菌酶協(xié)同處理提高脫脂薏米水提取液營養(yǎng)價值

徐 磊，王清爽，高 珊，戴玉淇，王曉樂，陳曉明

（淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，淮安 223003）

0 引 言

薏米（Coix lachryma-jobiL.），禾本科，是一種廣泛應(yīng)用的藥食兩用資源，因其具有較高的商業(yè)價值已成為中國南方的典型經(jīng)濟作物。薏米富含蛋白、多糖、酚類、薏苡仁酯和薏米油等多種有益健康的生物活性成分[1-2]。國內(nèi)外研究證實薏米具有抗腫瘤[3]、抗炎[4]、抗過敏[5]等多種藥理活性。目前已基于薏米開發(fā)出多種高附加值的產(chǎn)品，其中薏米水提取液因具有改善皮膚粗糙、吸收紫外線、抗氧化和改善腸道菌群等多種功能，被廣泛應(yīng)用于化妝品和中藥制劑中[6-7]。

微生物發(fā)酵法作為一種傳統(tǒng)的食品加工手段，已被廣泛用于各種谷物及副產(chǎn)物的深加工，可顯著改善谷物及副產(chǎn)物的營養(yǎng)品質(zhì)[8-9]。但單一的微生物發(fā)酵，存在產(chǎn)酶量低等問題，無法滿足實際生產(chǎn)需求。采用菌酶協(xié)同發(fā)酵的方式，即在微生物發(fā)酵的同時加入一定量的蛋白酶、纖維素酶等酶制劑，可克服單獨利用微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)酶量不足的問題[10]。Sara等[11]通過在植物乳桿菌發(fā)酵扁豆的過程中添加枯草桿菌蛋白酶，顯著提高了提取物中多肽、對羥基苯甲酸和黃酮含量（P＜0.05），提取物顯示出較高的抗氧化、抗高血壓和降血糖活性。張煜等[12]研究發(fā)現(xiàn)，菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米-豆粕型飼料可顯著提高飼料中β-伴球蛋白、大豆球蛋白、中性洗滌纖維降解率。鄒俊哲等[13]研究發(fā)現(xiàn)，菌酶協(xié)同發(fā)酵可顯著降解大米蛋白，提升蛋白水解液的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制率。酶的選擇對于菌酶協(xié)同發(fā)酵效果至關(guān)重要，但上述研究多是采用指定的酶制劑進行試驗，而針對不同酶制劑對菌酶協(xié)同發(fā)酵的影響差異研究較少。

脫脂薏米作為薏米提油后的副產(chǎn)物，其水提取液已被用于化妝品、藥品等行業(yè)，但存在功能性成分提取率低等缺陷，在一定程度上限制了其應(yīng)用。采用菌酶協(xié)同方法處理脫脂薏米，研究其對脫脂薏米水提取液的影響，并考察不同蛋白酶的協(xié)同效果，國內(nèi)外尚未見報道。本試驗在干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）發(fā)酵脫脂薏米的過程中分別添加酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶等 5種常見商業(yè)蛋白酶，考察菌酶協(xié)同處理對脫脂薏米發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的降解效果，對薏米水提取液可滴定酸、還原糖、總酚、多肽、氨基酸、抗氧化活性及酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響，以期闡明菌酶協(xié)同處理對脫脂薏米水提取液營養(yǎng)品質(zhì)的影響，為薏米資源的綜合利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

脫脂薏米粉：本實驗室自制。新鮮薏米購自貴州鑫龍食品開發(fā)有限公司，去雜粉碎，過60目篩，正己烷浸泡脫脂2次（1:8，質(zhì)量體積比），40 oC烘干。所得脫脂薏米粉蛋白質(zhì)量分數(shù)為19%，淀粉質(zhì)量分數(shù)為63%。

干酪乳桿菌（1011CFU/g），山東中科嘉億生物工程有限公司；酸性蛋白酶（最佳反應(yīng)溫度為 50 ℃，pH值為4，酶活10.0×104U/g）、木瓜蛋白酶（最佳反應(yīng)溫度為50 ℃，pH值為7，酶活10.0×104U/g），寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司；中性蛋白酶（最佳反應(yīng)溫度為50 ℃，pH值為7，酶活9.5×104U/g）、堿性蛋白酶（最佳反應(yīng)溫度為50 ℃，pH值為8，酶活9.7×104U/g）、風味蛋白酶（最佳反應(yīng)溫度為50 ℃，pH值為7，酶活9.8×104U/g），諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；2,2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2′-Azino-Bis(3-Ethylbenzothiazoline-6-Sulfonic Acid) Diammonium Salt，ABTS）、奎諾二甲基丙烯酸酯（(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-Tetramethylchromane-2-Carboxylic Acid，Trolox）、酪氨酸酶、黃嘌呤氧化酶等，美國 Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗儀器

