多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)化苦荬菜提取工藝及DPPH清除能力

榮榮，賈玉山，格根圖，趙牧其爾，范美超，郝俊峰

內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院（呼和浩特 010011）

蒙早苦荬菜（Lactuca indicaL. Meng zao）是菊科（Compositae）萵苣屬（Lactuca）一年生或二年生草本植物。是內(nèi)蒙古農(nóng)牧學(xué)院草原系張秀芬[1]教授等經(jīng)過很多年培育并選育出的苦荬菜新品種。近30年來，國內(nèi)外研究者對(duì)同屬植物進(jìn)行了化學(xué)成分的研究，表明其主要含有黃酮類、萜類、甾醇類物質(zhì)[2-3]?？噍げ嗽诿耖g常用于清熱止咳化痰[4]，清熱解毒[5]、抗炎殺菌[6]、抗氧化[7]、降血糖[8]等方面具有一定療效。程梁華等[9]用超聲萃取方法提取苦荬菜總黃酮成分。以及程艷剛等[10]響應(yīng)面法優(yōu)化苦荬菜總?cè)铺崛」に?。楊樹青等[7]從山苦菜提取總黃酮并提出具有一定的抗氧化活性。試驗(yàn)采用多指標(biāo)-超聲萃取方法結(jié)合正交試驗(yàn)[11-12]。基于以幼嫩期蒙早苦荬菜葉片為原料，以超聲時(shí)間、溫度、頻率、料液比為因素，紫外-分光光度法[13]測(cè)定其含量。以總黃酮、總?cè)?、?谷甾醇提取率總和為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，使用L9(34)正交試驗(yàn)法設(shè)計(jì)優(yōu)化蒙早苦荬菜活性物質(zhì)的最佳提取條件。并對(duì)最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)及測(cè)定對(duì)DPPH清除能力，為進(jìn)一步開發(fā)利用以及探究它的經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供有效的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蒙早苦荬菜，在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室牧草栽培基地種植。

黃酮標(biāo)準(zhǔn)品，蘆??；三萜標(biāo)準(zhǔn)品，齊墩果酸；甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，β-谷甾醇（上海源葉生物科技有限公司）；無水乙醇；亞硝酸鈉；硝酸鋁；氫氧化鈉；甲醇；高氯酸；香草醛；冰醋酸；抗壞血酸（VC）；DPPH（1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼）；VOSHIN-1500C智能恒溫型超聲波萃取儀（無錫沃信儀器有限公司）；UV2300Ⅱ系列雙光束紫外可見分光光度計(jì)。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 提取液制備

將幼嫩期新鮮苦荬菜取上葉片，在自然條件下晾干，之后過60目篩，準(zhǔn)確稱取1.00 g樣品用70%乙醇稀釋（根據(jù)正交試驗(yàn)料液比）、過濾、待測(cè)。

1.2.2 總黃酮的測(cè)定方法

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于105 ℃烘干箱內(nèi)干燥至恒質(zhì)量，準(zhǔn)確稱取20.00 mg，配置濃度為70%乙醇[14]充分溶解定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mL置于50 mL的容量瓶，加入2.00 mL濃度為5%的NaNO2溶液，搖勻后靜置10 min再加入2.0 mL濃度為10%的Al(NO3)3溶液，放置5 min后加入10.0 mL濃度為4%的NaOH溶液，最后用濃度為70%的乙醇定容，搖勻，以空白溶液為對(duì)照，立即用可見-紫外分光光度計(jì)在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定，測(cè)定每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣的吸光度（A）[15]，以吸光度為縱坐標(biāo)（Y），以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度關(guān)系的回歸方程為：Y=0.061 3X+0.001 7，r2=0.999 9。

將不同料液比提取液取1 mL 于50 mL容量瓶中，余下的步驟與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法相同[16]。測(cè)得吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算黃酮的含量。

1.2.3 總?cè)茰y(cè)定方法

將105 ℃下進(jìn)行充分干燥的齊墩果酸對(duì)照品精密稱取25 mg，用甲醇溶解稀釋至25 mL容量瓶中，搖勻使完全溶解，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的對(duì)照品溶液備用。分別精取質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的齊墩果酸對(duì)照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8和1 mL，置于干燥潔凈的試管中，放置室溫下完全揮盡溶劑后，于每支試管中加入高氯酸溶液1.6 mL、5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL，置于70 ℃水浴上加熱15 min，自然放冷后，加入冰醋酸5 mL，搖勻[17]。在可見-紫外分光光度計(jì)于548 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定不同濃度對(duì)照品溶液的吸光度，并進(jìn)行空白試驗(yàn)。以齊墩果酸的不同濃度為橫坐標(biāo)，吸收度A為縱坐標(biāo)，繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.086 2x+0.001 2，r2=0.999 9。

精密量取1 mL提取液用10 mL氯仿洗滌3次。于水浴上蒸干，加入5 mL甲醇溶液，于水浴上加熱并充分溶解，室溫放冷后轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，再加入甲醇溶液至刻度，混勻[18]。精密吸取上述溶液100 μL，計(jì)算齊墩果酸含量。

1.2.4β-谷甾醇測(cè)定方法

準(zhǔn)確稱取干燥至恒質(zhì)量的β-谷甾醇25.00 mg，用無水乙醇溶解，定容至25 mL，配置質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取0，20，40，60，80和100 mL的β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)液置于具塞試管中，60 ℃恒溫水浴揮干溶劑，各加5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻、密塞，60 ℃恒溫水浴15 min，立即取出流水冷卻，加冰乙酸5 mL，搖勻，室溫靜置40 min后，以不加樣品的平行樣作為空白，應(yīng)用可見-紫外分光光度計(jì)在545 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[19]，以β-谷甾醇濃度為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，作回歸曲線?；貧w方程：Y=0.230 8X+0.005 1，r2=0.999 9。

