檢測不同菌群發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸種類與含量

龔云霞，齊小保

湖北省武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院（武漢 430070）

作為中國飲食文化的象征，傳統(tǒng)的老面饅頭有著悠久的歷史，深受人們喜愛[1]，究其原因是獨(dú)特的發(fā)酵風(fēng)味，同時(shí)特有的微生物菌系造成發(fā)酸面團(tuán)特有的風(fēng)味[2-3]。為了厘清中國的老面中微生物構(gòu)成，系統(tǒng)研究來自湖北、河南、山東等地17份老面中的微生物菌群，發(fā)現(xiàn)主要的微生物菌群為釀酒酵母菌、植物乳桿菌、腸膜明串珠菌和戊糖乳桿菌。釀酒酵母菌在有氧條件下分解葡萄糖，生成CO2，在無氧條件下將葡萄糖分解為酒精和CO2[4]，大量CO2氣體截留于面團(tuán)中網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的面筋中，使面團(tuán)蓬松、體積膨大，經(jīng)蒸或烤之后形成疏松多孔的結(jié)構(gòu)[5]。植物乳桿菌、腸膜明串珠菌和戊糖乳桿菌在發(fā)酵過程中，可以產(chǎn)生乳酸、乙酸和丙酸等有機(jī)酸，具有改善面團(tuán)質(zhì)構(gòu)的作用，提高面團(tuán)的營養(yǎng)價(jià)值，有助于形成饅頭特有風(fēng)味[6]。

有機(jī)酸是影響?zhàn)z頭風(fēng)味的重要物質(zhì)，已有的老面發(fā)酵研究顯示有機(jī)酸的檢測方法主要有總酸測定法[7]和氣質(zhì)聯(lián)用法[8]，前者只能定性，后者難以同時(shí)分離多種有機(jī)酸，樣品處理過于繁瑣，適用范圍較窄，也有報(bào)道用離子色譜法進(jìn)行有機(jī)酸[9]的分析，但影響因素多、靈敏度低。

運(yùn)用HS-SPME-GC-MS檢測發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)已經(jīng)有大量文獻(xiàn)方法報(bào)道[10-11]，但是該方法不適用于沸點(diǎn)較高的有機(jī)酸，難以定量分析，大大限制了發(fā)酵面團(tuán)中有機(jī)酸的分析[12]。近幾年反相高效液相色譜（RPHPLC）被廣泛地應(yīng)用于有機(jī)酸的分析，具有高效、快速的分離和定量多種有機(jī)酸的優(yōu)點(diǎn)[13]，然而報(bào)道以檢測液體發(fā)酵酸奶或果酒中有機(jī)酸含量為主[14-15]，對(duì)于面團(tuán)發(fā)酵的研究報(bào)道較少。為了厘清發(fā)酵面團(tuán)中微生物菌群對(duì)于有機(jī)酸形成的種類和含量的作用，聯(lián)合使用HS-SPME-GC-MS和RP-HPLC方法檢測面團(tuán)發(fā)酵物中有機(jī)酸的方法，通過對(duì)比不同微生物菌群發(fā)酵組，檢測發(fā)酵面團(tuán)中有機(jī)酸的種類及其含量，揭示老面中菌株對(duì)有機(jī)酸形成的重要貢獻(xiàn)，篩選最佳發(fā)酵組，產(chǎn)生最佳的發(fā)酵酸味風(fēng)味，有利于開發(fā)適應(yīng)市場需求、安全和高效的復(fù)合發(fā)酵劑。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SPME裝置及萃取纖維頭（美國Supelco公司）；6890N-5975 GC-MS儀、微量進(jìn)樣器（10 μL，美國安捷倫公司）；高效液相色譜儀e2695（美國沃特世）；四元梯度輸液泵（Alliance 2695型）；進(jìn)樣器（Alliance 2695型）；紫外可見檢測器（2489型）；色譜軟件（2011年版Empower 3型）；可降溫柱溫箱。

L-乳酸（98%（T））、丙酮酸（98%（T））、琥珀酸（GCS）、磷酸（GR）、冰乙酸（HPLC）、草酸二水合物（MSDS）、丙酸（GC）、正丁酸（GC）、甲醇（HPLC）（阿拉?。涣姿岫溻洠ˋR）、氯化鈉（AR）（國藥集團(tuán)）；超純水（Milli Q）；面粉（市售，香滿園小麥粉）；YPD、MRS培養(yǎng)基（Solarbio公司）。

