葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)下的柑橘黃龍病快速診斷

翁海勇，何城城，許金釵，劉 浪，青家興，萬 亮，葉大鵬※

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，福州 350002；2. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備福建省高校工程研究中心，福州 310002；3. 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，杭州 310058）

0 引 言

柑橘黃龍?。℉uanglongbing, HLB）是由一種僅限于韌皮部內(nèi)寄生的候選韌皮部桿菌（CandidatusLiberibacter spp.）引起的細(xì)菌性病害，主要通過亞洲木虱或非洲木虱在田間傳播，具有極強(qiáng)的傳染力[1]。柑橘植株感染黃龍病后，一般經(jīng)歷從幾個(gè)月到幾年不等的潛伏期之后才會(huì)顯現(xiàn)典型的黃龍病癥狀，如斑駁黃化和紅鼻子果[2]。然而在潛伏期時(shí)，病原菌已經(jīng)在寄主樹體內(nèi)增殖，而染病樹會(huì)發(fā)展成新的傳染源，進(jìn)而引發(fā)黃龍病在果園中的擴(kuò)散。通常柑橘黃龍病菌侵染會(huì)擾亂柑橘葉片正常的糖代謝功能，導(dǎo)致葉片的淀粉和可溶性糖含量異常累積[3-4]。Albrecht等[5]研究發(fā)現(xiàn)，柑橘黃龍病病原菌會(huì)影響宿主碳水化合物代謝相關(guān)基因表達(dá)，其中涉及淀粉合成的酶（AGPase）的基因表達(dá)量被上調(diào)，然而與淀粉分解酶（β-淀粉酶）相關(guān)基因的表達(dá)則被抑制。柑橘黃龍病目前尚不能被有效根治，常用控制的策略主要包括挖除感染黃龍病樹體、減少果園木虱數(shù)量和及時(shí)噴灑農(nóng)藥等措施[6]。因此，及時(shí)、快速和準(zhǔn)確診斷感染黃龍病柑橘樹體，對果園疫情防控具有重要的意義。

目前，柑橘黃龍病診斷的方法主要包括人工經(jīng)驗(yàn)法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）。由于人工經(jīng)經(jīng)驗(yàn)判斷的方法主觀性強(qiáng)，檢測的準(zhǔn)確率僅為59%左右[7]，而PCR技術(shù)雖然準(zhǔn)確率高，但也存在檢測效率低，成本高，以及對操作人員的專業(yè)水平要求高等缺點(diǎn)。光學(xué)成像技術(shù)作為一種先進(jìn)的植物病害檢測方法，具有快速、操作簡單、無損等優(yōu)點(diǎn)，在植物病害高通量檢測中具有重要的應(yīng)用前景。Hawkins等[8]采用傅里葉紅外衰減全反射光譜儀采集了干燥柑橘葉片粉末信號，對染病葉片的識別正確率為95%。Weng等[9]采集健康和黃龍病葉片的可見/近紅外高光譜反射圖像，識別的正確率為92.6%。劉燕德等[10]利用高光譜成像技術(shù)結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法，實(shí)現(xiàn)了柑橘葉片黃龍病準(zhǔn)確率為94.4%的診斷。梅慧蘭等[11]分析了 4種不同病狀柑橘葉片高光譜反射圖像并比較了不同數(shù)據(jù)預(yù)處理方法，結(jié)果表明，經(jīng)平滑濾波（Savitzky Golay, SG）或一階微分預(yù)處理后模型得到了96.4%的判別準(zhǔn)確率。Deng等[12]利用無人機(jī)遙感高光譜成像技術(shù)分析了黃龍病病原菌對葉片光反射能力的影響，并采用支持向量機(jī)實(shí)現(xiàn)了柑橘黃龍病的快速診斷。Sankaran等[13]利用手持式熒光儀采集了健康和染病顯癥柑橘葉片的穩(wěn)態(tài)熒光信號，利用決策樹算法獲得了97%的識別正確率，但對未顯黃龍病癥柑橘葉片的識別正確率僅為48.2%。Cen等[14]采用葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)檢測柑橘黃龍病，總體正確率為 97%。盡管上述研究獲得了較好地識別效果，但僅針對的是顯現(xiàn)黃龍病癥柑橘葉片的識別。由于柑橘黃龍病致病性復(fù)雜，因此有必要從光吸收水平上探究病原菌對宿主光合作用過程中光能吸收、分配和利用的影響。

