食用植物酵素研究進(jìn)展

梁紅敏，劉潔，史紅梅

山東省葡萄研究院（濟(jì)南 250100）

T/CBFIA 08001-2016《酵素產(chǎn)品分類導(dǎo)則》由中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會發(fā)布，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定酵素（Jiaosu）是以植物、動物、菌類等為原料，由微生物發(fā)酵后制得的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品；食用酵素（Edible Jiaosu）以植物、動物、食用菌等為原料，由微生物發(fā)酵后制得的可食用的含有特定生物活性成分的酵素產(chǎn)品。2017年中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會發(fā)布的T/CBFIA 08003—2017《食用植物酵素》規(guī)定食用植物酵素（Edible plant source Jiaosu）是以植物為原料，由微生物（酵母菌、乳酸菌等）發(fā)酵制得的可食用的含有特定生物活性成分的酵素產(chǎn)品。

食用植物酵素是目前市場上較多的酵素產(chǎn)品類型。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全世界食用植物酵素大概有100萬t，達(dá)到了30億美元的銷售額，全球植物酵素廠家多于3 000家。在日本和我國臺灣，酵素屬于功能性食品，日本酵素行業(yè)發(fā)展較早，我國酵素產(chǎn)業(yè)正處于高速發(fā)展時期，酵素生產(chǎn)水平不斷提高，生產(chǎn)規(guī)模也在不斷擴(kuò)大，現(xiàn)在產(chǎn)品出口量增多，正在打開國際市場。食用植物酵素原料種類眾多，已成為行業(yè)發(fā)展的聚焦點(diǎn)。論述了食用植物酵素的研究進(jìn)展，包括主要微生物、發(fā)酵工藝、生物活性成分以及主要功能作用等。

1 食用植物酵素發(fā)酵微生物

酵素食品一般采用自然發(fā)酵和人工接種發(fā)酵兩種發(fā)酵工藝，人工接種發(fā)酵根據(jù)發(fā)酵劑的不同可以分為單一菌種發(fā)酵和多菌混合發(fā)酵。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在自然發(fā)酵中，酵母菌、乳酸菌和醋酸菌三種菌為常見微生物，三者之共同作用可以形成發(fā)酵產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味。

杜麗平等[1]采用PCR-DGGE技術(shù)對木瓜酵素在自然發(fā)酵過程中微生物的種類和變化進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在酵素的自然發(fā)酵過程中主要參與的微生物有植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）、類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）及不可培養(yǎng)的丙酸菌（Uncultured propionibacteriumsp.），其中植物乳桿菌為主要優(yōu)勢細(xì)菌；主要酵母有釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、假絲酵母（Candida xestobii、Candida intermedia）、畢赤酵母（Pichia guilliermondii、Komagataella phaffii、Pichia punctispora、Pichia galeiformis）、棒孢酵母（Clavisporasp.）及Cyberlindnera fabianii，其中主要占優(yōu)勢的酵母菌有釀酒酵母和畢赤酵母；Lac plantarum、Picgaleiformis分別與Uncultured propionibacteriumsp. Cybfabianii之間的親緣性較高，與其他菌之間的親緣性較小。Chicha是幾個安第斯國家從印加時代開始，用玉米發(fā)酵而成的一種飲料，主要微生物種類有釀酒酵母、乳酸菌、芽孢桿菌等，Vallejo等[2]首次應(yīng)用MALDI-TOF質(zhì)譜分析方法對Chicha發(fā)酵飲料中的酵母進(jìn)行鑒定，研究表明，所分離的酵母菌株均屬釀酒酵母菌屬。這些結(jié)果與D1/D2和5.8S-ITS區(qū)域分析結(jié)果一致。然而，與目前的釀酒酵母菌株相比，Chicha菌株的表型差異超過40%。Lee等[3]將各種水果、蔬菜、藻類和草藥的混合提取物發(fā)酵而成的飲料，針對植物發(fā)酵飲料微生物的多樣性，其采用16 S和26 S rRNA基因序列分析方法進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，主要的微生物菌群有Candida zeylanoides、Candida lactis-condensi、C.zeylanoides、C.lactis-condensi等。

