γ-干擾素釋放試驗在活動性肺結(jié)核診斷中的價值

黃德東 劉庭貴 張 云 施 潔 韓湉湉 莊建文 魏西飛 顧 興

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)感染嚴(yán)重危害人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球有1/3的人感染過MTB，而我國結(jié)核感染水平高達(dá)44.5%，MTB患者數(shù)高居全球第2位[1-3]。結(jié)核病的早診斷、早治療成為防治結(jié)核病的關(guān)鍵。MTB分離培養(yǎng)鑒定、痰抗酸染色(antiacid stains smear, AAS)是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于MTB培養(yǎng)耗時較長；AAS敏感性不高，在結(jié)核感染早期診斷中受限[4]。AAS、結(jié)核菌素皮膚實驗(tuberculin skin test, TST)、結(jié)核分枝桿菌抗體(tuberculosis antibody, TBAb)或結(jié)核分枝桿菌免疫球蛋白(tuberculosis Immunoglobulin，TB-Ig)，在靈敏度及特異性上都有局限性[5]。結(jié)核γ-干擾素釋放試驗(tuberculosis interferonγ release assay TB-IGRA)在臨床中被運用于活動肺結(jié)核的診斷[6-9]。TB-IGRA的原理為：加入結(jié)核分枝桿菌早期分泌抗原靶6(early-secreted antigenic target-6, ESAT-6)和培養(yǎng)基濾過蛋白-10(culture filtrate protein-10, CFP-10)，經(jīng)過全血中的抗原遞呈細(xì)胞刺激結(jié)核分枝桿菌致敏的效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生γ-干擾素(interferonγ IFN-γ)。釋放的IFN-γ可通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked-immunosorbent assay, ELISA)定量檢測，來判斷效應(yīng)T細(xì)胞是否被結(jié)核致敏，判斷是否診斷結(jié)核感染。這種方法操作方便、成本相對較低[10]。我國部分結(jié)核病高負(fù)擔(dān)地區(qū)，特別是我國西南部醫(yī)療資源不充足地區(qū)開展TB-IGRA，有利于控制結(jié)核病。使用TB-IGRA、TST、TB-Ig在貴州省織金縣人民醫(yī)院疑似肺結(jié)核患者中檢出活動性肺結(jié)核，評價TB-IGRA、TST、TB-Ig檢測的檢驗效能。本項目獲得織金人民醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，所有觀察對象都簽署了知情同意書。

資料與方法

一、項目對象

2018年12月20日至2019年12月20日間在織金縣人民醫(yī)院結(jié)核病門診或感染科結(jié)核病區(qū)住院的患者，根據(jù)《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-肺結(jié)核診斷(WS 288-2017)》診斷標(biāo)準(zhǔn)篩查[11]，疑似肺結(jié)核患者1 627例，年齡范圍男性904例，女性723例，平均年齡(37.6±21.3)歲。其中活動性肺結(jié)核1 373例，年齡范圍男性768例，女性605例，平均年齡(36.8±20.0)歲；非活動肺結(jié)核患者254例，男性145例，女性109性，平均年齡(37.9±21.9)歲。組間的年齡、性別比例均無統(tǒng)計學(xué)意義。

納入標(biāo)準(zhǔn): ①根據(jù)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為疑似肺結(jié)核；②自愿參加，并簽署知情同意書；③年齡：18～65歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并除結(jié)核外的其它感染性疾病，如病毒性肝炎、肺孢子菌肺炎、艾滋病等；②心、腦、肝、腎等重要器官的嚴(yán)重病變或功能衰竭；③吸毒、酗酒、精神病患者；④有惡性腫瘤或惡性腫瘤病史；⑤抗結(jié)核治療超過3個月；⑥已經(jīng)妊娠或半年內(nèi)準(zhǔn)備妊娠者?；颊呷虢M后除進(jìn)行TB-IGRA、TST、TB-Ig檢測外，同時進(jìn)行常規(guī)臨床實驗室檢驗、微生物檢驗及病理和影像學(xué)方面的檢測?；顒有苑谓Y(jié)核病的標(biāo)準(zhǔn)包括: ①病理標(biāo)本中出現(xiàn)干酪樣肉芽腫并確診為結(jié)核者；②通過臨床病征診斷的活動性肺結(jié)核者；③予以抗結(jié)核治療有效者。

二、主要儀器設(shè)備及試劑

酶標(biāo)儀(Bio Tek Elx800)，電熱恒溫水浴槽(上海始恒儀器 CU-420)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific 8000)。γ-干擾素體外釋放試驗診斷試劑盒購自北京萬泰生物技術(shù)有限公司。結(jié)核分枝桿菌抗體IgG診斷試劑盒購自康華技術(shù)有限公司。

三、研究方法

1.IGRA-ELISA實驗: 采集5 ml靜脈血置于肝素鋰抗凝管中，輕輕搖勻后盡快分裝到本底對照管(N)、特異性刺激管(T)、陽性對照管(P)中，每種管分裝1.5 ml新鮮全血，顛倒混勻后置于含5%二氧化碳、37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h。按照試劑盒說明書用 ELISA定量檢測釋放的IFN-γ水平。根據(jù)酶標(biāo)儀測量結(jié)果，計算T、N、P管中血漿相應(yīng)的IFN-γ 含量，按試劑說明書要求判斷結(jié)果。