1.2 樣品前處理

1.2.1 菌懸液的制備

釀酒酵母菌（HBCZ J4）、植物乳桿菌（WHQS 8）、腸膜明串珠菌（GSJQ 9）和戊糖片球菌（HBJZ4）均來源研究室分離保藏。通過YPD和MRS液體培養(yǎng)基將釀酒酵母、植物乳桿菌、腸膜明串珠菌和戊糖乳桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長中期，離心收集細(xì)胞，用生理鹽水洗滌2次，重懸于生理鹽水中，并通過分光光度法調(diào)整至OD600nm=0.40，備用。

1.2.2 無菌面粉液的制備

為了模擬老面發(fā)酵規(guī)則，使用無菌面粉溶液（SFS）代替面團(tuán)。10 g/100 mL SFS制劑為：100.00 g面粉，補(bǔ)充蒸餾水至1 000 mL，攪拌均勻，調(diào)至pH 7.00，121 ℃滅菌20 min。

1.2.3 進(jìn)樣前處理

氣相色譜樣品前處理：將表1中的各組分均勻混合后37 ℃發(fā)酵至體積漲大1倍，發(fā)酵樣品用生理鹽水2倍稀釋，存放于20 mL頂空小瓶中備用。

液相色譜樣品前處理：各菌群組合發(fā)酵SFS方法同上，發(fā)酵樣品用磷酸鹽溶液2倍稀釋，4 ℃靜置提取2 h，超聲處理10 min，離心（12 000 r/min，30 min），取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，保存于液相色譜進(jìn)樣瓶備用。

表1 不同發(fā)酵組菌株組合發(fā)酵配方

1.3 氣相色譜試驗(yàn)方法

Supelco纖維支架與2 cm-50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS（Sigma）纖維共同使用。纖維在270 ℃下老化1 h，平衡20 min后，纖維暴露于氣相色譜樣品組中，纖維頭插入液體表面上1.5 cm處40 min，將纖維解吸到氣相色譜（GC）進(jìn)樣器，250 ℃下進(jìn)行5 min，于Innowax（Agilent）毛細(xì)管柱（30 m，0.32 mm，0.25 μm）上進(jìn)行分析[16]。GC分析條件：爐溫設(shè)定為40℃，保持3 min，以3 ℃/min加熱至160 ℃，以8 ℃/min加熱至220 ℃，并保持3 min；純度99.999%氦氣，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣器溫度250 ℃；噴油器以不分流模式運(yùn)行；火焰離子化檢測器檢測器操作。質(zhì)譜檢測器條件：70 eV電子能量，35 μA燈絲發(fā)射電流，230 ℃離子源溫度，150 ℃四極棒溫度，280 ℃界面溫度，30～550 AMU/s質(zhì)量掃描范圍[17]。方法獨(dú)立重復(fù)3次。

通過GC-MS分析儀進(jìn)行定性分析，并使用C6～C25正烷烴的保留時(shí)間計(jì)算每個(gè)色譜峰的保留。運(yùn)用計(jì)算機(jī)光譜（NIST05/WILE7.0）進(jìn)行初步搜索和數(shù)據(jù)分析，結(jié)合文獻(xiàn)保留指數(shù)進(jìn)行比較和手動(dòng)光譜儀分析以確認(rèn)揮發(fā)性物質(zhì)的組成，篩選發(fā)酵樣品中的有機(jī)酸種類及相對(duì)百分含量。

1.4 液相色譜試驗(yàn)方法

1.4.1 液相色譜條件

液相色譜柱：Onlysci GS-120-5-C18-AQ（4.6 mm ID×250 mm）；參照相關(guān)文獻(xiàn)，流動(dòng)相為5%CH3OH-0.02 mol/L KH2PO4（pH 2.5）溶液，進(jìn)樣量20 μL，柱溫設(shè)置25±5 ℃；流速0.5 mL/min；檢測波長215 nm。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品的選擇與制備