因此，本研究以感染黃龍病不同程度的柑橘葉片為研究對象，比較健康和染病葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及碳水化合物含量的差異，分析病原菌對宿主光能吸收和分配的影響及碳水化合物含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)關(guān)系，建立基于葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的柑橘黃龍病診斷模型，從而為實(shí)現(xiàn)柑橘黃龍病的快速診斷提供理論知識和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣本

為探究感染黃龍病不同程度的柑橘葉片對病原菌在光合作用水平上的響應(yīng)差異，以及建立柑橘黃龍病判別模型，本試驗(yàn)于2016年8月從浙江臨海前岙村柑橘園中選擇經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR）鑒定過的健康和染病植株各3株，并于同年的11月再次采集已經(jīng)標(biāo)記過樹體的葉片。采樣時(shí)，從每棵植株的東南西北 4個(gè)方位分別剪下 3條枝條，并立即用蘸水的棉花包住枝條的切口，裝入自封袋后放入保鮮盒，減緩枝條上的水分散失。在采集葉綠素?zé)晒鈭D像之前，再從枝條下取下葉片。本次試驗(yàn)共收集了480片柑橘葉片（240片健康和240片染病）作為研究對象。其中，染病的柑橘葉片在7月和8月份均沒有癥狀，9月到11月份葉片的斑駁黃化癥狀逐漸明顯。

1.2 葉綠素?zé)晒鈭D像采集

本研究利用葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)分析宿主在光合作用水平上對病原菌的響應(yīng)。本次試驗(yàn)所采用的葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)（FluorCam, Photon Systems Instruments, Brno,Czech Republic）主要包括分辨率為696×520 像素的CCD相機(jī)、焦距6 mm的鏡頭（VS Technology, Tokyo, Japan）、測量光和光化光1（620 nm），在距離光源20 cm位置，可均勻提供 0～306μmol/(m2·s)光強(qiáng)、飽和光（＞8 000 K），可提供 0～4 053μmol/(m2·s)光強(qiáng)、高度可調(diào)節(jié)的樣品臺、暗箱。葉綠素?zé)晒鈭D像采集前，首先對柑橘葉片進(jìn)行25 min暗適應(yīng)，以便使光合器官回到初始狀態(tài)，確保能準(zhǔn)確地測量到葉片的原初光化學(xué)反應(yīng)。光化光的強(qiáng)度設(shè)置與果園中平均光照強(qiáng)度相當(dāng)，約為100μmol/(m2·s)，飽和光強(qiáng)度則為1 500μmol/(m2·s)。本試驗(yàn)所用的柑橘葉綠素?zé)晒鉁y量程序由 PSI公司提供（https://fluorcams.psi.cz/）。圖 1顯示了本試驗(yàn)所用的柑橘葉綠素?zé)晒鉁y量程序，除了暗適應(yīng)（t=5.56 s）和穩(wěn)態(tài)時(shí)刻（Lss，t=92.24 s）分別施加1個(gè)飽和光外，在光適應(yīng)過程中的L1時(shí)刻（t=32.24 s）、L2時(shí)刻（t=42.24 s）、L3時(shí)刻（t=52.24 s）和L4時(shí)刻（t= 72.24 s）和暗弛豫過程中D1時(shí)刻（t=122.24 s）、D2時(shí)刻（t=152.24 s）和D3時(shí)刻（t=182.24 s）也分別施加了1個(gè)飽和光，飽和光的施加時(shí)間點(diǎn)如圖1所示。