BSC-150恒溫恒濕箱，上海博迅實業(yè)有限公司；FD5-5/T冷凍干燥機，美國Labconco公司；LC-2030液相色譜儀，日本島津公司；Cary 60紫外可見分光光度計、Agilent1100及Agilent1260氨基酸分析系統(tǒng)，美國安捷倫公司。

1.3 處理方法

準確稱取30 g脫脂薏米粉，按料液比1:1（g/mL）混合均勻。按2 g/100 g薏米粉接種干酪乳桿菌，按1%加酶量添加蛋白酶（酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶），攪拌3 min，37 ℃密封發(fā)酵48 h。發(fā)酵結(jié)束后將樣品立即冷凍干燥（干燥室真空度1 Pa，48 h），粉碎過100目篩，?20 ℃儲存?zhèn)溆谩为毎l(fā)酵時只接種干酪乳桿菌而不添加任何蛋白酶。單獨蛋白酶酶解時，時間較短時效果較差，但長時間酶解易產(chǎn)生異味，因此本論文未做單獨蛋白酶酶解對照。

取3 g發(fā)酵薏米粉，加入30 mL去離子水，25 ℃振蕩提取2 h，4 ℃ 3 500×g離心10 min，收集上清液，此即為發(fā)酵薏米水提取液。

1.4 測定指標及方法

可滴定酸含量的測定：參考Oyewole等[14]的方法測定發(fā)酵薏米水提取液中可滴定酸含量，結(jié)果以每毫升含毫克乳酸表示（mg/mL）。

還原糖含量的測定：參考張小貝等[15]的方法測定發(fā)酵薏米水提取液中還原糖含量，結(jié)果以每毫升含毫克葡萄糖表示（mg/mL）。

總酚含量的測定：利用福林酚法測定總酚含量[16]。取0.2 mL提取液于離心管中，依次加入1.3 mL去離子水和0.25 mL福林酚試劑，振蕩混勻后靜置6 min，然后再分別加入0.75 mL 20% Na2CO3和2.5 mL去離子水，充分混勻后在40 ℃下黑暗處反應(yīng)2 h，于760 nm處測定吸光值x1。采用沒食子酸繪制標準曲線（y1=0.009 7x1+0.008 6，R2=0.999 7），結(jié)果以μg/mL表示。

蛋白分子量分布測定：取0.1 g發(fā)酵薏米樣品和4 mL磷酸鈉緩沖溶液（0.05 mol/L，pH值6.8，含2% SDS）于 10 mL離心管中充分混勻，室溫旋轉(zhuǎn)提取 12 h，10 000×g離心15 min，取上清液過0.45μm微孔濾膜后進行高效液相分析。條件如下：Shodex Protein KW-804 凝膠柱；流動相為0.05 mol/L磷酸鈉緩沖溶液（pH值6.8，含0.2% SDS）；柱箱溫度為30 ℃；流速0.7 mL/min，檢測波長214 nm。

多肽分子量分布測定：取0.1 mL提取液于離心管中，加入0.1 mL體積分數(shù)40%乙腈，充分混勻，經(jīng)10 000×g離心15 min后，取上清液過0.45μm微孔濾膜后進行凝膠色譜分析。條件如下：TSK gel 2 000 SWXL凝膠柱（300 mm×7.8 mm）；流動相為乙腈/水/三氟乙酸（10/90/0.1，體積比）；流速0.5 mL/min；檢測波長220 nm。

游離氨基酸組成分析：參照《食品中氨基酸的測定：GB 5009.124-2016》，分析發(fā)酵薏米水提液中的17種游離氨基酸。

鐵離子還原能力（Ferric Reducing Antioxidant Power，F(xiàn)RAP）測定[17]：取90μL提取液于離心管中，然后分別向其中加入270μL去離子水和2.7 mL FRAP試劑，混合均勻后于黑暗處室溫反應(yīng)30 min，測定593 nm處吸光值x2。采用 Trolox繪制標準曲線（y2=1.914 6x2?0.131 0，R2=0.999 3），結(jié)果以μmol/mL表示。

