奈諾沙星對巨噬細(xì)胞特異性免疫調(diào)控作用研究

張昳馨 ， 陳楠燁， 馮美卿， 林東昉， 黃金偉， 趙 旭

喹諾酮類抗菌藥物是吡酮酸類化學(xué)合成抗菌藥物，具有4-喹諾酮結(jié)構(gòu)，因其廣譜抗菌活性在臨床廣泛應(yīng)用于各類感染的治療[1]。目前熟知的環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星等氟喹諾酮類抗菌藥物，其結(jié)構(gòu)特點為喹諾酮母核的6位均含有氟[2]。現(xiàn)已開發(fā)一系列無氟喹諾酮類新藥。奈諾沙星（nemonoxacin）作為新的無氟喹諾酮類選擇性拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑的代表，具有廣譜抗菌活性，對各種革蘭陽性菌和陰性菌、厭氧菌及非典型病原體均有良好抗菌活性，該藥的口服制劑已于2016年在中國大陸地區(qū)上市，適用于治療輕、中度成人社區(qū)獲得性肺炎[3-4]。

近年來國內(nèi)外研究顯示，氟喹諾酮類抗菌藥物對宿主的非特異性及特異性免疫均有調(diào)控作用[5-6]。如莫西沙星對脂多糖（LPS）刺激單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素（IL）-8、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-1β等均有抑制作用[7]。本課題組前期研究表明，奈諾沙星在體外和體內(nèi)試驗中均顯示對LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)具有免疫調(diào)節(jié)作用，表現(xiàn)為抑制促炎因子IL-6、TNF-α分泌，促進(jìn)抑炎因子IL-10分泌，從而抑制宿主產(chǎn)生過度免疫反應(yīng)，對宿主具有一定保護(hù)作用。同時奈諾沙星能顯著降低高劑量LPS引起嚴(yán)重內(nèi)毒素血癥小鼠的死亡率[8]。在此基礎(chǔ)上，本課題組采用流式細(xì)胞技術(shù)研究奈諾沙星對LPS誘導(dǎo)的小鼠內(nèi)毒素血癥模型中脾臟免疫細(xì)胞的影響；研究奈諾沙星對巨噬細(xì)胞吞噬功能的免疫調(diào)控作用；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測奈諾沙星對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的作用；采用免疫印跡試驗（Western blot）方法檢測奈諾沙星對細(xì)胞因子相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 RAW264.7細(xì)胞，屬小鼠單核巨噬細(xì)胞系，購自美國Thermo Fisher公司。

1.1.2 試劑 奈諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品由浙江醫(yī)藥股份有限公司提供；流式細(xì)胞技術(shù)所用抗體anti-CD16/anti-D32、太平洋藍(lán)-PE、異硫氰酸熒光素（FITC）、別藻藍(lán)蛋白（APC）等熒光標(biāo)記的CD11b、CD11c、 F4/80、 Ly6G結(jié)合抗體購自美國Bio-Rad公司；DMEM培養(yǎng)液（高糖）購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素雙抗、LPS、二甲基亞砜（DMSO）、細(xì)胞裂解液RIPA緩沖液購自美國Sigma公司；類胎牛血清購自美國HyClone公司；96孔ELISA試劑盒購自美國Bio-Rad公司；用于Western blot的10%十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺膠、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、吐溫20、TBS緩沖液均購自美國Sigma公司。二辛可寧酸（BCA）蛋白濃度檢測試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑ECL prime顯色溶液均購自美國Bio-Rad公司，p38 MAPK抗體、ERK1/2抗體、p-JNK抗體、p-100抗體（1∶1 000 稀釋）及對照β-actin抗體購自美國R&D公司。

1.1.3 實驗動物 C57BL/C小鼠，鼠齡8～10周，體質(zhì)量20～25 g，雄性，合格證號為SCXK（滬）：2017-0002，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。小鼠飼養(yǎng)溫度18～25 ℃，相對濕度50%～70%，本研究使用15只。

1.1.4 菌株 進(jìn)行巨噬細(xì)胞吞噬試驗的菌株為華山醫(yī)院臨床分離菌株肺炎克雷伯菌18-218，來源于1例呼吸機相關(guān)性肺炎患者的肺泡灌洗液，奈諾沙星對該菌株的最低抑菌濃度（MIC）為32 mg/ L。

1.1.5 儀器與軟件 LSR II流式細(xì)胞儀為BD公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞結(jié)果分析采用美國TreeStar公司FlowJo軟件。Western blot凝膠成像采用美國Bio-Rad公司凝膠成像儀。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞技術(shù)檢測奈諾沙星對小鼠脾臟免疫細(xì)胞的作用