圖1 葉綠素?zé)晒鉁y量程序Fig.1 Measurement procedure of chlorophyll fluorescence

1.3 葉片碳水化合物含量和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）分析

本試驗(yàn)選擇美國戴安公司的離子色譜儀進(jìn)行葉片可溶性糖含量的測量。色譜柱為Dionex CarboPACTM PA1分析柱（4 mm×250 mm）和（4 mm×50 mm）保護(hù)柱，柱溫保持30 ℃；淋洗液選擇流速為1.0 mL/min的NaOH，濃度為200 mmol/L；注入體積為10μL；檢測模式為電化學(xué)檢測。參考電極選擇Ag/AgCl；最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算葉片中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量。淀粉的含量則采用碘-淀粉顯色法。利用打孔器采集葉片對角4片面積為36.29 mm2的葉片小圓盤，去除葉綠素后，磨碎成懸浮液，煮沸，稀釋20倍后，取200μL的均勻懸浮液與15μL的2%碘液反應(yīng)，20 min后，測量595 nm的吸光度值，最后利用淀粉溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出葉片的淀粉含量。同時(shí)，采用qPCR技術(shù)對每個(gè)月份的葉片健康狀態(tài)進(jìn)行鑒定，引物為 OI1/OI2c（GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA/GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT）[15]。通過qPCR技術(shù)可以對沒有顯現(xiàn)黃龍病癥狀的柑橘葉片進(jìn)行陰性或者陽性判斷，從而為進(jìn)一步分析黃龍病對柑橘宿主光合作用的影響提供參考。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

為了使不同葉綠素?zé)晒鈪?shù)具有相同尺度，采用式（1）對原始的葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行變換。

式中F′為變換后的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，F(xiàn)為原始的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，F(xiàn)m和Fo分別為充分暗適應(yīng)后的最大熒光和最小熒光。

通過主成分分析（Principal Component Analysis,PCA）將變換后的原始葉綠素?zé)晒鈹?shù)據(jù)投影到一個(gè)新的坐標(biāo)，獲取的前幾個(gè)主成分能夠反映大部分的原始信息，且相互獨(dú)立。各個(gè)成分的載荷系數(shù)（component loading coefficient）可用于解釋各個(gè)特征與對應(yīng)因變量的關(guān)系，載荷系數(shù)絕對值越大，說明該特征對應(yīng)變量越重要[16]。因此，成分的載荷可用于分析不同的葉綠素?zé)晒鈪?shù)對黃龍病病原菌侵染的響應(yīng)。

葉綠素?zé)晒庑盘柵c植物的光合作用能力密切相關(guān)，可以反映葉片的光化光淬滅和非光化光淬滅成分。因此，從葉綠素?zé)晒鈭D像中獲取與健康葉片有區(qū)別的特征可作為判斷柑橘是否感染黃龍病的“指紋”特征。判別模型通過決策這些特征向量的歸屬，從而實(shí)現(xiàn)柑橘黃龍病的快速診斷。本研究選擇隨機(jī)森林（random forest）作為葉片中淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖的反演模型以及柑橘黃龍病的判別模型。隨機(jī)森林是由多個(gè)決策樹的分類器構(gòu)成，通過將特征變量輸入每棵樹中進(jìn)行分類，最后將若干個(gè)弱分類器的分類結(jié)果進(jìn)行投票選擇[17]。為了使得隨機(jī)森林模型具有更好的非線性擬合或者分割能力，模型中決策樹的棵數(shù)節(jié)點(diǎn)處分類屬性的個(gè)數(shù) 2個(gè)參數(shù)需要優(yōu)化。本研究設(shè)置樹的數(shù)量從 5～200，步長為 5，節(jié)點(diǎn)處分類屬性的范圍 2～98，步長為 2。采用 Kennard-Stone（KS）算法將數(shù)據(jù)集劃分成建模集和預(yù)測集。將不同的決策樹的棵數(shù)節(jié)點(diǎn)處分類屬性的個(gè)數(shù)進(jìn)行組合，用預(yù)測集的決定系數(shù)來評估模型的性能。本研究中所使用的數(shù)據(jù)預(yù)處理方法和隨機(jī)森林模型在Matlab R2010a中完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 柑橘黃龍病對柑橘葉片淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖含量的影響

圖 2顯示了健康和黃龍病柑橘葉片中淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖的含量。分析圖2a可知，感染黃龍病葉片中的淀粉含量（44.0±29.1）μg/mm2明顯高于健康葉片（20.3±5.7）μg/mm2，達(dá)到顯著性差異（P＜0.05）。染病葉片中的淀粉的異常累積與淀粉合成能力被上調(diào)，而分解能力被下調(diào)有關(guān)。文獻(xiàn)表明，當(dāng)柑橘感染黃龍病后，涉及淀粉合成酶（AGPase）的基因表達(dá)量被上調(diào)，淀粉分解酶（β-淀粉酶）的基因表達(dá)則被抑制[4]。葉片中淀粉的異常累積造成葉綠體類囊體膜裂解，影響葉綠體對光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化，降低葉片的光合作用效率[18]。