近年來在酵素食品行業(yè)里，越來越多的人添加表現(xiàn)優(yōu)異的微生物進(jìn)行酵素發(fā)酵，在發(fā)酵過程中快速行成優(yōu)良的微生物生態(tài)，抑制其他雜菌和致病菌的繁殖，在發(fā)酵代謝過程中轉(zhuǎn)化成其他活性物質(zhì)和風(fēng)味產(chǎn)物。目前，常用的微生物有乳酸菌類、酵母菌及其復(fù)配菌等。洪厚勝等[4]以葡萄果渣廢棄物為原料，利用酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等多種菌種進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵得到葡萄果渣酵素。劉濤等[5]在桑葚汁中加入有益菌（酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等）發(fā)酵桑葚酵素，結(jié)果顯示，總酚含量升高，抗氧化能力增強(qiáng)。Curiel等[6]選用植物乳桿菌C2發(fā)酵桃金娘勻漿，以化學(xué)酸化勻漿為對照，未接種細(xì)菌，在相同條件下培養(yǎng)。與對照相比，發(fā)酵產(chǎn)物具有明顯的體外抗氧化活性。Kwaw等[7-8]在桑葚汁中加入多種乳酸菌（植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和副干酪乳桿菌等）發(fā)酵得到桑葚酵素，結(jié)果發(fā)酵前后桑葚汁顏色發(fā)生變化，由深紫色轉(zhuǎn)變成深紅色，總酚含量有所提高，DPPH自由基清除能力也得到提升。

2 食用植物酵素發(fā)酵工藝

2.1 工藝流程

2.2 發(fā)酵工藝條件

洪厚勝等[4]采用在釀造行業(yè)中廢棄的葡萄果渣為原料，利用優(yōu)勢微生物（酵母菌、乳酸菌、醋酸菌）進(jìn)行發(fā)酵，優(yōu)化發(fā)酵工藝條件（初始pH 5.00，糖添加量8%，活菌接種量12%，超聲時間60 min），在此條件下進(jìn)行了中試放大試驗(yàn)，采用5 L的發(fā)酵罐進(jìn)行研究，對工藝進(jìn)行改進(jìn)，得到最佳的發(fā)酵工藝條件。王振斌等[9]以葛根為原料，采用酵母菌和植物乳桿菌為發(fā)酵菌種進(jìn)行發(fā)酵，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲時間、超聲強(qiáng)度和發(fā)酵液pH對發(fā)酵微生物對產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的影響，得到葛根酵素制備最佳工藝。試驗(yàn)結(jié)果表明酵母菌、乳酸菌混合發(fā)酵葛根酵素的最佳發(fā)酵條件為：pH 4.87，超聲時間82.95 min，超聲強(qiáng)度0.14 W/cm3，試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果顯示在此發(fā)酵條件下的兩種酶的酶活實(shí)際值與預(yù)測值接近。酵素產(chǎn)品兩種酶活值分別能夠達(dá)到55.32和125.9 U/mL。王舸楠等[10]以發(fā)酵液的菌種添加比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、發(fā)酵初始pH為單因素，以總多酚含量作為響應(yīng)值通過響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝，并對發(fā)酵液進(jìn)行體外抗氧化能力測定。結(jié)果表明，添加30%葡萄汁、0.75%玫瑰花，菌種白地霉-乳酸菌（5.5∶4.5），發(fā)酵溫度33 ℃，時間48 h，在此條件下感官分值最高，總酚含量達(dá)到9.92 mg，SOD活力達(dá)到5.31×103U/L，DPPH自由基清除能力達(dá)到857 μmol/L，花青素維持在28 mg/L，因此，葡萄玫瑰花發(fā)酵液經(jīng)過發(fā)酵之后不僅感官評分得到了提高，其抗氧化性能也得到了提升。艾學(xué)東等[11]采用水果和植物研究酵素制備的發(fā)酵工藝，經(jīng)口感和色澤評定，最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間60 d，水果酵素原液與植物酵素原液后熟時的混合比例2∶1。通過正交試驗(yàn)，確定水果植物復(fù)合酵素飲料的最佳配方為∶復(fù)合酵素原液24%，白砂糖6%，蜂蜜1%。

3 食用植物酵素主要功能性成分

植物酵素含有多種活性酶類，富含花青素、兒茶素類，黃酮醇等多酚類物質(zhì)，乳酸、琥珀酸、蘋果酸等有機(jī)酸類以及氨基酸、維生素等多種營養(yǎng)成分。