根據(jù)已有的報(bào)道，釀酒酵母菌單獨(dú)發(fā)酵面粉產(chǎn)生的有機(jī)酸有乙酸、乳酸[18]、丙酸和丁酸[19]，與乳酸菌混合發(fā)酵能夠產(chǎn)生丙酮酸[20]和琥珀酸[21]，在前期研究中也發(fā)現(xiàn)有草酸產(chǎn)生。因此選定乳酸、草酸、琥珀酸、丙酮酸、乙酸、丙酸和丁酸7種有機(jī)酸用于檢測方法的建立。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精確稱取0.8 g乳酸、草酸、琥珀酸，用磷酸鹽溶液定容至10 mL；丙酮酸、乙酸、丙酸和丁酸均為液體，移取適量樣品用磷酸鹽溶液定容至10 mL。由于丙酮酸、乙酸、丙酸、丁酸均為液體，均須使用NaOH溶液標(biāo)定儲(chǔ)備液濃度，采用國標(biāo)法計(jì)算濃度。通過矯正，確定混合標(biāo)準(zhǔn)液中草酸濃度0.34 mg/mL，丙酮酸濃度1.48 mg/mL，乳酸濃度13.14 mg/mL，乙酸濃度10.67 mg/mL，丙酸濃度15.29 mg/mL，丁酸濃度18.36 mg/mL，琥珀酸濃度12 mg/mL。將混合標(biāo)準(zhǔn)液分別用磷酸鹽溶液稀釋5，10，20，50，100，200，500和1 000倍，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，存于液相色譜進(jìn)樣瓶。

1.4.3 檢測方法

將不同菌株組合發(fā)酵樣品與混合有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品采用相同洗脫程序，通過保留時(shí)間、樣品加標(biāo)和各有機(jī)酸紫外吸收光譜來定性，將各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及峰面積外標(biāo)法定量，得到7種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。精密度的測定采用標(biāo)準(zhǔn)液重復(fù)測定法，回收率的測定采用加樣回收率測定法[13]，檢測獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用完全隨機(jī)化的設(shè)計(jì)來計(jì)劃研究，并且使用SPSS 22.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 HS-SPME-GC-MS檢測有機(jī)酸

圖1為發(fā)酵組5的HS-SPME-GC-MS檢測結(jié)果圖，表2展示不同發(fā)酵組中有機(jī)酸種類。HS-SPME-GCMS結(jié)果顯示發(fā)酵液能檢測到4種有機(jī)酸，分別是丙酸、丙烯酸、草酸和2-乙基己酸，前3種所有的發(fā)酵組均可檢測到，只有2-乙基己酸在4種菌種發(fā)酵組5中檢測到，說明混合發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生更多的發(fā)酵酸味。在同類型的研究中檢測到的有機(jī)酸種類有乳酸、乙酸[22]、丁酸、己酸、辛酸[23]、戊酸[24]和一些短鏈酸[25]，通過研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母與乳酸菌發(fā)酵面粉代謝產(chǎn)生有機(jī)酸主要可分為兩類：非揮發(fā)性有機(jī)酸和揮發(fā)性有機(jī)酸，但是其相對(duì)含量很低。此檢測方法并未檢測到乳酸菌發(fā)酵的特征有機(jī)酸——乳酸[26]，一方面是因?yàn)樵囼?yàn)儀器檢出限高；另一方面是由于沒有根據(jù)樣品中有機(jī)酸的不同類型構(gòu)建樣品前處理和檢測方法[27]，因此如果采用HS-SPME-GC-MS方法精確地檢測發(fā)酵液中有機(jī)酸種類及含量需要復(fù)雜的樣品處理方法，以及根據(jù)有機(jī)酸的類型調(diào)試不同的氣相檢測程序，這樣的檢測方法既不快速也不便捷。

圖1 發(fā)酵組5樣品GC-MS檢測結(jié)果

表2 HS-SPME-GC-MS檢測不同發(fā)酵組液中有機(jī)酸

2.2 RP-HPLC方法檢測有機(jī)酸

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)酸工作曲線

圖2顯示草酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、丙酸和丁酸的保留時(shí)間分別是5.806，7.785，9.773，10.42，14.08，19.713和37.75 min，7種目標(biāo)有機(jī)酸單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液或混合標(biāo)準(zhǔn)液都得到很好的分離，表3表明7種標(biāo)準(zhǔn)品有機(jī)酸的濃度與峰面積有極好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999 0。

