T-SPOT.TB聯(lián)合血清25-(OH)D3、LL-37診斷肺結(jié)核合并糖尿病的價(jià)值分析

宋 韜 付洪義 李莉娟 耿書軍 侯莉莉 康冠楠

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年約有100萬(wàn)新發(fā)結(jié)核病(tuberculosis, TB)，全球每年140萬(wàn) TB相關(guān)的死亡病例中，中國(guó)和印度總占比高達(dá)40%，防控形式仍十分嚴(yán)峻[1]。尤其是近年來，伴隨糖尿病(diabetes mellitus, DM)患病率的逐年增加，結(jié)核病患病率呈回升趨勢(shì)，極大威脅全球TB防控[2]。肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis, PTB)則是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)感染后引起的肺組織受損，若無有效控制則可持續(xù)進(jìn)展并累及多個(gè)系統(tǒng)及器官，而較單純PTB患者，合并DM的患者預(yù)后更差，加之其結(jié)核中毒癥狀不典型，診治難度也更大[3-6]。此類患者通常同時(shí)合并滲出性、增生性及干酪樣壞死病變病理生理基礎(chǔ)，影像學(xué)可見厚壁空洞這一特異性影像表現(xiàn)；但空洞形成又受機(jī)體免疫功能、病原體變態(tài)反應(yīng)能力等多因素影像，合并DM時(shí)可增加空洞型病變發(fā)生率，影像學(xué)輔助檢查特異性不佳；加之DM患者機(jī)體環(huán)境于MTB增長(zhǎng)繁殖有益，因此合并DM的PTB患者痰檢結(jié)果具較高的假陽(yáng)性率，難以獲得優(yōu)勢(shì)診斷效能[7-8]。結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)用于PTB的臨床診斷同樣存在局限性，其不僅受卡介苗接種因素影響，并與非MTB存在交叉免疫現(xiàn)象；而支氣管鏡、肺組織活檢皆為有創(chuàng)檢查[9-10]。較傳統(tǒng)痰檢、結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)及有創(chuàng)支氣管鏡、肺組織活檢，結(jié)核桿菌T細(xì)胞斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(T-cell spot of tuberculosis, T-SPOT.TB)診斷PTB雖具一定優(yōu)勢(shì)，但合并DM的PTB患者T-SPOT.TB檢測(cè)極易出現(xiàn)假陰性，且當(dāng)前針對(duì)性研究其診斷PTB合并DM患者的臨床報(bào)道少見[11]。因此，本文回顧性分析探析T-SPOT.TB檢查聯(lián)合血清25-羥基維生素D3[25-dihydroxycholecalciferol D3, 25-(OH)D3]、LL-37診斷PTB合并DM的價(jià)值，為PTB合并DM的臨床診斷提供新思路，報(bào)道如下。

資料與方法

一、臨床資料

選擇2015年1月至2018年12月在本院行T-SPOT.TB實(shí)驗(yàn)及血清25-(OH)D3、LL-37檢測(cè)的340例疑似PTB患者；其中121例單純PTB患者納入PTB組，男72例，女49例，年齡27～71歲，平均年齡55.87歲；97例PTB合并DM患者納入PTB-DM組，男45例，女52例，年齡30～70歲，平均年齡56.07歲；另122例排除MTB感染患者納入對(duì)照組，男69例，女53例，年齡28～72歲，平均年齡55.97歲，包括41例肺癌、39例淋巴瘤、42例胸膜間皮瘤。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①PTB診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《結(jié)核病》，有肺病理組織活檢、病原學(xué)檢查結(jié)果佐證[12]；②DM診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)糖尿病完全指南》[13]；③對(duì)照組病理組織活檢排除MTB感染，且非DM，并有治療后影像學(xué)隨訪記錄佐證。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①病理組織活檢證實(shí)合并良惡性腫瘤疾病的PTB患者；②合并自身免疫性疾??；③病歷資料顯示近3個(gè)月內(nèi)補(bǔ)充過維生素D、皮質(zhì)激素、利尿劑；④肺炎；⑥心、腦、肝或腎器官病變；⑤過敏性疾病。