清除 ABTS·+（ABTS Radical Cation）能力測定[18]：取 100μL提取液于離心管中，然后向其中加入 3.9 mL ABTS·+稀釋液，混合均勻后于黑暗處室溫反應(yīng)15 min，測定 734 nm處吸光值x3。采用 Trolox繪制標準曲線（y3=?4.391x3+1.662 9，R2=0.998 7），結(jié)果以μmol/mL表示。

酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制率測定：參照Xu等[19]的方法進行水提取液的酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制率測定，無樣品組和添加樣品組的斜率分別記為S0和S1，并按如下公式計算抑制率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS 19.0軟件檢驗分析比較試驗各組間均值差異顯著性（P＜0.05），試驗結(jié)果以平均值±標準偏差表示，使用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌酶協(xié)同處理對薏米蛋白分子量分布的影響

分子排阻色譜技術(shù)可對分子量分布較寬的蛋白進行高效的分離和定量，已被廣泛應(yīng)用于多種植物蛋白生物處理過程中分子量變化的表征[20-21]。從圖 1可以看出，薏米蛋白主要集中在20.0～97.4 kDa（F2區(qū)域），而分子量高于97.4 kDa（F1區(qū)域）和低于20.0 kDa（F3區(qū)域）的蛋白較少。單獨發(fā)酵后，位于F2區(qū)域的峰2、3和4面積顯著降低，而位于F3區(qū)域的峰5面積顯著提高，說明薏米在發(fā)酵過程中高分子量的蛋白質(zhì)發(fā)生顯著降解，生成大量的多肽和氨基酸。與單獨發(fā)酵相比，添加蛋白酶均可進一步促進發(fā)酵過程中薏米蛋白的降解，菌酶協(xié)同處理后位于F2區(qū)域的峰2和3面積顯著降低，而位于F3區(qū)域的峰5、6和7面積顯著提高。其中以添加木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶的效果最佳，經(jīng)木瓜蛋白酶協(xié)同發(fā)酵后峰1、2和3基本消失。與單獨發(fā)酵相比，添加風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶可顯著提高位于F2區(qū)域的峰4，而添加酸性蛋白酶后峰4面積顯著降低，這可能是由于菌酶協(xié)同處理可以使分子量較高的蛋白質(zhì)（峰2、3）降解為分子量較低的蛋白質(zhì)（峰4），同時可以進一步降解峰4蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為F3區(qū)域的多肽和氨基酸。蛋白酶酶解具有專一性，另外固態(tài)發(fā)酵一般不對物料pH值進行控制，使部分蛋白酶無法在其最佳條件下使用，因而導(dǎo)致了不同蛋白酶在菌酶協(xié)同發(fā)酵過程中薏米蛋白降解效果的差異。孫宏[22]研究也發(fā)現(xiàn)添加蛋白酶可促進棉籽粕發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的降解，與本文結(jié)果一致。

圖1 菌酶協(xié)同處理脫脂薏米蛋白分子量分布的變化Fig.1 Changes of protein molecular weight distribution of defatted adlay by fermentation with enzyme addition

2.2 菌酶協(xié)同處理對水提取液可滴定酸、還原糖和總酚濃度的影響

菌酶協(xié)同處理對薏米水提取液可滴定酸、還原糖和總酚濃度的影響如表1所示。由表1可知，未發(fā)酵薏米水提取液的可滴定酸為0.24 mg/mL，單獨發(fā)酵后增加到3.96 mg/mL，添加蛋白酶發(fā)酵后水提取液可滴定酸顯著上升（P＜0.05），達到5.04～7.38 mg/mL。蛋白酶降解薏米蛋白產(chǎn)生的多肽和氨基酸可促進干酪乳桿菌的生長代謝，進而產(chǎn)生更多的乳酸，使體系滴定酸度提高[23-24]。未發(fā)酵薏米水提取的還原糖濃度為3.53 mg/mL，單獨發(fā)酵后上升到6.17 mg/mL，提高了74.8%。與單獨發(fā)酵相比，除了添加堿性蛋白酶組還原糖濃度（5.81 mg/mL）略有降低，其他蛋白酶添加組水提取液還原糖濃度（6.64～14.32 mg/mL）都顯著增加（P＜0.05），其中中性蛋白酶添加組增加最大，提高了132.1%。