蔗糖作為光合作用另一主要產(chǎn)物，通過韌皮部從源器官轉(zhuǎn)運(yùn)到庫器官。分析圖 2b，染病柑橘葉片的蔗糖變化趨勢與淀粉的變化趨勢一致，染病葉片（3.98±2.30 ）μg/mm2中的蔗糖含量是健康葉片（2.48±1.12）μg/mm2的 1.61倍，二者差異達(dá)到顯著性水平（P＜0.05）。柑橘黃龍病病原菌的侵染引起的宿主葉片蔗糖的異常累積可能是由于韌皮部遭受損傷后，蔗糖無法順利地從源器官轉(zhuǎn)運(yùn)到庫器官。類似的現(xiàn)象也可以在僅限于韌皮部的病原菌（Phytoplasmas）侵染引起的椰子樹黃化病中觀察到[19]。進(jìn)一步分析黃龍病病原菌侵染對宿主己糖（葡萄糖和果糖）代謝的影響可知（圖2c和圖2d），染病葉片中的葡萄糖（1.50±1.01）μg/mm2和果糖（0.72±0.65）μg/mm2含量明顯高于健康葉片的葡萄糖（0.91±0.64）μg/mm2和果糖（0.38±0.30）μg/mm2，分別是健康的1.65和1.86倍。這說明蔗糖水解成己糖代謝過程已經(jīng)也受到了病原菌（CandidatusLiberibacter spp.）的影響。有文獻(xiàn)表明，微生物脅迫會(huì)使植物轉(zhuǎn)化酶的活性增加，會(huì)促進(jìn)更多的蔗糖水解成葡萄糖和果糖[20-21]。與淀粉和蔗糖相比，葡萄糖和果糖的含量在不同季節(jié)的葉片中波動(dòng)性更大，但是葡萄糖和果糖之間的含量差在染病和健康柑橘葉片中卻存在顯著性差異（P＜0.05），說明了黃龍病病原菌對果糖和葡萄糖的選擇性不同，這與韌皮部寄生的病原菌對果糖具有偏好性相一致[22]。

圖2 健康和染病柑橘葉片的淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖含量Fig.2 Starch, sucrose, glucose and fructose in healthy and citrus Huanglongbing infected leaves

2.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)對病原菌侵染的響應(yīng)分析

采用主成分分析（Principal Component Analysis,PCA）計(jì)算得到的載荷系數(shù)矩陣可反映出不同的葉綠素?zé)晒鈪?shù)對主成分的貢獻(xiàn)率，葉綠素?zé)晒鈪?shù)對應(yīng)的載荷系數(shù)絕對值越大，貢獻(xiàn)越大，說明該參數(shù)對黃龍病病原菌侵染的響應(yīng)更為敏感。前5個(gè)主成分（PC1、PC2、PC3、PC4和 PC5）的貢獻(xiàn)率分別為 41.80%、23.06%、11.92%、8.99%和4.5%，能夠表達(dá)原始變量的90.27%的信息。由于第1主成分的貢獻(xiàn)率最大，因此選擇分析第1主成分的載荷系數(shù)。由圖 3可知，充分暗適應(yīng)后的最小熒光（Fo）、可變熒光與最小熒光的比值（Fv/Fo）、光適應(yīng)和暗弛豫過程中的最小熒光（Fo_Ln/Dn），光系統(tǒng)II（Photosystem II, PSII）最大光量子效率QY_max（Fv/Fm）以及光適應(yīng)和暗弛豫過程中的 PSII最大光量子效率（Fv/Fm_Ln/Dn）以及不可調(diào)制非光化光淬滅量子產(chǎn)額（ΦNO_Ln/Dn）對病原菌侵染的響應(yīng)最為敏感。