二、研究方法

1.T-SPOT.TB檢查：肝素鈉抗凝試管采集晨間4 ml外周靜脈血，加入淋巴細(xì)胞分離液后分離外周血，重復(fù)離心操作3次后取10 μl樣本細(xì)胞加入計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目，并制備稀釋液；在培養(yǎng)板中依次加入陽(yáng)性對(duì)照液、特異性抗原培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate protein, CFP10)、6000早期分泌性抗原靶(early secreted antigenic target-6 kD Antigen, ESAT-6)、陰性對(duì)照液，均50 μl，每孔加入含2.5×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞稀釋100 μl，37 ℃、5%CO2條件下孵育16 h后，在培養(yǎng)板中加入50 μl酶標(biāo)抗體液，4 ℃孵育1 h后取出培養(yǎng)板，加入50 μl底物液，室溫避光孵育7 min，蒸餾水終止反應(yīng)，烘干處理后應(yīng)用自動(dòng)計(jì)數(shù)儀(ELISPOT讀板儀)計(jì)數(shù)斑點(diǎn)形成細(xì)胞(sphere forming cells, SFCs)數(shù)量。陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5，ESAT-6孔或CFP-10孔斑點(diǎn)數(shù)與陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)的差值≥6；或陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為6～10，ESAT-6孔或CFP-10孔斑點(diǎn)數(shù)是陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)的2倍及以上則判定為“有反應(yīng)性”；否則為“無反應(yīng)性”；若出現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)<20，或陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)書>10則定義為“不確定”。

2.血清25-(OH)D3檢測(cè)：分離膠促凝血試管采集晨間靜脈血2 ml，分離膠促凝血試管采集，20 min內(nèi)離心操作，1 500轉(zhuǎn)離心15 min，分離血清后-70 ℃保存，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)血清25-(OH)D3水平，檢測(cè)設(shè)備為API4000液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)AB公司)。

3.LL-37檢測(cè)：EDTA抗凝血試管采集晨間空腹靜脈血2 ml，4 ℃條件下離心500轉(zhuǎn)，15 min，吸收血漿后再次1 500轉(zhuǎn)離心15 min，提取血清至聚丙烯管，-70 ℃保存，固相酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)LL-37水平，試劑購(gòu)自Hycult biotech。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、T-SPOT.TB檢測(cè)診斷結(jié)果

1.T-SPOT.TB檢測(cè)對(duì)PTB的診斷價(jià)值分析：340例疑似PTB患者T-SPOT.TB檢測(cè)未見“不明確”現(xiàn)象；121例確診PTB患者中，T-SPOT.TB檢測(cè)“有反應(yīng)性”104例，準(zhǔn)確率85.9%(104/121)；97例PTB合并DM患者中，T-SPOT.TB檢測(cè)“有反應(yīng)性”73例，準(zhǔn)確率75.2%(73/97)；對(duì)照組中T-SPOT.TB檢出“有反應(yīng)性”28例，準(zhǔn)確率77.0%(94/122)；共檢出195例提示陽(yáng)性。T-SPOT.TB診斷PTB的總敏感度為76.6%、特異度為77.0%、準(zhǔn)確率76.8%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值85.6%、陰性預(yù)測(cè)值64.8%、kappa 0.515，一致性一般，見表1。

表1 T-SPOT.TB檢測(cè)對(duì)PTB的診斷價(jià)值分析

2.抗原CFP10、抗原ESAT-6孔內(nèi)SFCs數(shù)量診斷PTB合并DM的ROC曲線分析：對(duì)照組、PTB組、PTB-DM組抗原CFP10、抗原ESAT-6孔內(nèi)SFCs 比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，且PTB-DM組抗原CFP10、抗原ESAT-6孔內(nèi)SFCs>PTB組>對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ROC曲線分析顯示，抗原CFP10及抗原ESAT-6孔SFCs AUC分別為0.871(95%CI：0.829～0.914)、0.872(95%CI：0.835～0.909)；抗原CFP10孔cut-off為16.13 SFCs/2.5×105PBMC，診斷PTB合并DM的敏感度為84.5%，特異度為71.6%；抗原ESAT-6孔cut-off為14.80SFCs/2.5×105PBMC，診斷PTB合并DM的敏感度為84.5%，特異度為72.4%；抗原CFP10、抗原ESAT-6聯(lián)合診斷時(shí)AUC為0.931(95%CI：0.904～0.958)，診斷敏感度為83.5%，特異度為87.2%。各組抗原CFP10、抗原ESAT-6原值比較，見表2、圖1。