1.2.1.1 LPS誘導(dǎo)小鼠內(nèi)毒素血癥、奈諾沙星干預(yù)及分離小鼠脾臟免疫細(xì)胞 15只小鼠隨機分為3組，每組5只：組1為正常對照組；組2為LPS組，在實驗當(dāng)日每只小鼠腹腔注射5 mg/kg LPS 200 μL，2 h后腹腔注射0.9%NaCl溶液200 μL；組3為LPS+奈諾沙星組，每只小鼠腹腔注射5 mg/kg LPS 200 μL，2 h后腹腔注射奈諾沙星40 mg/kg。6 h后統(tǒng)一處死3組小鼠。解剖小鼠，取出小鼠脾臟，迅速浸泡在PBS緩沖液中，用注射器的活塞研磨成單細(xì)胞，并通過尼龍網(wǎng)過濾成單細(xì)胞懸液。在4 ℃下300～400 g離心4～5 min，除去上清液，最后加入紅細(xì)胞裂解液1 mL裂解紅細(xì)胞，作為小鼠脾臟細(xì)胞懸液。

1.2.1.2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測小鼠脾臟巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的絕對計數(shù) 取上述3組小鼠脾臟細(xì)胞懸液20 μL，加入PBS緩沖液380 μL，采用細(xì)胞計數(shù)板在電子顯微鏡下計數(shù)。在每個流式檢測管分別加入50 μL細(xì)胞懸液（稀釋到約106/ mL），并輕輕混勻，加入10 mg/L的封閉抗體anti-CD16/CD32，封閉10 min，再加入帶有太平洋藍(lán)-PE、FITC、APC等熒光標(biāo)記的CD11b、CD11c、 F4/80、 Ly6G結(jié)合抗體冰浴下染色孵育20 min。孵育完成后，加入FACS緩沖液（每流式檢測管中加2 mL） 4 ℃下300～400 g離心5 min，棄去上清液，重復(fù)洗滌過程3次，重懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測。數(shù)據(jù)采用FlowJo軟件分析。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測小鼠脾臟髓樣細(xì)胞亞群如巨噬細(xì)胞[CD11b (+)、CD11c (-)、F4/80 (+)]、中性粒細(xì)胞[CD11b (+)、CD11c (-)、Ly6G (+)]和樹突狀細(xì)胞[CD11c (+)]等細(xì)胞的絕對計數(shù)，之后對3組小鼠進(jìn)行比較。

1.2.2 巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)與吞噬肺炎克雷伯菌試驗 自-80 ℃冰箱中取出RAW264.7細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基（含青霉素、鏈霉素雙抗），在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培育至生長約80%傳代，取4～5 代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，以約105/mL的密度接種于24孔板中培育至約80%進(jìn)行巨噬細(xì)胞吞噬肺炎克雷伯菌試驗。在實驗當(dāng)天吸去細(xì)胞培養(yǎng)基隨即放入新鮮的無血清DMEM高糖培養(yǎng)液后孵育2 h，然后按不同組別加入奈諾沙星、肺炎克雷伯菌進(jìn)行孵育。實驗分為2組：組1為奈諾沙星+肺炎克雷伯菌組，先將800 mg/L奈諾沙星溶液10 μL加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)基（奈諾沙星用無菌蒸餾水配制，奈諾沙星終濃度為8 mg/L），2 h后再加入3×108CFU/mL的肺炎克雷伯菌菌液10 μL（肺炎克雷伯菌終濃度為3×106CFU/mL）繼續(xù)培養(yǎng)；組2為肺炎克雷伯菌對照組，不加奈諾沙星，但與組1同時加入肺炎克雷伯菌菌液。加入菌液后巨噬細(xì)胞吞噬2 h，接著吸取上清液，并用PBS多次清洗，收集所有上清液，經(jīng)稀釋涂LB平皿，培養(yǎng)過夜后LB平皿菌落計數(shù)，統(tǒng)計胞外菌數(shù)量；另外此24孔板中每孔再次加入無菌蒸餾水1 mL，由于滲透壓不同，巨噬細(xì)胞會裂解并釋放出吞噬的肺炎克雷伯菌，故裂解細(xì)胞2 h后收集所有上清液，經(jīng)稀釋涂LB平皿，培養(yǎng)過夜后再次行LB平皿菌落計數(shù)，研究奈諾沙星干預(yù)后RAW264.7細(xì)胞吞噬肺炎克雷伯菌差異。