圖3 第1主成分的載荷系數(shù)Fig.3 Loading coefficient of first principle component

選擇上述敏感葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)一步分析黃龍病病原菌對宿主光系統(tǒng) II結(jié)構(gòu)功能及原初化學(xué)反應(yīng)的影響。圖 4顯示了健康和染病的柑橘葉片在暗適應(yīng)、光適應(yīng)、穩(wěn)態(tài)和暗弛豫過程中不同時(shí)刻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。最小熒光（Fo）反映了葉綠體的光系統(tǒng)II反應(yīng)中心的結(jié)構(gòu)功能[23]。分析圖4a中健康和染病葉片的最小熒光（Fo），黃龍病病原菌的侵染致使宿主葉片的Fo上升，說明了病原菌會(huì)損傷光系統(tǒng) II反應(yīng)中心結(jié)構(gòu)，能夠阻礙激發(fā)能向光反應(yīng)中心轉(zhuǎn)移。同樣也可以發(fā)現(xiàn)染病葉片在光適應(yīng)和暗弛豫的最小熒光（Fo_Ln和Fo_Dn）高于健康葉片，在L1、L2、L3、L4、Lss、D1、D2和D3時(shí)刻分別是健康葉片的1.28、1.27、1.26、1.26、1.26、1.27、1.28和1.28倍。病原菌致使宿主Fo上升同樣可以在感染白粉病的黃瓜葉片中發(fā)現(xiàn)[24]。Fv/Fo反映了類囊體膜上光系統(tǒng)II中有活性的反應(yīng)中心的數(shù)量和尺寸，染病葉片的Fv/Fo（3.69±0.93）顯著低于健康葉片（4.51±0.88），說明黃龍病病原菌會(huì)顯著減少宿主光系統(tǒng)II中有活性的光反應(yīng)中心數(shù)量（數(shù)據(jù)未列出）。QY_max（Fv/Fm）值反映了PSII的最大光量子效率的大小，由于該參數(shù)對脅迫十分靈敏，所以被視為植物遭受脅迫的指示器，也常被用于分析脅迫引起的植物光合效率變化[25-27]。分析圖4b可知，健康和染病葉片的QY_max存在差異，染病葉片的QY_max值（0.77±0.05）低于健康葉片（0.80±0.04），說明病原菌會(huì)降低PSII的最大光量子效率。同樣也可以發(fā)現(xiàn)染病葉片在光適應(yīng)和暗弛豫的最大光量子效率（Fv/Fm_Ln和Fv/Fm_Dn）低于健康葉片，說明病原菌的侵染降低了染病葉片的光化學(xué)淬滅能力。分析不可調(diào)制非光化光淬滅量子產(chǎn)額ΦNO_Ln/Dn可知（圖 4c）。染病葉片的ΦNO_Ln/Dn顯著大于健康葉片，表明染病葉片的PSII出現(xiàn)了不可逆的損傷，受到光抑制。由于葉片將吸收的光能轉(zhuǎn)化成用于實(shí)際光合作用光量子產(chǎn)額（ΦPSII）、可調(diào)制非光化光淬滅量子產(chǎn)額（ΦNPQ）以及不可調(diào)制非光化光淬滅量子產(chǎn)額（ΦNO）。

圖4 不同時(shí)刻健康和染病葉片的最小熒光、最大光量子效率和不可調(diào)式非光化光淬滅量子產(chǎn)額Fig.4 Minimum fluorescence, maximum quantum efficiency and quantum yield of non-regulated non-photochemical energy dissipation of healthy and infected leaves at different phases

ΦNPQ_Ln/Dn對病原菌侵染的響應(yīng)敏感性低于ΦNO_Ln/Dn和ΦPSII_Ln/Dn。從三者的此消彼長的競爭關(guān)系可知，染病葉片光化學(xué)反應(yīng)效率的降低主要由于宿主受到光抑制后，將吸收的光能轉(zhuǎn)化成了不可調(diào)式非光化光淬滅量子產(chǎn)額（ΦNO），說明黃龍病病原菌能夠改變宿主葉片對激發(fā)能的分配。染病葉片光合作用效率的降低可能與光合作用相關(guān)基因如 photosystem II 5-kDa蛋白、photosystem-I subunit O和chlorophyll A-B binding家族蛋白有關(guān)的基因表達(dá)被下調(diào)有關(guān)[28]。

2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)與葉片的淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖含量的相關(guān)性分析