表2 各組抗原CFP10、抗原ESAT-6原值比較

圖1 抗原CFP10、抗原ESAT-6診斷PTB合并DM的ROC曲線分析

二、各組血清25-(OH)D3及LL-37水平檢測(cè)結(jié)果

1.血清25-(OH)D3及LL-37水平檢測(cè)結(jié)果：對(duì)照組、PTB組、PTB-DM組血清25-(OH)D3及LL-37水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；且PTB-DM組血清25-(OH)D3PTB組>對(duì)照組；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組血清25-(OH)D3及LL-37水平比較

2.血清25-(OH)D3、LL-37對(duì)PTB合并DM的診斷價(jià)值分析：ROC曲線分析顯示，血清25-(OH)D3、LL-37 AUC分別為0.630(95%CI：0.570～0.690)、0.653(95%CI：0.575～0.732)，以25-(OH)D3cut-off為18.06 ng/ml，診斷PTB合并DM的敏感度為90.7%，特異度為33.3%；以LL-37 cut-off為59.71 ng/ml，診斷PTB合并DM的敏感度為45.4%，特異度為91.4%，見圖2、3。

圖2 25-(OH)D3 ROC曲線分析

圖3 LL-37 ROC曲線分析

三、T-SPOT.TB聯(lián)合血清25-(OH)D3、LL-37診斷PTB合并DM的結(jié)果

經(jīng)ROC曲線分析，T-SPOT.TB、血清25-(OH)D3、LL-37三種檢測(cè)任意組合方式診斷PTB合并DM均有良好的診斷效能，T-SPOT.TB聯(lián)合25-(OH)D3、LL37診斷時(shí)AUC最大，為0.933%，特異度最佳，但敏感度略低于T-SPOT.TB聯(lián)合25-(OH)D3、T-SPOT.TB聯(lián)合LL-37診斷。T-SPOT.TB聯(lián)合血清25-(OH)D3、LL-37診斷PTB合并DM的價(jià)值見表4。

表4 T-SPOT.TB聯(lián)合血清25-(OH)D3、LL-37診斷PTB合并DM的價(jià)值

討 論

合并DM的PTB患者早期并無特異性臨床癥狀，且DM患者多存在代謝障礙、免疫低下等特點(diǎn)，其并發(fā)癥較多，兩種病變密切相關(guān)并又相互作用，不僅臨床癥狀更為復(fù)雜，亦可使MTB感染癥狀不典型，極易誤漏診，貽誤治療[14-15]。因此，準(zhǔn)確診斷尤為重要。而當(dāng)前診斷PTB的方式雖較多，如影像學(xué)輔助檢查、痰檢、結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)、支氣管鏡、肺組織活檢等，但又各具一定局限性[16-17]。T-SPOT.TB作為診斷TB的新興技術(shù)，其可通過檢測(cè)結(jié)核特異性抗原刺激后產(chǎn)生的γ-干擾素T細(xì)胞數(shù)量判斷是否感染MTB，較傳統(tǒng)痰培養(yǎng)、痰涂片，其在敏感度及特異度上優(yōu)勢(shì)顯著，且無創(chuàng)；但γ-干擾素的量、抗原數(shù)量受疾病活動(dòng)、個(gè)體免疫等多因素影響[18-19]。尤其是合并DM的PTB患者，其多存在免疫功能低下，機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答弱，其受抗原活化后產(chǎn)生γ-干擾素的T細(xì)胞數(shù)量也會(huì)隨之減少，極易出現(xiàn)“無反應(yīng)性”，導(dǎo)致誤漏診[20-21]。

本文回顧性分析340例疑似PTB患者的T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果顯示，其診斷PTB的總敏感度為76.6%、特異度為77.0%、準(zhǔn)確率76.8%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值85.6%、陰性預(yù)測(cè)值64.8%、kappa 0.515，一致性一般；而121例確診PTB患者中，T-SPOT.TB檢測(cè)準(zhǔn)確率85.9%；而97例PTB合并DM患者、對(duì)照組中，T-SPOT.TB檢測(cè)準(zhǔn)確率僅為75.2%、77.0%，進(jìn)一步驗(yàn)證，對(duì)合并DM的PTB患者，單一T-SPOT.TB診斷效能不佳。這與石學(xué)萍等[22]的報(bào)道相似，其采集700例疑似PTB患者進(jìn)行T-SPOT.TB檢測(cè)亦未獲得理想診斷效能。而藺景雙等[23]則報(bào)道T-SPOT.TB診斷PTB的敏感度及特異度分別高達(dá)95.1%、91.3%；分析或因其報(bào)道所納入研究對(duì)象均有典型肺結(jié)核中毒癥狀及影像特點(diǎn)有關(guān)。由此亦可見，探究T-SPOT.TB在PTB中的臨床應(yīng)用仍有待持續(xù)補(bǔ)充及完善，也體現(xiàn)本次回顧性分析的必要性。

