肺腺癌組織中IGF1R、Cezanne-1表達(dá)與EGFR基因突變的相關(guān)性分析

瓦熱斯江·衣不拉音 吳振華 孫 偉 阿布力米提·阿布來提

肺腺癌因缺乏特異性診斷技術(shù)，加之早期無典型癥狀及表現(xiàn)，多數(shù)患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)展至中晚期，失去最佳的手術(shù)機(jī)會(huì)，即便是接受手術(shù)治療，根除率也較低[1]。目前，肺癌的發(fā)病機(jī)制不明確，多認(rèn)為與職業(yè)暴露、特定的基因突變等因素有關(guān)[2-3]?？梢姙榉蜗侔┗颊哒业叫碌那爷熜鞔_的治療手段意義重大。當(dāng)前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的肺腺癌常見變異基因位點(diǎn)有鼠肉瘤病毒基因、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)等，其中EGFR基因突變的發(fā)生被認(rèn)為是肺部惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展的主要遺傳學(xué)因素[4-5]。但EGFR基因突變檢查對(duì)技術(shù)、腫瘤組織獲取、實(shí)驗(yàn)條件等均有較高的要求，目前可以展開基因檢測的地區(qū)相對(duì)有限，開展難度大[6-7]。故找到一種可以早期評(píng)估肺腺癌患者EGFR基因突變情況的理想指標(biāo)尤為關(guān)鍵。研究顯示，胰島素樣生長因子-1受體(insulin like growth factor-1 receptor, IGF1R)在細(xì)胞生命活動(dòng)中有著關(guān)鍵作用，參與了腫瘤細(xì)胞的生長與凋亡，在非小細(xì)胞肺癌組織樣本中呈高表達(dá)[8-9]；Cezanne-1是一種有著去泛素化酶，與A20酶的序列相似，研究發(fā)現(xiàn)，其在腫瘤組織樣本中呈過表達(dá)，且研究認(rèn)為這種Cezanne-1過表達(dá)與增強(qiáng)EGFR信號(hào)通路作用及抑制EGFR降解有關(guān)[10-11]。故推測Cezanne-1表達(dá)與EGFR基因突變相關(guān)，但目前相關(guān)的研究并不多見。本文探討IGF1R、Cezanne-1表達(dá)用于預(yù)測EGFR基因突變風(fēng)險(xiǎn)的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、臨床資料

選擇2017年3月至2019月4月醫(yī)院收治的符合入選標(biāo)準(zhǔn)且得到明確肺腺癌腫瘤組織，并經(jīng)病理科診斷明確為肺腺癌的患者56例，將其納入研究組。其中男36例，女20例；年齡34～80歲，平均年齡53.11歲；吸煙者31例；病理分期：參照2009國際肺癌研究學(xué)會(huì)公布肺惡性腫瘤TNM分期(第7版)[12]，包括Ⅰ期3例，Ⅱ期13例，Ⅲ期29例，Ⅳ期11例。納入同期在醫(yī)院接受手術(shù)治療并在術(shù)中獲得病灶組織的51例肺部良性病變患者，將其作為對(duì)照組。其中男33例，女18例；年齡35～80歲，平均年齡50.27歲；吸煙者22例。全部納入的患者均有明確的病理學(xué)結(jié)果，并獲得病灶組織樣本，病例組患者還獲得少量癌旁組織樣本；排除合并其他腫瘤疾病的患者、合并其他免疫性疾病的患者、合并其他器質(zhì)性疾病的患者、合并其他重要臟器功能不全的患者。本項(xiàng)目的實(shí)施得到醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，全部納入的患者及其家屬簽署知情同意書。

二、研究方法

病理組織獲得方法包括手術(shù)直接切除、纖支鏡取得、CT輔助定位經(jīng)皮肺穿刺取得。包括肺癌組織、癌旁組織、肺部良性病變組織。組織樣本IGF1R、Cezanne-1、EGFR表達(dá)情況均采用免疫組化法測定。免疫組化切片、烤片等各個(gè)步驟使用的儀器均由Leica公司提供。具體免疫組化步驟：(1)標(biāo)本的處理：固定、包埋、切片、撈片、烤片；(2)檢測主要步驟：標(biāo)本脫蠟、水化、抗原修復(fù)、一抗孵育、免疫組化試劑盒使用、顯色、自來水沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片、讀片。各指標(biāo)陽性判讀：經(jīng)低倍鏡、高倍鏡觀察并讀片，由醫(yī)院兩名有自身免疫組化閱片經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師讀片，在著色的病理組織中，高倍鏡下至少5個(gè)各異的染色區(qū)域，按照細(xì)胞膜、細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)著色的程度來評(píng)價(jià)陽性細(xì)胞的百分率：著色細(xì)胞占比≤10%視為陰性，著色>10%則視為陽性表達(dá)(其中包括>10%～25%：弱陽性﹢；>25%～75%視為中等陽性﹢﹢；>75%視為強(qiáng)陽性﹢﹢﹢)。