柑橘葉片的碳水化合物含量、葉綠素?zé)晒馓匦耘c黃龍病病原菌的侵染明顯相關(guān)，而葉片的碳水化合物含量又與葉片的光合作用有關(guān)，因此有必要進(jìn)一步分析淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖與葉綠素?zé)晒鈪?shù)之間的相關(guān)性。圖 5顯示了淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖與葉綠素?zé)晒鈪?shù)之間的Pearson相關(guān)系數(shù)。淀粉和蔗糖與葉綠素?zé)晒鈪?shù)的相關(guān)性變化趨勢較為一致，而葡萄糖和果糖與葉綠素?zé)晒鈪?shù)的相關(guān)性變化趨勢則較為一致，造成這一現(xiàn)象源于淀粉和蔗糖均屬光合作用同化物，而葡萄糖和果糖則均是蔗糖的水解產(chǎn)物。相較于蔗糖、葡萄糖和果糖，淀粉與葉綠素?zé)晒鈪?shù)的相關(guān)系數(shù)絕對值＞0.6以上的數(shù)量最多，且最高正相關(guān)系數(shù)可達(dá) 0.78，最高負(fù)相關(guān)系數(shù)可達(dá)?0.74。蔗糖、葡萄糖和果糖與葉綠素?zé)晒鈪?shù)的最高正相關(guān)系數(shù)分別可達(dá) 0.59、0.64和 0.52，最高負(fù)相關(guān)系數(shù)可達(dá)?0.56、?0.64和?0.56。相關(guān)性分析結(jié)果表明，葉綠素?zé)晒鈪?shù)與淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖具有明顯相關(guān)性，具有定量反演柑橘葉片中淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖含量的能力。

圖5 淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖與葉綠素?zé)晒庵g的Pearson相關(guān)系數(shù)Fig.5 Pearson correlation coefficient between chlorophyll fluorescence parameters and starch, sucrose, glucose and fructose concentration

2.4 柑橘葉片中淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖含量的反演

分析表 1可知，淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖樣本中的建模集均包含了最大值和最小值，且建模集和預(yù)測集對應(yīng)的含量值分布范圍較廣，建模集的含量范圍覆蓋預(yù)測集的含量范圍，不同數(shù)據(jù)集的碳水化合物含量平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差較為相近。因此按照這種方法來劃分建模集和預(yù)測集是合理的。

表1 各數(shù)據(jù)集中淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖含量的描述性統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistical characteristics of starch, sucrose, glucose and fructose

為了使隨機(jī)森林算法具有良好的分類或者回歸能力，模型中決策樹的棵數(shù)節(jié)點(diǎn)處分類屬性的個(gè)數(shù)兩個(gè)參數(shù)需要優(yōu)化。圖 6顯示了不同組合的森林中決策樹的棵數(shù)和節(jié)點(diǎn)處分類屬性的個(gè)數(shù)建立的隨機(jī)森林模型對淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖預(yù)測精度的影響。

圖6 隨機(jī)森林模型中決策樹的棵數(shù)和節(jié)點(diǎn)處分類屬性的個(gè)數(shù)對其預(yù)測能力的影響Fig.6 Effect of the number of trees and number for splitting at each node on the predicting performance of random forest model

從圖 6可以看出，森林中決策樹的棵數(shù)對模型預(yù)測能力的影響大于節(jié)點(diǎn)處分類屬性的個(gè)數(shù)。模型中決策樹的棵數(shù)從5增加至25時(shí)，淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖隨機(jī)森林模型的預(yù)測能力均得到較大幅度的提升，當(dāng)棵數(shù)＞25時(shí)，模型的預(yù)測能力逐漸趨于穩(wěn)定。通過優(yōu)化，淀粉隨機(jī)森林預(yù)測模型的決策樹的棵數(shù)和節(jié)點(diǎn)處分類屬性的個(gè)數(shù)分別為56和5時(shí)，預(yù)測集的決定系數(shù)最高，為0.91。但是進(jìn)一步分析可知，當(dāng)節(jié)點(diǎn)處分類屬性的個(gè)數(shù)出現(xiàn)微小變化時(shí)，模型的預(yù)測能力顯著降低，穩(wěn)健性不足，如決策樹的棵數(shù)為5，節(jié)點(diǎn)處分類屬性的個(gè)數(shù)分別55和57時(shí)，決定系數(shù)分別為0.81和0.83，下降了11.0%和8.4%（圖6a）。因此，淀粉隨機(jī)森林預(yù)測模型的決策樹的棵數(shù)和節(jié)點(diǎn)處分類屬性的個(gè)數(shù)分別為 38和70，為 0.90。同理，蔗糖、葡萄糖和果糖隨機(jī)模型決策樹的棵數(shù)分別為90，190和55，節(jié)點(diǎn)處分類屬性的個(gè)數(shù)則分別為52、10和18（圖6b、6c和6d）。

