒光定量PCR擴增儀(美國ABI公司)、Alpha 紫外凝膠成像儀(美國BioRAD)、DYCP-31電泳儀(北京)、VITEK MS質(zhì)譜儀。血平板(法國梅里埃天津國藥代理)、磁珠法核酸提取試劑盒(上?？迫A)、溴化乙錠、DL600bp DNA marker(天根生化科技北京有限公司)、瓊脂糖凝膠(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)、凝膠法和熒光法RPA試劑盒(蘇州先達科技有限公司)、新型隱球菌oasig實時熒光PCR試劑盒(英國南安普敦PrimerDesign生物科技公司)；PCR擴增引物和探針由蘇州泓迅生物科技有限公司完成，PCR擴增產(chǎn)物純化與測序由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 新型隱球菌菌株、陰性質(zhì)控菌株和臨床標本DNA提取按核酸提取試劑盒(磁珠法)操作說明書，配制核酸裂解液，準備洗滌液,深孔板，洗脫板和磁套；新型隱球菌菌株和陰性質(zhì)控菌株用1 μL接種環(huán)從血平板上刮取3～5個相應(yīng)的新鮮傳代菌落，轉(zhuǎn)入加有3 mL 生理鹽水的試管(菌液濃度約為McF2.0)研磨混勻；于腦脊液、胸水等無菌體液標本，取1 mL轉(zhuǎn)入1.5 mL無菌EP管，12 000 rpm離心5 min，棄去上清，沉淀用200 μL生理鹽水重懸；痰、肺泡灌洗液等呼吸道標本按1∶2比例加入4%NaOH消化20 min，12 000 rpm離心5 min，棄上清，加入500 μL生理鹽水振蕩混勻，12 000 rpm離心5 min，棄上清，生理鹽水重復(fù)洗滌2次，加入200 μL生理鹽水重懸；靜脈血標本12 000 rpm離心5min，血漿備用。在深孔板中依次加入20 μL去抑制劑、200 μL標本提取菌懸液或血漿和400 μL裂解液，放入磁套；將深孔板和磁套轉(zhuǎn)入核酸提取儀DP1000中，運行核酸提取程序(包括裂解-清洗-洗脫步驟)；提取程序結(jié)束后，小心取出含有磁套的洗脫板，在磁力架上放置1 min，取下磁套，每孔取1 μL用超微量紫外可見分光光度計ND5000測算上清液OD260/OD280、OD260/OD230， OD260/OD280>1.8且OD260/OD230>2.0說明提取DNA純度較高。提取的DNA溶液分裝至EP管(每孔15 μL DNA溶液，分裝于3個EP管)，-80 ℃保存?zhèn)溆?。最終ATCC32609經(jīng)過VITEK-MS鑒定復(fù)核為新型隱球菌菌株標準株。各待測菌株、臨床樣本DNA提取結(jié)束后，可見洗脫板各孔位磁珠聚集良好，無磁珠成團片狀現(xiàn)象，用加樣槍易吹打混勻。OD260/OD280>1.8且OD260/OD230>2.0， 說明提取陰性質(zhì)控菌株、臨床標本DNA均符合試驗要求。

1.4 新型隱球菌DNA引物擴增及鑒定 凝膠法RPA擴增新型隱球菌DNA引物。引物設(shè)計原則參考Twist Dx公司說明(http://www.twistdx.co.uk/)，在新型隱球菌5.8SrRNA編碼基因區(qū)域共設(shè)計6對引物，見表1用凝膠法RPA基礎(chǔ)試劑盒篩選可穩(wěn)定擴增出新型隱球菌DNA片段引物50 μL擴增反應(yīng)體系包括：溶解劑20 μL，10 μmol/L 的引物F、引物R各1.5 μL，ATCC32609的DNA模板2 μL，ddH2O補足至48 μL，混勻后即刻加入激活劑2 μL，瞬時離心后放置在37 ℃水浴鍋中，反應(yīng)20 min。擴增后，取各引物1.5%瓊脂糖凝膠電泳后觀察反應(yīng)結(jié)果，陽性視為可穩(wěn)定擴增出新型隱球菌DNA引物。另取ATCC32609菌株懸液以1∶10、1∶102、1∶103、1∶104、1∶105稀釋，半定量法檢測凝膠電泳陽性引物和試劑對ATCC32609標準株的靈敏度，。以凝膠電泳反應(yīng)陽性引物的擴增產(chǎn)物測序結(jié)果為目標片段，通過PUBMED網(wǎng)站進行blast比對，分析凝膠電泳陽性引物是否為新型隱球菌編碼核糖體RNA的DNA片段。凝膠電泳陽性引物擴增150株陰性質(zhì)控菌株，觀察是否存在擴增條帶，驗證該反應(yīng)的特異性。