2.TST試驗方法: 據(jù)文獻(xiàn)及診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，試劑為結(jié)核菌素純化蛋白衍生物(purified protein derivative, PPD)[11-12]。所有受試對象于左前臂背側(cè)上1/3處，皮內(nèi)注射0.1 ml(含5 IU)，72 h后按照肺結(jié)核診斷(WS 288-2017)標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果[11]。由于織金縣是結(jié)核病高發(fā)地區(qū)、潛伏感染率高，中度陽性及以上結(jié)果判定為結(jié)核病感染TST實驗陽性。

3.TBAb檢測方法: 主要檢測結(jié)核分枝桿菌免疫球蛋白G(TB-IgG)，按參考文獻(xiàn)[13]及嚴(yán)格參照試劑說明書進(jìn)行操作與結(jié)果判讀。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、一般資料結(jié)果

本項目納入疑似肺結(jié)核患者共有1 627例，活動性肺結(jié)核患者1 373例，非活動肺結(jié)核患者254例，組間的年齡、性別比例均無統(tǒng)計學(xué)意義。卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)接種情況，主要通過詢問接種史和檢查上臂的卡痕判斷是否有BCG接種史，組間比例無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 對象人口學(xué)資料及卡介苗接種史

二、IGRA、TST與TB-IgG檢測結(jié)果

納入的疑似結(jié)核患者中被診斷為活動性肺結(jié)核的1 373例，非活動性肺結(jié)核的254例。IGA診斷活動性肺結(jié)核的敏感性達(dá)91.26%，在非活動性肺結(jié)核組中診斷的陰性病例的特異性達(dá)到79.13%，見表2。

表2 疑似肺結(jié)核IGRA、TST、TB-IgG檢測結(jié)果[n(%)]

三、檢測效能比較結(jié)果

IGRA、TST、TB-IgG在疑似肺結(jié)核患者中診斷活動性肺結(jié)核的比較，見表3。IGRA的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和準(zhǔn)確性分別為91.2%、80.1%、95.9%，62.6%和89.4%，均高于TST、TB-IgG。

表3 IGRA、TST與TB-IgG檢測結(jié)果效能比較(%)

四、BCG接種IGRA、TST、TB-IgG檢測結(jié)果

活動性肺結(jié)核患者中，IGRA在有BCG接種史患者中陽性率為91.48%；在無BCG接種史的患者中陽性率為88.57%。BCG接種對IGRA診斷疑似肺結(jié)核患者中的活動性肺結(jié)核影響無統(tǒng)計學(xué)意義，(χ2=1.03，P=0.31)。TST診斷疑似肺結(jié)核中的活動性肺結(jié)核的陽性率為75.9%，而診斷有BCG接種的活動性肺結(jié)核中的陽性率為79.4%，明顯高于無BCG接種史的患者中的陽性率(34.2%)，有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=108.17，P<0.001)。BCG接種史對TB-IgG檢測影響也不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.53，P=0.47)，BCG疫苗接種對IGRA、TST與TB-IgG診斷活動性肺結(jié)核的結(jié)果，見表4。

表4 BCG疫苗接種對IGRA、TST與TB-IgG診斷活動性肺結(jié)核的結(jié)果[n(%)]

非活動性肺結(jié)核患者中，228例有BCG接種史，IGRA的陽性率為26.6%，而在無BCG接種史中的陽性率為23.8%，相差不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.05，P=0.83)。TST診斷疑似肺結(jié)核中的非活動性肺結(jié)核的陽性率為29.9%，而在有BCG接種史中的陽性率為31.4%，高于無BCG接種史的陽性率23.8%，但無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.58，P=0.21)。BCG接種史對TB-IgG檢測影響無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.58，P=0.28)，見表5。

表5 BCG疫苗接種對IGRA、TST與TB-IgG診斷非活動性肺結(jié)核的結(jié)果[n(%)]

討 論

IGRA能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染和BCG接種引起的免疫應(yīng)答，對于BCG廣泛接種、結(jié)核病高發(fā)的我國西南部地區(qū)有特別意義[14]。本項目在貴州織金縣人民醫(yī)院的疑似肺結(jié)核患者中評價了IGRA分析方法早期診斷活動性肺結(jié)核的價值。