3.1 主要功效酶

植物酵素的主要功效酶有蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及超氧化物酶，其中超氧化物酶常被用來評價(jià)酵素酶活的高低。李建強(qiáng)等[12]以兩種不同的原料（單一水果和果蔬混合）為對比，分別采用自然發(fā)酵和人工控制發(fā)酵，研究這兩種發(fā)酵條件下超氧化物歧化酶（SOD）酶活的變化。結(jié)果顯示，兩種酵素的SOD活性均呈現(xiàn)先升后降的趨勢；在自然發(fā)酵條件下，混合果蔬的酶活高于單一水果；添加微生物發(fā)酵酵素的SOD活性明顯提高。劉敏等[13]研究發(fā)現(xiàn)采用不用發(fā)酵方式，其不同功效酶的酶活和抗氧化能力不同。楊靖娟等[14]研究發(fā)現(xiàn)配方中不同原料的不同組合會對酵素酶活及各種有效成分的含量等主要指標(biāo)產(chǎn)生影響。

3.2 抗氧化活性成分

在植物酵素中，多種抗氧化物質(zhì)是其主要生物活性物質(zhì)之一。這些物質(zhì)主要有多酚、黃酮類物質(zhì)以及氨基丁酸等。發(fā)酵可以增加產(chǎn)品中的抗氧化成分，Curiel等[6]采用乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵桃金娘勻漿，發(fā)現(xiàn)總酚、黃酮類化合物和花青素的濃度增加，是未發(fā)酵和化學(xué)酸化處理的5～10倍，高效液相色譜分析表明，沒食子酸、鞣花酸、一些黃酮醇類物質(zhì)（楊梅素、槲皮素）含量增加，這些抗氧化化合物的釋放與植物酯酶活性密切相關(guān)。

發(fā)酵的櫻桃和石榴汁、西蘭花泥、豇豆和洋蔥富含高生物利用度的酚類衍生物，幾種酚類化合物經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化后，其抗氧化性能均優(yōu)于其前體。此外，酚類化合物的生物轉(zhuǎn)化、發(fā)酵還可能促進(jìn)其他食品性質(zhì)的改變，對人體健康產(chǎn)生積極的作用[15-17]。發(fā)酵的柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素氨基酸含量豐富，抗氧化能力都很強(qiáng)，酵素中氨基酸含量與其抗氧化性能具有正相關(guān)性[18]。糙米在酵母菌的發(fā)酵作用下發(fā)酵成糙米酵素，其中維生素B1、維生素B2和γ-氨基丁酸等微量成分含量顯著提升，研究發(fā)現(xiàn)一些微量成分具有特殊的生理功能，如降血壓、抗疲勞和促進(jìn)記憶力等[19-20]。

3.3 氨基酸和多肽類物質(zhì)

程勇杰等[18]將柘樹的小青果、花、葉按照傳統(tǒng)酵素發(fā)酵工藝制得柘樹小青果酵素、柘樹花酵素和柘樹葉酵素，測定三種酵素的氨基酸種類、含量以及抗氧化性能。結(jié)果表明：三種酵素含有豐富的氨基酸，小青果的氨基酸含量最高，分別為12.667，2.870和1.198 mg/mL，在三種酵素中，必需氨基酸占總氨基酸比例分別為32.8%，32.9%和40.0%，比值系數(shù)分別為54.31，31.65和46.49，柘樹小青果酵素的營養(yǎng)價(jià)值最高。植物經(jīng)過微生物發(fā)酵后能更多地釋放生物活性肽。植物蛋白可能是抗高血壓、抗氧化、抗肥胖、免疫調(diào)節(jié)、抗糖尿病、降膽固醇或抗癌特性的生物活性肽的優(yōu)良來源，但植物蛋白的研究卻比動物蛋白少。Kancabas等[21]發(fā)現(xiàn)boza是血管緊張素I轉(zhuǎn)化酶（ACE，一種重要的調(diào)節(jié)血壓的生理酶）抑制肽的潛在來源。Rho等[22]在發(fā)酵大豆提取物中也有此發(fā)現(xiàn)。

4 植物酵素主要生物學(xué)作用

植物酵素食品中含有豐富的營養(yǎng)成分和生物活性成分，具有抑菌、抗氧化作用，且在心血管疾病、肥胖等疾病上具有一定的預(yù)防治療效果。

4.1 抑菌作用

植物酵素本身具有抗菌的作用。王輝等[23]對青梅酵素原液的體外抑菌作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑制作用較強(qiáng)，抑菌圈直徑分別為19.9±0.56，17.2±0.15和19.0±0.3 mm。劉維兵等[24]以葡萄與海棠果為主要原材料，研發(fā)了一款發(fā)酵周期短、成本低、安全性高的酵素產(chǎn)品，結(jié)果表明該酵素具有一定的抑菌性和抗氧化活性，酵素質(zhì)量濃度為320 mg/mL時，其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌抑菌圈直徑分別為16.1±0.44，13.8±0.42和13.2±0.38 mm。