EGFR基因突變檢測：樣本取樣方法一致。該檢測所用主要儀器與試劑由德國凱杰公司提供，包括EFGR基因突變檢驗(yàn)試劑盒、熒光定量PCR儀等。取得組織樣本之后使用福爾馬林固定，石蠟包埋之后切片，離心制作并取DNA，進(jìn)行熒光定量分析操作，各個(gè)操作步驟均需嚴(yán)格遵照試劑盒說明書進(jìn)行。采用探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(等位基因特異聚合酶鏈反應(yīng))檢測，設(shè)置合適的反應(yīng)條件，擴(kuò)增后的產(chǎn)物使用熒光定量PCR儀器定量分析，主要的基因突變包括EGFR18、EGFR Exon19、EGFR Exon20、EGFR Exon21等基因突變情況。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，以百分比表示計(jì)數(shù)資料，用χ2檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，等級(jí)相關(guān)采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、EGFR基因突變檢出結(jié)果比較

肺腺癌組織EGFR基因突變陽性檢出率高于癌旁組織及肺部良性病變組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，癌旁組織與肺部良性組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組EGFR基因突變陽性檢出率比較

二、研究組EGFR突變患者與未突變患者的臨床特征比較結(jié)果

EGFR基因突變的肺腺癌患者與其他未檢出基因突變的肺腺癌患者的性別、年齡、吸煙史、TNM分期等臨床特征比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

三、IGF1R、Cezanne-1陽性表達(dá)檢出率比較結(jié)果

肺腺癌組織檢出IGF1R、Cezanne-1陽性率高于癌旁組織與肺部良性病變組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；癌旁組織與肺部良性疾病比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 IGF1R、Cezanne-1陽性表達(dá)檢出率比較

四、不同EGFR基因突變組織中IGF1R、Cezanne-1陽性檢出率比較結(jié)果

EGFR基因突變的肺腺癌組織中檢出的IGF1R、Cezanne-1陽性率均高于未檢出EGFR基因突變的組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 不同EGFR基因突變肺腺癌組織中IGF1R、Cezanne-1陽性檢出率比較

五、肺腺癌組織中IGF1R、Cezanne-1表達(dá)與EGFR基因突變的相關(guān)性分析結(jié)果

經(jīng)等級(jí)資料Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，IGF1R、Cezanne-1表達(dá)與EGFR基因突變之間均呈正相關(guān)(r>0，P<0.05)，見表5。

討 論

EGFR屬于人類表皮生長因子受體(HER/erbB)家族，是一種蛋白腦氨酸激酶受體，主要由原癌基因c-erb-1編碼表達(dá)，是跨膜糖蛋白受體的一種[12-13]。人類EGFR基因存在于七號(hào)染色體p13～q22之間，共5 460 bp，其中包含28個(gè)外顯子，研究證實(shí)EGFR基因活化之后可以進(jìn)一步啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，繼而編碼相關(guān)蛋白的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的異常增殖及分化產(chǎn)生直接刺激，是腫瘤發(fā)生與發(fā)展的決定性因子之一[14-15]。在非小細(xì)胞肺癌患者中，EGFR突變激活也可能是導(dǎo)致癌變的重要因素[16]?？煽紤]將突變結(jié)果的檢出指導(dǎo)臨床治療。

本文結(jié)果顯示，較癌旁組織與肺部良性組織，肺腺癌組織檢出的EGFR基因突變率最高，為57%，較國外研究的30%～50%偏高，這可能與基因突變具有種族差異、人群差異等因素有關(guān)[17]；此外，因本文屬于回顧分析，獲得的病理組織切片可能并非新鮮的組織切片，長時(shí)間的保存，可能受其他因素影響，會(huì)導(dǎo)致檢查結(jié)果出現(xiàn)偏差，還需要在未來進(jìn)一步行前瞻性的研究加以證實(shí)并說明。且癌旁組織與肺部良性組織比較未見明顯差異；同時(shí)對(duì)比了EGFR基因突變與未突變的肺腺癌患者的臨床特征結(jié)果顯示，二者間的臨床特征比較均無明顯差異，可見腫瘤分期、性別、年齡等并不會(huì)對(duì)肺腺癌患者的EGFR基因突變產(chǎn)生影響，將突變的結(jié)果用于指導(dǎo)治療有一定價(jià)值。但需要注意的是，EGFR基因突變的檢查對(duì)實(shí)驗(yàn)室、操作人員技術(shù)、儀器等均有較高要求，在國內(nèi)仍有許多醫(yī)療機(jī)構(gòu)無法滿足該要求，故找到一種對(duì)肺癌患者EGFR基因突變有相對(duì)理想的預(yù)測價(jià)值的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，對(duì)間接預(yù)測肺癌患者EGFR基因突變、指導(dǎo)治療有著關(guān)鍵意義，這也是現(xiàn)階段臨床研究的重難點(diǎn)。