取1 mL提取液置于具塞試管中，60 ℃恒溫水浴揮干溶劑，加5%香草醛-冰乙酸溶液1 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻、密塞，60 ℃恒溫水浴15 min，立即取出流水冷卻，加冰乙酸5 mL，搖勻，室溫靜置40 min后，測(cè)定吸光度。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在參考文獻(xiàn)[20]的基礎(chǔ)上，以超聲時(shí)間（A）、超聲溫度（B）、超聲頻率（C）、料液比（D）為四因素，每個(gè)因素設(shè)置三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。優(yōu)化超聲萃取條件下總黃酮、總?cè)?、甾醇含量的變化以及提取最適條件。見表1?；贚9(34)正交試驗(yàn)將苦荬菜總黃酮提取率、總?cè)铺崛÷?、?谷甾醇提取率進(jìn)行綜合評(píng)分，評(píng)分時(shí)以各指標(biāo)的最大值為參考值，將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化后設(shè)定不同權(quán)重?？傸S酮提取率、總?cè)铺崛÷?、?谷甾醇提取率權(quán)重分別為0.35，0.25和0.4。利用綜合評(píng)分值正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果表3。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素及水平

1.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)多指標(biāo)綜合評(píng)分正交試驗(yàn)結(jié)果，稱取1.00 g粉碎樣品，根據(jù)最佳提取條件超聲萃取，平行試驗(yàn)提取3次，按1.2.2、1.2.3、1.2.4方法測(cè)定。結(jié)果見表4。

1.3.3 DPPH清除能力的測(cè)定

將苦荬菜葉片粉樣分別取0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mg，按最佳提取條件提取備用。其中分別加入2 mL 0.16 mmol/L DPPH的乙醇溶液并混勻，室溫避光放置50 min，用分光光度計(jì)在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（無水乙醇為空白）[21]，以VC溶液作為陽性對(duì)照，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，清除率計(jì)算公式如下[22-23]：

式中：Ai為2 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液的吸光度；Aj為2 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇的吸光度；Ac為2 mL無水乙醇+2 mL DPPH溶液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

在Excel數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)基礎(chǔ)上結(jié)合SAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)每個(gè)處理均3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2和表3。

根據(jù)表3綜合評(píng)分方差分析F值大小可知影響因素大小為D＞C＞A＞B。其最大影響因素為料液比（D），隨著料液比的增加綜合提取率有增加趨勢(shì)。根據(jù)p值，料液比（D）為極顯著差異（p＜0.000 1），超聲時(shí)間（A）與頻率（C）為差異高度顯著（p＜0.01），溫度（B）與其他相比差異顯著（p＜0.05）。根據(jù)表2試驗(yàn)結(jié)果，綜合評(píng)分值最大為92.70%，其相應(yīng)提取條件是A1B3C3D3。而根據(jù)K值，最佳提取條件為A2B3C1D3，即提取時(shí)間（A）為40 min，溫度（B）為60 ℃，頻率（C）為40 kHz，料液比（D）為1∶300 g/mL，為進(jìn)一步探索最佳提取條件，進(jìn)行下一步驗(yàn)證試驗(yàn)。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 綜合評(píng)分方差分析

2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最佳提取條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。見表4，最佳提取條件下黃酮提取率為4.235%、總?cè)铺崛÷蕿?.960%、β-谷甾醇提取率為8.028%，綜合評(píng)分值為99.11%，其RSD為0.34%，表明正交試驗(yàn)提取結(jié)果符合實(shí)際檢驗(yàn)結(jié)果，具有可靠性。這與屠萬倩等[24]研究結(jié)果一致。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.3 苦荬菜活性提取液DPPH清除能力

由圖1可知，在質(zhì)量濃度2～1.2 mg/L范圍內(nèi)，苦荬菜提取液和VC對(duì)DPPH的清除能力隨著濃度的增加清除能力不斷增加，趨于平緩直線。綜合來看，苦荬菜提取物具有良好的DPPH·清除能力。計(jì)算得出，IC50分別為IC50（VC）=0.006 mg/mL，IC50（苦荬菜提取液）=0.17 mg/mL。表明苦荬菜提取液DPPH清除能力比VC較弱。但根據(jù)綜合評(píng)分值來看，苦荬菜具有較好的抗氧化能力，這與太文杰等[11]研究結(jié)果一致。

圖1 苦荬菜活性提取液物對(duì)DPPH自由基清除能力

3 結(jié)論

以蒙早苦荬菜為原料，基于多指標(biāo)正交試驗(yàn)以超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲頻率、料液比為四因素進(jìn)行超聲萃取，苦荬菜主要活性物質(zhì)總黃酮、總?cè)?、?谷甾醇提取率合為綜合指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)探索苦荬菜超聲萃取最佳提取條件及抗氧化能力。根據(jù)試驗(yàn)正交試驗(yàn)綜合評(píng)分值確定超聲提取最佳條件為A2B3C1D3，即提取時(shí)間（A）為40 min，溫度（B）為60 ℃，頻率（C）為40 kHz，料液比（D）為1∶300 g/mL。綜合評(píng)分值達(dá)到99.11%。其根據(jù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果得出正交試驗(yàn)具有一定的可靠性。在此基礎(chǔ)上，分析苦荬菜提取液的綜合評(píng)分值及DPPH清除能力，結(jié)果顯示，苦荬菜具有較強(qiáng)的DPPH清除能力。通過試驗(yàn)，得出多指標(biāo)超聲萃取蒙早苦荬菜主要活性物質(zhì)具有一定的研究意義，為繼續(xù)開發(fā)研究蒙早苦荬菜活性物質(zhì)提供良好的基礎(chǔ)。