4.2 抗氧化作用

Curiel等[6]利用植物乳桿菌C2發(fā)酵桃金娘漿果（地中海地區(qū)的一種藥用芳香植物），發(fā)酵的桃金娘勻漿具有明顯的體外抗氧化活性。小鼠成纖維細(xì)胞Balb 3T3誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后，分別通過MTT和DCFH-DA測定細(xì)胞活力和自由基清除活性，證實(shí)抗氧化活性增加，乳酸菌發(fā)酵使總酚、黃酮類化合物和花青素的濃度增加。Yang等[25]以兩株植物乳桿菌為原料，對一種含有蘋果、梨和胡蘿卜的飲料進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵過程中檢測了其代謝產(chǎn)物和抗氧化活性。結(jié)果表明該酵素植物果飲料具有明顯的抗氧化活性。

蔣增良等[26]以葡萄為原料，研究了葡萄在自然發(fā)酵過程中體外抗氧化能力的變化，結(jié)果顯示，在自然發(fā)酵過程中，葡萄酵素表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，抗氧化能力不斷上升，且與酚類物質(zhì)的含量呈相關(guān)性。

陳小偉等[27]在諾麗酵素發(fā)酵過程中，取不同發(fā)酵時間的樣品，對其抗氧化能力、氨基酸含量進(jìn)行測定，且對其蛋白質(zhì)進(jìn)行營養(yǎng)評價(jià)。結(jié)果顯示，諾麗酵素中總酚含量有微量的變化，總體呈上升趨勢；3個時間點(diǎn)取樣的諾麗酵素均具有體外抗氧化能力，活性大小與濃度相關(guān)。熊巧儀等[28]以刺梨為原料，研究其抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)VC、總酚和SOD是主要的抗氧化成分，發(fā)酵結(jié)束后，殘余果實(shí)中的類胡蘿卜素、類黃酮和總酚是主要的抗氧化物質(zhì)。

4.3 與保護(hù)心血管有關(guān)的作用

Chiu等[29]將44名輕度高膽固醇血癥患者（膽固醇180～220 mg/dL）分成兩組，其中一組要求連續(xù)8周飲用60 mL植物酵素（Fermented plant extract，F(xiàn)PE，由幾種蔬菜、水果發(fā)酵而成），另一組作為對照。人體測量分別在第4，第8和第10周進(jìn)行。結(jié)果表明補(bǔ)充FPE后，體重、體脂、體質(zhì)量指數(shù)等人體測量參數(shù)顯著降低，血漿總抗氧化能力和總酚類物質(zhì)顯著增加，總膽固醇（TC）和低密脂蛋白膽固醇（LDL-c）降低。飲用FPE組有益菌（雙歧桿菌、乳酸菌）明顯增多，而有害菌（大腸桿菌、產(chǎn)氣梭菌）明顯減少。此外，F(xiàn)PE組LDL氧化延遲時間明顯改善，說明其具有抗氧化和心臟保護(hù)功能。B等[30]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵橙汁酵素能提高谷胱甘肽和尿酸水平，以及抗氧化活性、膽紅素含量和血漿抗氧化能力，改善血脂，降低氧化低密度脂蛋白和維護(hù)老鼠IL-6和C-反應(yīng)蛋白的水平，這表明發(fā)酵橙汁對健康老鼠的心血管風(fēng)險(xiǎn)因素具有更強(qiáng)的保護(hù)作用。

4.4 肥胖及其他作用

Garcia-Diaz等[31]以黑莓和藍(lán)莓混合發(fā)酵酵素，經(jīng)過高脂肪喂養(yǎng)的小鼠在喂食混合酵素后，體重和體脂含量明顯降低，而且其脂肪量、脂肪細(xì)胞平均直徑、血漿中膽固醇和甘油三酯等含量也有明顯的降低。喂食大劑量酵素明顯改善了小鼠的肝臟腫大和脂質(zhì)沉積等情況。邵穎等[32]研究表明在植物酵素減肥功效評價(jià)方面，試驗(yàn)組大鼠的體重增加量、體脂質(zhì)量及脂肪/體重比均顯著低于模型組（p＜0.05），對肥胖的大鼠，植物酵素具有很明顯的減肥作用。Dickerson等[33]研究表明一種發(fā)酵木瓜制劑（FPP），具有明確的抗氧化和免疫調(diào)節(jié)潛能。FPP可能通過特異性影響創(chuàng)傷部位巨噬細(xì)胞的反應(yīng)和后續(xù)的血管生成反應(yīng)來改善糖尿病創(chuàng)傷的結(jié)果，對FPP能糾正2型糖尿病患者外周血單核細(xì)胞呼吸破裂能力不足的觀點(diǎn)具有重要意義，因?yàn)樗淮_定是安全的，不會對患者的高血糖產(chǎn)生不良影響。