鑒于此，本文將PTM合并DM設(shè)為狀態(tài)變量，以T-SPOT.TB檢測(cè)抗原CFP10、抗原ESAT-6孔內(nèi)SFCs為檢驗(yàn)變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，抗原CFP10及抗原ESAT-6孔SFCs對(duì)TB合并DM均有一定診斷預(yù)測(cè)價(jià)值，且以16.13 SFCs/2.5×105PBMC、14.80 SFCs/2.5×105PBMC為cut-off聯(lián)合診斷時(shí)，敏感度、特異度最佳，分別為83.50%、87.20%；較單純依據(jù)抗原CFP10、抗原ESAT-6孔內(nèi)SFCs與陰性對(duì)照孔差值等診斷，其診斷效能雖有一定提升，但仍一定誤漏診現(xiàn)象。

25-(OH)D3則是維生素D的活化形式，其作為免疫調(diào)節(jié)劑，是維持機(jī)體免疫穩(wěn)定平衡的重要物質(zhì)，且多項(xiàng)研究均證實(shí)，維生素D缺乏在DM、TB的發(fā)生發(fā)展中占重要地位，或可導(dǎo)致疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)成倍增加[24-27]；Sinha等[28]亦報(bào)道，維生素D缺乏可增加TB易感。而LL-37則是中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等多個(gè)免疫細(xì)胞合成的內(nèi)源性抗菌肽，不僅對(duì)維生素D有依賴性，亦可對(duì)MTB發(fā)揮拮抗作用[29-31]。結(jié)果顯示，PTB-DM組血清25-(OH)D3PTB組>對(duì)照組；戰(zhàn)云飛等[32]也有類似報(bào)道，并指出PTB患者LL37上升或與機(jī)體代償反應(yīng)相關(guān)，認(rèn)為L(zhǎng)L37或可成為PB診斷的新型生物標(biāo)志物，但未針對(duì)LL-37的診斷價(jià)值進(jìn)行分析。ROC曲線分析顯示，LL-37 AUC 為0.653，提示其對(duì)PTB合并DM有一定診斷預(yù)測(cè)價(jià)值，以59.71 ng/ml為cut-off，其診斷PTB合并DM的敏感度雖僅為45.4%，但特異度高達(dá)91.4%；而血清25-(OH)D3AUC則為0.630，以18.06 ng/ml為cut-off，其診斷PTB合并DM的敏感度高達(dá)90.7%，但特異度較低，僅為33.3%；這也提示單一25-(OH)D3、LL-37診斷PTB合并DM存在一定局限，而25-(OH)D3、LL-37聯(lián)合診斷時(shí)，診斷效能有一定改善，AUC上升為0.701%，但敏感度及特異度仍較低，分別為58.8%、76.5%。本文結(jié)果顯示，T-SPOT.TB、血清25-(OH)D3、LL-37三種檢測(cè)任意組合方式診斷PTB合并DM均有良好的診斷效能，T-SPOT.TB聯(lián)合25-(OH)D3、或聯(lián)合LL-37診斷時(shí)敏感度度及特異性無顯著差異，但均顯著優(yōu)于25-(OH)D3聯(lián)合LL-37診斷；而進(jìn)一步將T-SPOT.TB與25-(OH)D3、LL37聯(lián)合診斷時(shí)，AUC值上升至0.933，敏感度、特異度分別高達(dá)79.4%、92.2%，與T-SPOT.TB聯(lián)合25-(OH)D3、或聯(lián)合LL-37比較，其敏感度雖有一定下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，T-SPOT.TB與25-(OH)D3、LL37聯(lián)合診斷PTB合并DM可發(fā)揮最佳診斷效能，且優(yōu)于任意兩兩組合方式，值得臨床重視；但基于本文樣本量相對(duì)狹窄，且未考慮疑似肺結(jié)核患者肺野受累情況、未納入對(duì)照組、未進(jìn)一步明確糖尿病類型及病程等，仍存在一定局限性，T-SPOT.TB與25-(OH)D3、LL37在PTB合并DM患者中的診斷價(jià)值仍有待采集更大樣本量設(shè)計(jì)更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)呐R床研究。