2.2.2 精密度試驗(yàn)與加樣回收率試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)中測定7種有機(jī)酸組分色譜圖的保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），7種有機(jī)酸的保留時(shí)間的RSD值在0.02%～0.64%之間，7種有機(jī)酸的峰面積的RSD值在0.048%～0.15%之間，表明儀器精密度良好；從7種有機(jī)酸組分的回收率和RSD可以看出，7種有機(jī)酸組分回收率在94.85%～99.51%之間，7種有機(jī)酸組分的RSD在0.23%～1.94%之間，說明方法準(zhǔn)確可靠。

2.2.3 不同發(fā)酵組中有機(jī)酸含量的測定

從整體分析，對(duì)不同發(fā)酵組進(jìn)行HPLC檢測，結(jié)果如表4所示，不同菌株發(fā)酵SFS中均含有7種目標(biāo)有機(jī)酸。乳酸和乙酸含量占據(jù)整體有機(jī)酸含量的絕對(duì)多數(shù)，存在極顯著性差異（p＜0.01），為發(fā)酵液有機(jī)酸的主要組分，其中在各組發(fā)酵樣品中乳酸含量始終最高，并且產(chǎn)生有機(jī)酸含量由大到小依次是：乳酸、乙酸、丁酸、草酸和丙酮酸。在各組發(fā)酵組中，草酸與丙酮酸含量較為接近，由于發(fā)酵菌株的區(qū)別，乳酸含量的變化最為明顯，乙酸含量也有比較明顯的變化。

從各個(gè)發(fā)酵組分析，釀酒酵母利用Ehrlich途徑通過氨基轉(zhuǎn)移、脫羧和氧化還原反應(yīng)將氨基酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇和酸[28]，從表4結(jié)果可以判斷，只有釀酒酵母菌發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)生的乳酸與乙酸含量相差不大，表明釀酒酵母菌發(fā)酵時(shí)產(chǎn)乳酸與乙酸的能力相當(dāng)；對(duì)比發(fā)酵組2、3和4的有機(jī)酸結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌與戊糖片球菌的參與極顯著地提升乳酸含量（p＜0.01），可能的原因是戊糖片球菌為同型發(fā)酵乳酸菌，腸膜明串珠菌屬于異型發(fā)酵乳酸菌，而植物乳桿菌則為兼性發(fā)酵乳酸菌[29]。同型發(fā)酵僅通過EMP途徑產(chǎn)生乳酸；而異型發(fā)酵除了產(chǎn)生乳酸外，還通過PK途徑和HK途徑產(chǎn)生乙醇和二氧化碳。試驗(yàn)結(jié)果可以說明乳酸含量是與EMP途徑密切相關(guān)的，對(duì)比混合發(fā)酵組2、3、4和5，4種菌混合發(fā)酵組5產(chǎn)生的乳酸和乙酸含量最大，尤其乙酸含量相比其他3組有明顯增加，同時(shí)丙酸與丁酸含量處于適中，表明釀酒酵母菌與不同發(fā)酵類型的3種乳酸菌發(fā)酵面粉可以達(dá)到更好發(fā)酵效果。

圖2 7種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)HPLC圖譜

表3 7種標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸的回歸方程

表4 各發(fā)酵組中7種有機(jī)酸濃度

3 結(jié)論

RP-HPLC檢測不同菌株發(fā)酵面粉中有機(jī)酸的方法：采用Onlysci GS-120-5-C18-AQ（4.6 mm ID×250 mm）色譜柱，流動(dòng)相為5% CH3OH-0.02 mol/L KH2PO4（pH 2.5）溶液，流速0.5 mL/min，波長215 nm，對(duì)比分析HS-SPME-GC-MS與RP-HPLC檢測發(fā)酵面粉中常見有機(jī)酸。采用HS-SPME-GC-MS僅檢測到丙酸、丙烯酸、草酸和2-乙基己酸，有研究顯示乳酸和乙酸等低沸點(diǎn)的有機(jī)酸難以檢測到或極微弱地檢測到[30]。然而，RP-HPLC方法可同時(shí)準(zhǔn)確分離和定量測定發(fā)酵面粉中常見的草酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、丙酸和丁酸7種有機(jī)酸，方法具有較高的準(zhǔn)確度和較快的速度。通過對(duì)不同菌株組合發(fā)酵面粉產(chǎn)生有機(jī)酸檢測結(jié)果比較分析，釀酒酵母菌、植物乳桿菌、腸膜明串珠菌和戊糖片球菌混合發(fā)酵，特征性風(fēng)味乳酸和乙酸含量顯著增加，可用于制作復(fù)合發(fā)酵劑并予以推廣。