表1 引物擴增反應(yīng)陽性的新型隱球菌DNA引物

1.5 新型隱球菌DNA引物探針的設(shè)計、鑒定 采用實時熒光RPA法。分別用引物2、5、6目的片段設(shè)計檢測探針，最終引物6的擴增片段中找到適合的探針，因此，新型隱球菌的的引物為F(5′→3′) CACGTTTTACACAAACTTCTAAATGTAATG，R(5′→3′) CAAGTTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTG，探針為：CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGA[FAM-dT]A[THF]G[BHQ-dT]AATGTGAATTGCA[3′-C3spacer]。采用實時熒光RPA法，以ATCC32609菌株基因組DNA和150株陰性質(zhì)控菌株DNA為模板,加入設(shè)計探針檢測該引物，觀察是否存在擴增條帶(存在擴增條帶即為擴增反應(yīng)陽性)，驗證該反應(yīng)的特異性。50 μL擴增反應(yīng)體系包括：溶解劑20 μL，10 μmol/L 的引物F和引物R各1.5 μL，探針0.6 μL ，DNA模板2 μL， ddH2O補足至48 μL，混勻后即刻加入激活劑2 μL，瞬時離心后，在ABI 7500儀器上設(shè)置每個循環(huán)為37 ℃，1min，每個反應(yīng)循環(huán)自動采集熒光，共20個循環(huán)。所有檢測孔位均為復(fù)孔檢測。取實驗室保存的10株新型隱球菌臨床分離株加入設(shè)計探針后進行擴增，ABI7500軟件上觀察擴增后熒光成像結(jié)果。

1.6 熒光法RPA和實時熒光PCR法對新型隱球菌DNA檢測的一致性比較 取10株新型隱球菌臨床分離株和100份臨床樣本(包括腦脊液50份、 痰15份、胸腹水15份、靜脈血20份)，分別用熒光法RPA和實時熒光PCR法進行DNA擴增。熒光法RPA操作同“1.5”，實時熒光PCR法按照英國oasig 實時熒光PCR試劑盒的說明，擴增反應(yīng)體系：主反應(yīng)劑10 μL，引物/探針混合物1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 4 μL，共計20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃、15 min；95 ℃、10 s，60 ℃、1 min，50個循環(huán)。所有檢測孔位均為復(fù)孔檢測。擴增反應(yīng)結(jié)束，ABI7500軟件上觀察熒光成像結(jié)果。

2 結(jié)果

引物2、5、6的目的條帶清晰，無彌散拖尾現(xiàn)象，引物擴增反應(yīng)陽性；1∶105稀釋的ATCC32609模板DNA凝膠電泳結(jié)果可見新型隱球菌陽性條帶。blast比對結(jié)果為，引物2、5、6均屬于新型隱球菌編碼核糖體RNA的DNA片段，比對結(jié)果符合率為100%。用引物6擴增陰性對照菌株后，凝膠電泳未見擴增條帶。見圖1、2、3。

注：從左到右依次是DL600bp marker,編號1～6引物的擴增產(chǎn)物，其中編號為2、5、6號引物的目的條帶清晰，無彌散拖尾現(xiàn)象。第2、5、6組引物的擴增目的條帶依次為170、193及170 bp。

注：M表示DL600bp marker,條帶1～6分別是原液、1∶10、1∶102、1∶103、1∶104、1∶105稀釋的新型隱球菌ATCC32609基因組DNA上樣擴增結(jié)果。

注：起始劃線部分是第6對引物的F98序列

引物6設(shè)計的探針實時熒光反應(yīng)結(jié)束時可見S形陽性擴增曲線，見圖4；所有陰性對照菌株擴增結(jié)果陰性。對ATCC32609菌懸液1∶105稀釋后加入引物6設(shè)計探針仍可見陽性擴增曲線，見圖5。加入引物6設(shè)計探針后擴增10株新型隱球菌菌株均可見S形陽性擴增曲線，見圖6。熒光法RPA試劑、oasig實時熒光PCR法檢測100份臨床樣本中擴增反應(yīng)陽性的分別為40、40份。