圖 7顯示了采用各自最佳決策樹的棵數(shù)和節(jié)點(diǎn)處分類屬性的個(gè)數(shù)建立的淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖隨機(jī)森林模型建模型和預(yù)測集的預(yù)測性能。分析采用98個(gè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)構(gòu)建的淀粉隨機(jī)森林模型可知（圖 7a），建模集和預(yù)測集的決定系數(shù)分別可達(dá)0.94和0.90，校正均方根誤差（Root Mean Square Error of Calibration Set, RMSEC）和預(yù)測均方根誤差（Root Mean Square Error of Prediction Set, RMSEP）分別為12.51和9.57μg/mm2，剩余預(yù)測偏差（Residual Predictive Deviation，RPD）可達(dá)3.43，說明模型可對柑橘葉片中淀粉含量具有極好的預(yù)測能力。分析蔗糖隨機(jī)森林模型的實(shí)測值和估測值（圖7b），建模集和預(yù)測集的決定系數(shù)和分別可達(dá) 0.96和0.84，均方根誤差分別為0.56和0.86μg/mm2，RPD可達(dá)2.50，由此說明該模型可以精確的反演柑橘葉片中的蔗糖含量。同理，葡萄糖的隨機(jī)森林模型預(yù)測結(jié)果為0.94、為 0.85、RMSEC 為 0.29μg/mm2、RMSEP 為 0.38μg/mm2和 RPD為 2.57（圖 7c）。相較于淀粉、蔗糖和葡萄糖，采用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)構(gòu)建的果糖隨機(jī)森林模型預(yù)測性能預(yù)測略低，但也仍然具有較好的預(yù)測能力，模型的為 0.94、為 0.82、RMSEC 為 0.17μg/mm2、RMSEP為0.21μg/mm2和RPD為2.39（圖7d）。上述結(jié)果表明，葉綠素?zé)晒鈪?shù)能夠較好的表征葉片碳水化合物含量，進(jìn)而說明葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)具有快速診斷柑橘黃龍病的潛力。

圖7 實(shí)測值與隨機(jī)森林模型預(yù)測值分布Fig.7 Distribution of measured values versus predicted values using random forest model

2.5 柑橘黃龍病診斷模型的構(gòu)建

黃龍病病原菌引起宿主碳水化合物代謝異常，導(dǎo)致淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖的過量累積，損傷了宿主PSII反應(yīng)中心，破壞了葉綠體的類囊體膜結(jié)構(gòu)，減少宿主光系統(tǒng)II中有活性的光反應(yīng)中心數(shù)量，導(dǎo)致宿主的光合作用效率降低。表2分別顯示了基于98個(gè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)和碳水化合物代謝參數(shù)建立的隨機(jī)森林模型總體識別正確率。基于葉綠素?zé)晒鈪?shù)建立的隨機(jī)森林模型建模集和預(yù)測集的識別正確率分別為100%和97.5%。采用淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖建立的隨機(jī)森林模型建模集和預(yù)測集的識別正確率則分別為100%和98.75%。兩種參數(shù)建立的判別模型對柑橘黃龍病的總體識別正確率相當(dāng)，說明葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)可用于柑橘黃龍病的快速診斷。

表2 基于葉綠素?zé)晒夂吞妓衔锎x參數(shù)的隨機(jī)森林模型總體識別正確率Table 2 Overall accuracies of random forest models based on chlorophyll fluorescence and carbohydrate metabolism%

3 結(jié) 論

本研究以不同染病程度柑橘葉片為研究對象，從碳水化合物代謝水平上分析探究宿主對病原菌侵染的響應(yīng)，結(jié)合葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)分析了黃龍病病原菌對宿主光合作用的影響，并建立柑橘黃龍病快速診斷模型。結(jié)果表明，病原菌致使宿主葉片淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖異常累積。病原菌損傷了宿主的光系統(tǒng) II（Photosystem II, PSII）反應(yīng)中心，改變了熒光動(dòng)力學(xué)特性，減少宿主光系統(tǒng)II中有活性的光反應(yīng)中心數(shù)量，導(dǎo)致宿主的光合作用效率降低，降低了宿主將吸收光能轉(zhuǎn)化為光化學(xué)反應(yīng)的能力。葉綠素?zé)晒鈪?shù)與葉片的淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖具有明顯的相關(guān)性。最后，采用葉綠素參數(shù)建立了隨機(jī)森林快速判別模型，實(shí)現(xiàn)了97.50%識別正確率。研究結(jié)果可為田間柑橘黃龍病的防治提供數(shù)據(jù)支撐和技術(shù)指導(dǎo)。