單獨發(fā)酵后水提取液的總酚濃度由64.28μg/mL上升至100.15μg/mL，提高了55.8%。與單獨發(fā)酵相比，添加蛋白酶后水提取液總酚濃度（152.35～327.32μg/mL）均顯著增加（P＜0.05），其中酸性蛋白酶添加組增加最大，提高了226.8%。谷物中的多酚類物質(zhì)以結(jié)合態(tài)和游離態(tài)形式存在，發(fā)酵過程中顯著增強的蛋白酶、纖維素酶活力可促進結(jié)合態(tài)酚的釋放，使水提取液中總酚濃度升高[25-26]。

表1 菌酶協(xié)同處理脫脂薏米水提取液可滴定酸、還原糖和總酚濃度的變化Table 1 Changes of titratable acid, reducing sugar and total phenolic contents of defatted adlay water extract by fermentation with enzyme addition

2.3 菌酶協(xié)同處理對水提取液多肽分子量分布的影響

菌酶協(xié)同處理后薏米水提取液的多肽分子量分布如表2所示。從表2中可以看出未發(fā)酵薏米水提取液中相對分子質(zhì)量超過 5 000 Da的大分子多肽所占比例為15.37%，在單獨發(fā)酵后比例顯著降低（5.07%），添加蛋白酶發(fā)酵后比例進一步降低（0.83%～3.27%），其中添加酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶的效果最為明顯。相對分子質(zhì)量在＞3 000～5 000 Da、＞2 000～3 000 Da、＞1 000～2 000 Da的多肽在單獨發(fā)酵后比例均略有上升，而與單獨發(fā)酵相比，添加蛋白酶后此部分多肽比例均顯著降低（P＜0.05）。未發(fā)酵薏米水提取液中相對分子質(zhì)量在＞180～500 Da的多肽（二肽、三肽和四肽）為20.45%，在單獨發(fā)酵后比例顯著增加（27.45%）（P＜0.05），菌酶協(xié)同處理后此部分多肽進一步增加，添加酸性蛋白酶組比例達到50.45%。未發(fā)酵薏米水提取液中相對分子質(zhì)量低于180 Da的游離氨基酸比例達46.07%，單獨發(fā)酵后比例略有降低（42.12%），菌酶協(xié)同處理后除了添加風味蛋白酶組（46.57%）其比例均進一步降低（35.10%～41.84%）。菌酶協(xié)同發(fā)酵過程中，由于來源于菌種和外加蛋白酶的共同作用，薏米蛋白質(zhì)可被水解生成大量的多肽和氨基酸，導(dǎo)致發(fā)酵后水提取液多肽分子量分布的顯著變化。

2.4 菌酶協(xié)同處理對水提取液游離氨基酸的影響

菌酶協(xié)同處理后薏米水提取液中17種游離氨基酸（8種必需氨基酸和9種非必需氨基酸）含量如表3所示。未發(fā)酵薏米水提液總游離氨基酸質(zhì)量濃度為69.99μg/mL，經(jīng)過干酪乳桿菌發(fā)酵后水提取液總游離氨基酸為409.01μg/mL，是未發(fā)酵的 5.84倍。與單獨發(fā)酵相比，添加蛋白酶后水提取液總游離氨基酸含量都顯著提高（P＜0.05），不同蛋白酶添加組的總游離氨基酸變化趨勢與薏米蛋白分子量分布變化趨勢是一致的，其中添加酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶效果最好，總游離氨基酸質(zhì)量濃度分別為3 075.50和3 292.60μg/mL，較單獨發(fā)酵分別增加了6.52和7.05倍。發(fā)酵后水提取液中各游離氨基酸含量較未發(fā)酵前都顯著提高（P＜0.05），同時菌酶協(xié)同組各游離氨基酸含量顯著高于單獨發(fā)酵組（P＜0.05）；必需氨基酸中亮氨酸含量增加最多，單獨發(fā)酵和添加酸性蛋白酶發(fā)酵較未發(fā)酵前分別提高了 41.98和750.08μg/mL；非必需氨基酸中谷氨酸含量增加最多，單獨發(fā)酵和添加木瓜蛋白酶發(fā)酵較未發(fā)酵前分別提高了56.92和330.10μg/mL。未發(fā)酵前水提液EAA/NEAA和EAA/TFAA值分別為0.54和0.35，單獨發(fā)酵后分別增加到0.67和0.40，而添加蛋白酶發(fā)酵后值分別為0.73～1.17和0.42～0.54，菌酶協(xié)同處理顯著提高了水提取液中必需氨基酸的比例（P＜0.05）。

表2 菌酶協(xié)同處理脫脂薏米水提取液多肽分子量分布的變化Table 2 Changes of peptide molecular weight distribution of defatted adlay water extract by fermentation with enzyme addition%