圖4 新型隱球菌ATCC32609和陰性質(zhì)控菌株的熒光法RPA擴增曲線

圖5 新型隱球菌ATCC32609菌懸液依次稀釋后的實時熒光RPA擴增結(jié)果

圖6 熒光法RPA檢測新型隱球菌臨床分離菌株的擴增曲線

3 討論

目前臨床常用的檢測新型隱球菌的方法包括血液、腦脊液培養(yǎng)，從上機培養(yǎng)到儀器報陽以及后續(xù)的轉(zhuǎn)種固體培養(yǎng)基、鑒定、藥敏，至少需要3～5 d才能完成試驗。培養(yǎng)法對于病原體檢測是金標準，但時間周期太長。傳統(tǒng)檢測方法比如墨汁染色最適合腦脊液的檢驗，但是陽性檢出率很低，且胸水、痰液、分泌物等標本無法使用該方法進行檢測；隱球菌莢膜多糖抗原檢測是血清學方法，適用的標本類型包括血清、血漿和腦脊液，檢測采用金標法，10～15 min即可得到結(jié)果，方便快速是它的最大優(yōu)勢，但是該方法所受的影響因素仍然較多，與類風濕因子、多種細菌病原體存在交叉反應(yīng)[7]，可導致檢測結(jié)果呈現(xiàn)假陽性，該方法多作為檢測是否存在新型隱球菌感染的一個充分條件，檢測結(jié)果無法作為診斷新型隱球菌感染金標準。

本研究應(yīng)用基于RPA的恒溫PCR擴增技術(shù)是從核酸水平檢測新型隱球菌，目前已有的新型隱球菌實時熒光定量檢測試劑屬于傳統(tǒng)的PCR檢測范疇，上機反應(yīng)時間為95 min，且成本較高；RPA反應(yīng)最大的優(yōu)勢在于高效和快速，反應(yīng)只需20 min，加上樣本的前處理時間，總共1 h即可得到檢測結(jié)果。因為本研究需要測試建立RPA技術(shù)檢測新型隱球菌的反應(yīng)體系，會用到大量的菌株標本和臨床樣本進行靈敏度和特異性的測試，因此采用核酸提取儀批量提取了各類待檢樣本的DNA，如果該實驗后續(xù)應(yīng)用于臨床，尤其是急診危重患者的樣本檢測，就需要靈活的提取送檢標本的DNA，目前已有商品化的提取各類樣本DNA的手工試劑盒，從獲得樣本并提取DNA上機進行實時熒光檢測，可以實現(xiàn)樣本的即時單個或多個快速處理，實現(xiàn)了針對新型隱球菌的面向急診和危重患者的快速核酸檢測。目前本研究正補充完善不同的DNA提取技術(shù)是否會對RPA實驗結(jié)果有影響的相關(guān)試驗研究，爭取使熒光法RPA檢測技術(shù)做到既適合單一急診樣本的快速提取和檢測，也適合大量樣本的自動化檢測。

RPA法檢測的優(yōu)勢在于方便快速，國內(nèi)已經(jīng)有通過該項技術(shù)檢測人腺病毒[8]、銅綠假單胞菌[9]的報道，前者使用的是RPA結(jié)合橫向流體試紙條的檢測法，后者采用的是RPA熒光法，這些技術(shù)的運用使得RPA法真正做到了快速簡便可視；如果該實驗終止于凝膠法，那么它不是能夠應(yīng)用于臨床的檢測技術(shù)，因為凝膠電泳不僅耗費時間和人力，而且擴增產(chǎn)物開蓋檢測極易造成氣溶膠污染，將來實驗容易出現(xiàn)假陽性。所以RPA凝膠法檢測更多是作為篩選引物來應(yīng)用，本實驗最終篩選出1對適合設(shè)計探針的引物。有了合適的引物和探針，檢測新型隱球菌的實驗才過渡到RPA熒光法，達到對新型隱球菌快速核酸檢測的目的。 RPA熒光法從核酸層面檢測新型隱球菌，首先保證了該檢測更接近于檢測病原體本身；其次擴大了適用檢測樣本的范圍，只要能對取材的樣本進行DNA提取,就適用于這種檢測方法。需注意的是，隱球菌病患者與分枝桿菌感染患者癥狀相似，所以送檢標本中極易含有分枝桿菌，本研究也評估了該方法檢測結(jié)核分枝桿菌PCR擴增陽性痰標本的特異性，結(jié)果顯示無非特異性擴增，而且痰標本屬呼吸道開放標本，在做PCR檢測時需要消化洗滌等處理步驟，它的前處理都是手工完成，因此更要嚴格按照試劑盒推薦的步驟完成操作。

綜上所述，實時熒光法RPA技術(shù)檢測新型隱球菌方便快捷。本研究不足之處在于驗證 RPA實驗的臨床標本數(shù)量較少，且陽性標本更少，無法獲知疑似感染患者取材標本的RPA反應(yīng)檢出能力。因此，我們在今后的驗證試驗中，將主要關(guān)注臨床送檢的各類標本，尤其是急診和神經(jīng)內(nèi)科、ICU等科室懷疑隱球菌感染患者的取材標本，使RPA檢測新型隱球菌的技術(shù)聯(lián)合新型隱球菌莢膜抗原檢測技術(shù)，真正作為急診和危重患者的快速篩查檢測手段在臨床推廣應(yīng)用。