5 食用植物酵素存在問題

5.1 食用植物酵素安全性

在市場上的酵素類產(chǎn)品中，食用植物酵素是較多的產(chǎn)品類型。很多人在自然發(fā)酵條件下“自制酵素”，然而在此條件下，很可能產(chǎn)生一些雜菌和有害物質(zhì)，而且果膠經(jīng)過發(fā)酵后，還可能產(chǎn)生甲醇，容易引起食物中毒。因此，“自制酵素”會產(chǎn)生一定的風(fēng)險(xiǎn)。

5.2 功能作用遭到質(zhì)疑

近些年，對酵素功效成分的作用提出了質(zhì)疑，例如酵素產(chǎn)品中含有多種酶類，一些學(xué)者認(rèn)為絕大多數(shù)的酶類化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)經(jīng)過胃腸的消化后變?yōu)榘被嶂蟛拍鼙幌?，因此，酵素中的酶類是無法在人體內(nèi)發(fā)揮正常的功效的[34]。一些學(xué)者認(rèn)為蛋白質(zhì)也可以以短肽，甚至以蛋白質(zhì)的形式被完整吸收[35]，對于酵素功效酶是否能在人體發(fā)揮作用這方面的研究較少。另外，市場上對于酵素的功能過于夸大宣傳，容易讓消費(fèi)者產(chǎn)生誤解，目前高端產(chǎn)品主要來自進(jìn)口，產(chǎn)品主要為跟風(fēng)產(chǎn)品，多處于低端，由于缺乏相關(guān)質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)及可靠功能標(biāo)識，讓消費(fèi)者多以價(jià)識貨、以“進(jìn)口”引導(dǎo)消費(fèi)。

5.3 酵素產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)缺乏

食用植物酵素在歐洲稱之為Fortified Yeast，作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑使用。由于我國對于酵素產(chǎn)品的研究起步較晚。目前國內(nèi)酵素食品標(biāo)準(zhǔn)仍處于企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)水平，且主要引用相關(guān)常規(guī)發(fā)酵食品飲料（如醋、醬油、豆豉等）的常規(guī)感官指標(biāo)及質(zhì)量安全衛(wèi)生指標(biāo)，很少有特征或特殊指標(biāo)，尚無國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)及地方標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)建立。關(guān)于酵素產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)目前只有中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會發(fā)布的T/CBFIA 08001—2016《酵素產(chǎn)品分類導(dǎo)則》、T/CBFIA 08003—2017《食用植物酵素》以及TCBFIA 08002—2016《食用酵素良好生產(chǎn)規(guī)范》，很多酵素都是多原料多菌種發(fā)酵的產(chǎn)物，成分復(fù)雜且不易檢測等因素，形成規(guī)范的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系較為困難，導(dǎo)致國內(nèi)產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。

6 展望

6.1 發(fā)酵工藝方面

微生物的選擇方面，首先選擇國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)的、可用于食品的菌種或傳統(tǒng)上用于食品生產(chǎn)加工的菌種，保障所選發(fā)酵微生物的安全性；其次，在篩選一些菌種作為發(fā)酵劑時，應(yīng)對其進(jìn)行毒性和耐藥性安全評估。

發(fā)酵工藝方面，條件可控是發(fā)展方向，防止雜菌污染和一些有害代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，積極開發(fā)具有知識產(chǎn)權(quán)的酵素產(chǎn)品加工新工藝。

6.2 酵素產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和完善

有關(guān)酵素的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了酵素相關(guān)產(chǎn)品的術(shù)語、定義和分類，明確了食用酵素生產(chǎn)應(yīng)遵守的生產(chǎn)規(guī)范。酵素產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不夠完善，還未出臺相應(yīng)質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)，例如評價(jià)酵素產(chǎn)品質(zhì)量的主要功效的各酶活力的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。因此，科研機(jī)構(gòu)以及企業(yè)應(yīng)加大科研投入，盡早建立完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系。