既往，有研究采用血清學(xué)檢查的方法，旨在找到可以準(zhǔn)確預(yù)測腫瘤患者EGFR基因突變的血清學(xué)標(biāo)志物，但大量的研究結(jié)果均表明了，血清學(xué)標(biāo)志物的使用雖有一定預(yù)測價(jià)值，但因肺癌具有異質(zhì)性，加之血清學(xué)受影響因素較多，故診斷的特異性不高[18-19]。IGF1R是受體腦氨酸激酶受體重要成員之一，也是IGF信號(hào)通路關(guān)鍵組成部分，研究證實(shí)，IGF在腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡過程中起到關(guān)鍵作用[20-21]。隨著臨床對(duì)該受體在腫瘤疾病中的作用的不斷深入研究，其相關(guān)的研究熱點(diǎn)現(xiàn)已發(fā)展至IGF1R泛素化、去泛素化的動(dòng)態(tài)平衡情況[22]。研究指出，IGF1R泛素化及去泛素化進(jìn)程在腫瘤的生存、死亡中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)效果，IGF1R的泛素化過程主要是對(duì)IGF1R受體內(nèi)產(chǎn)生下調(diào)之效，這一調(diào)節(jié)過程與EGFR的泛素化動(dòng)態(tài)平衡相關(guān)，此外EGFR還可以誘導(dǎo)泛素化降解[23-24]。故推測EGFR基因突變可能與IGF1R泛素化及去泛素化進(jìn)程的改變有關(guān)。同泛素化作用相反，去泛素化酶主要經(jīng)去泛素化來維持目標(biāo)蛋白穩(wěn)定[25]。Cezanne-1是一種主要在細(xì)胞信號(hào)通路信號(hào)傳遞期間起到?jīng)Q定性作用的主要去泛素化酶，作為去泛素化酶家族主要成員之一，其在細(xì)胞生命活動(dòng)過程中起到具有決定意義的調(diào)節(jié)之效[26-27]。研究證實(shí)，Cezanne-1一旦缺失將造成HIF-1α泛素化過程改變，并經(jīng)非蛋白酶體途徑加速HIF-1α的降解[28]；此外，Cezanne-1還被證實(shí)可以對(duì)HIF-2α表達(dá)有調(diào)節(jié)之效，若細(xì)胞內(nèi)Cezanne-1含量降低，細(xì)胞周期在進(jìn)入到S期與M期這一過程便會(huì)發(fā)生異常[29]。Pareja等[30]在2012年的研究中采用RNA篩查的方法，發(fā)現(xiàn)了Cezanne-1與EGFR之間的聯(lián)系，Cezanne-1是EGFR去泛素化酶，可以在信號(hào)通路內(nèi)對(duì)受體的降解產(chǎn)生抑制來促進(jìn)EGFR信號(hào)傳遞的增強(qiáng)。故推測，測定細(xì)胞組織內(nèi)Cezanne-1表達(dá)可能對(duì)預(yù)測EGFR基因突變有一定價(jià)值。

本文結(jié)果顯示，肺腺癌組織中IGF1R、Cezanne-1陽性表達(dá)率高于癌旁組織與肺部良性組織，且癌旁組織與肺部良性組織間比較未見差異，初步判斷Cezanne-1與IGF1R在肺腺癌組織中表達(dá)的特異性。進(jìn)一步分析肺腺癌組織中IGF1R、Cezanne-1陽性表達(dá)與EGFR基因突變的相關(guān)性結(jié)果顯示，三者間兩兩呈正相關(guān)。由上述結(jié)果可以推測，IGF1R、Cezanne-1導(dǎo)致的EGFR基因突變可能與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。但因研究屬于回顧性，且為了避免肺癌異質(zhì)性帶來的影響，本文僅納入了肺腺癌，加之納入的樣本量相對(duì)較少，且國內(nèi)外既往無較多的研究結(jié)果可作為循證支持依據(jù)，故結(jié)果與結(jié)論的真實(shí)性、可靠性均需要進(jìn)一步在未來行大量的前瞻性、大樣本、不同肺癌病理分型的實(shí)驗(yàn)研究加以證實(shí)。

綜上所述，肺腺癌組織內(nèi)IGF1R、Cezanne-1多呈過表達(dá)，EGFR基因突變率較其他正常組織高，且這種IGF1R、Cezanne-1的過表達(dá)與EGFR基因突變明顯相關(guān)。