IGRA 是利用結(jié)核分枝桿菌感染者外周血中存在結(jié)核分枝桿菌致敏的T淋巴細(xì)胞，這些T淋巴細(xì)胞再次接觸結(jié)核分枝桿菌特異性抗原時可發(fā)生克隆增殖分化并釋放 IFN-γ 的原理進(jìn)行檢測[15]。采用 ELISA檢測方法，簡便、設(shè)備要求不高、價格相對便宜，適宜在我國西南部醫(yī)療資源不充足地區(qū)使用。國外研究表明IGRA的敏感性在80%以上，特異性在90%以上[7-8，13，16-17]。我國學(xué)者也報道了IGRA在新兵結(jié)核篩查、潛伏性結(jié)核調(diào)查、診斷肺結(jié)核及肺外結(jié)核、調(diào)查結(jié)核密切接觸者的結(jié)核感染中的運用，也都顯示敏感性、特異性、準(zhǔn)確性很高[12，14，18-19]。本文結(jié)果中，IGRA是在疑似肺結(jié)核中診斷活動性肺結(jié)核，敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、準(zhǔn)確性，分別是91.26%、80.13%、95.94%、89.37%，與國內(nèi)外研究基本一致[5-6，8，12，14，19-20]。但本文結(jié)果中的陰性預(yù)測值只有62.62%，較其它研究低[6，10，21]，這可能與我們納入研究對象的總體有差別。本文納入的是肺結(jié)核疑似患者，故活動性肺結(jié)核可能性大，陽性預(yù)測值及敏感性稍高，陰性預(yù)測值較低。

TST，采用的是人型結(jié)核分枝桿菌制成的PPD-C及從卡介苗制成BCG-PPD。PPD試驗通過激活中心記憶性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，它檢測的不僅包含活動性結(jié)核，也包含陳舊的、休眠的結(jié)核分枝桿菌感染[22]。本文結(jié)果中TST的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、準(zhǔn)確性，分別是75.9%、70.0%、93.2%、75.0%，與國內(nèi)外研究結(jié)果基本一致。但陰性預(yù)測值較低，僅有35.0%?？赡芘c我們納入研究的樣本是疑似肺結(jié)核患者有關(guān)。PPD試劑很難標(biāo)準(zhǔn)化，不同的PPD試劑可能也會導(dǎo)致結(jié)果的偏差，特別在陽性患者占主要的樣本中陰性預(yù)測值可能會受到更多影響[6]。

結(jié)核分枝桿菌抗體測定，TB-IgG檢測，由于此次檢測的試劑盒測定的IgG，僅討論TB-IgG的測定。國外研究者使用結(jié)核分枝桿菌早期表達(dá)的蛋白 ESAT6, CFP10、antigen 85A 和結(jié)核分枝桿菌DNA結(jié)合蛋白1(MDP-1)及α-晶體樣蛋白作為抗原(α-CLP)，測定TB-IgG診斷活動結(jié)核及結(jié)核潛伏感染都顯示很好的準(zhǔn)確性(P<0.05)[22-23]。Tobias Broger團隊使用三種結(jié)核分枝桿菌蛋白抗原推定結(jié)核感染的敏感性、特異性分別為85.0%、34.0%。本文測定TB-IgG診斷活動性肺結(jié)核，敏感性、特異性及準(zhǔn)確性較國外研究低[23-24]?？赡苤饕且驗閲庠诳乖噭┲锌乖倪x擇及優(yōu)化上有區(qū)別。與國內(nèi)學(xué)者比較，TB-IgG診斷活動性肺結(jié)核的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性相差不大[7，22，25]。

本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGRA診斷疑似肺結(jié)核人群中的活動性肺結(jié)核的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性比TST、TB-IgG均高，與國內(nèi)外研究結(jié)果一致[6-8，12，17-19，24]。結(jié)核分枝桿菌感染的免疫反應(yīng)主要是細(xì)胞免疫反應(yīng)[22]。IGRA檢測的就是結(jié)核特異性T細(xì)胞釋放的IFN-γ，理論上應(yīng)該比通過抗原抗體反應(yīng)原理的TB-IgG有更好的檢驗效能[22]。TST為體內(nèi)試驗，是受到患者當(dāng)時機體各種因素的影響，不如體外實驗IGRA易于標(biāo)準(zhǔn)化[17]。機體的致敏T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核特異性抗原刺激后產(chǎn)生IFN-γ可能也增加，但是并不一定使巨噬細(xì)胞集聚、浸潤的反應(yīng)程度也能成比例的增強，即TST陽性也不一定就增加。一部分結(jié)核分枝桿菌感染者巨噬細(xì)胞可能對IFN-γ反應(yīng)低或不反應(yīng)，而出現(xiàn)PPD試驗假陰性；BCG接種者會導(dǎo)致PPD試驗假陽性[14，19]。

在評價BCG接種對IGRA、TST、TB-IgG檢測的影響中發(fā)現(xiàn)：受影響最大是TST，而對IGRA、TB-IgG的影響不大。有BCG接種人群中，活動性肺結(jié)核的敏感性達(dá)到79.42%，而特異性將為34.29%。盡管本實驗采用的是人型結(jié)核分枝桿菌制成的PPD-C，但與BCG有部分共同抗原，導(dǎo)致PPD假陽性[17]。而IGRA采用的CFPl0和ESAT6，是通過比較基因組學(xué)篩選的僅存在于結(jié)核分枝桿菌和牛結(jié)核分枝桿菌基因組中，而BCG的基因組中缺失[10]。

綜上所述，IGRA在疑似肺結(jié)核患者中診斷活動性肺結(jié)核有很好的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性。開展IGRA，并聯(lián)合TST、TB-IgG將能顯著提高我國醫(yī)療資源不充足的西南結(jié)核病高發(fā)區(qū)結(jié)核病的診治水平。