表3 菌酶協(xié)同處理脫脂薏米水提取液游離氨基酸的變化Table 3 Changes of free amino acids composition of defatted adlay water extract by fermentation with enzyme addition(μg·mL-1)

2.5 菌酶協(xié)同處理對水提取液抗氧化活性的影響

薏米水提取液的抗氧化活性變化如圖 2所示，結(jié)果表明菌酶協(xié)同處理可顯著提高水提取液的 FRAP和ABTS·+清除能力。未發(fā)酵薏米水提取液的 FRAP和ABTS·+清除能力分別為0.206和0.260μmol/mL，單獨發(fā)酵后分別增加到0.330和0.406μmol/mL。與單獨發(fā)酵相比，菌酶協(xié)同處理可進一步提高水提取液的 FRAP和ABTS·+清除能力（P＜0.05），其中添加木瓜蛋白酶的效果最好，分別達到了0.629和0.683μmol/mL，而風味蛋白酶的效果最差，分別為0.439和0.514μmol/mL。菌酶協(xié)同處理過程中水提取液顯著增加的多酚、多肽和氨基酸含量都可能在一定程度上促進其抗氧化活性的提高。木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶對薏米蛋白酶解能力較強，協(xié)同發(fā)酵過程中可釋放較多的抗氧化活性物質(zhì)，因而其水提取液表現(xiàn)較高的抗氧化活性；風味蛋白酶和堿性蛋白酶對薏米蛋白酶解能力較差，協(xié)同發(fā)酵過程中釋放抗氧化活性物質(zhì)較少，水提取液抗氧化活性因而也較低。Sara等[27]研究也發(fā)現(xiàn)，相較于單獨發(fā)酵菌酶協(xié)同處理可顯著提高扁豆水溶性提取液的抗氧化活性。

圖2 菌酶協(xié)同處理脫脂薏米水提取液抗氧化活性的變化Fig.2 Changes of antioxidant activity of defatted adlay water extract by fermentation with enzyme addition

2.6 菌酶協(xié)同處理對水提取液酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響

酪氨酸酶是黑色素形成過程中的關(guān)鍵限速酶，在皮膚變黑過程中扮演著重要作用，而黃嘌呤氧化酶是尿酸合成途徑中的關(guān)鍵酶，其過量表達易引發(fā)痛風、高尿酸血癥等疾病[28-29]。薏米水提取液的酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性變化如圖 3所示，結(jié)果表明菌酶協(xié)同處理可顯著提高水提取液的酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性。菌酶協(xié)同處理后，水提取液中顯著增加的多肽、多酚等物質(zhì)都可能提高其對酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制作用[30-31]。單獨發(fā)酵后，薏米水提取液的酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性分別從 27.4%和 10.3% 增加到46.5%和22.1%。與單獨發(fā)酵相比，菌酶協(xié)同處理后水提取液的酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性進一步提高，分別達到了52.3%～58.1%和36.7%～41.5%。其中添加木瓜蛋白酶組的酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性顯著高于其他組（P＜0.05），這可能是由于木瓜蛋白酶對薏米蛋白具有較強的酶解能力，菌酶協(xié)同發(fā)酵過程中更能促進多肽和多酚等物質(zhì)的釋放。

圖3 菌酶協(xié)同處理脫脂薏米水提取液酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性的變化Fig.3 Changes of inhibitory effects of defatted adlay water extract on tyrosinase and xanthine oxidase by fermentation with enzyme addition

3 結(jié) 論

1）與單獨發(fā)酵相比，菌酶協(xié)同可促進薏米發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的進一步降解，生成大量的多肽和氨基酸。菌酶協(xié)同處理后，水提取液中多肽、還原糖和總酚濃度顯著上升（P＜0.05），分子量大于5 000 Da的多肽比例減少到0.83%～3.27%，游離氨基酸含量顯著提高（P＜0.05），必需氨基酸與非必需氨基酸比值（EAA/NEAA）達到0.73～1.17。

2）菌酶協(xié)同處理后水提取液的FRAP和ABTS·+清除能力顯著增強（P＜0.05），酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性分別達到了52.3%～58.1%和36.7%～41.5%，顯著高于單獨發(fā)酵組（P＜0.05）。

3）菌酶協(xié)同可以增強脫脂薏米水提取液的營養(yǎng)價值，使其成為更好的配料應(yīng)用在食品和化妝品等領(lǐng)域，木瓜蛋白酶相較于其他蛋白酶具有更好的協(xié)同增效作用。