1.2.3 奈諾沙星對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路試驗 同1.2.2方法培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，以5×105/mL的密度接種于12孔板中培育至約80%進(jìn)行LPS誘導(dǎo)炎性反應(yīng)。在實驗當(dāng)天吸去細(xì)胞培養(yǎng)基隨即放入新鮮的無血清DMEM培養(yǎng)基后孵育2 h，然后按不同組別加入奈諾沙星、LPS進(jìn)行孵育。實驗分為3組：組1為奈諾沙星+LPS組，先將400 mg/L的奈諾沙星溶液20 μL加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)基（奈諾沙星用無菌蒸餾水配制，奈諾沙星終濃度為4 mg/L），2 h后再加入1 mg/ L的LPS 20 μL（LPS終濃度為10 μg/L）繼續(xù)培養(yǎng)；組2為LPS組，不加奈諾沙星，但與組1同時加入LPS；組3為空白對照組，不加奈諾沙星和LPS。巨噬細(xì)胞裂解液抽提蛋白后，根據(jù)BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定的蛋白濃度。取出部分蛋白，加入RIPA緩沖液和SDS，制備成20 μL備孔的蛋白樣品，100 ℃加熱10 min后冰浴，接著點樣至10% SDS聚丙烯酰胺膠，經(jīng)電泳及電轉(zhuǎn)膜后，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，PVDF膜采用含5%無脂牛奶的TBST（含0.1%吐溫的TBS溶液）封閉1 h，后采用TBST溶液洗滌3次，與磷酸化p38 MAPK抗體 （p-p38抗體，1∶2 000 稀釋）、磷酸化 ERK1/2抗體 （p-ERK1/2抗體，1∶2 000稀釋）、磷酸化JNK1抗體（p-JNK1抗體，1∶1 000稀釋）、p-100抗體（1∶1 000 稀釋）、對照為β-actin抗體在4 ℃共孵育過夜。采用TBST洗滌3次，加入二抗后室溫振搖2 h后，再次采用TBST洗滌3次，每張膜加入ECL prime顯色溶液，采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)檢測相關(guān)條帶。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5.0 進(jìn)行作圖和分析。實驗數(shù)據(jù)計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間計量數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 奈諾沙星對小鼠脾臟免疫細(xì)胞數(shù)量的調(diào)控作用

采用LPS（5 mg/kg）誘導(dǎo)小鼠內(nèi)毒素血癥，通過電子顯微鏡計數(shù)正常對照組、LPS組、LPS+奈諾沙星組3組小鼠的脾臟免疫細(xì)胞，圖1A示流式細(xì)胞分選過程，結(jié)果顯示3組小鼠脾臟免疫細(xì)胞總數(shù)不同（圖1B），正常對照組、LPS組、LPS+奈諾沙星組小鼠的脾臟免疫細(xì)胞總數(shù)分別為（1.84±0.13）×108/L、（6.40±1.06）×108/L 、（2.87±0.25）×108/L，即LPS組小鼠脾臟免疫細(xì)胞數(shù)最高，平均值是正常小鼠的3.5倍，LPS+奈諾沙星組小鼠免疫細(xì)胞均值也較正常小鼠高，是正常小鼠的1.6倍，但明顯低于LPS組（降低55.1%），LPS組與LPS+奈諾沙星組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.012），提示LPS能引起小鼠炎性反應(yīng)，小鼠脾臟內(nèi)免疫細(xì)胞數(shù)量明顯增多，而奈諾沙星可以抑制免疫細(xì)胞的數(shù)量增多，即抑制炎性反應(yīng)。圖1C示3組小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示對照組、LPS組、LPS+奈諾沙星組小鼠脾臟巨噬細(xì)胞數(shù)量分別為（5.47±0.15）×105/L、（3.25±0.68）×106/L、（1.20±0.06）×106/L，

LPS組巨噬細(xì)胞數(shù)量仍為最高，均數(shù)值是正常小鼠的5.9倍，LPS+奈諾沙星組小鼠巨噬細(xì)胞數(shù)量均值較正常小鼠有升高，是正常小鼠的2.2倍，但明顯低于LPS組（降低63.1%），LPS組與LPS+奈諾沙星組組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.017）。圖1D示3組小鼠中性粒細(xì)胞數(shù)量，對照組、LPS組和LPS+奈諾沙星組分別為（6.67±0.11）×105/ L、（5.46±1.77）×106/ L和（5.13±0.96）×106/L， LPS與LPS+奈諾沙星兩組小鼠中性粒細(xì)胞數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。圖1E示3組小鼠樹突狀細(xì)胞數(shù)量，對照組、LPS組和LPS+奈諾沙星組分別為（4.86±0.11）×106/L、（2.76±1.20）×107/ L和（9.36±1.63）×106/L， LPS+奈諾沙星組小鼠樹突狀細(xì)胞均值較LPS組也明顯降低（降低66.1%），且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.01），這一結(jié)果提示當(dāng)LPS引起小鼠炎性反應(yīng)時，小鼠脾臟中的各種免疫細(xì)胞數(shù)量會明顯上升，而奈諾沙星對于小鼠脾臟中免疫細(xì)胞數(shù)量增加有明顯抑制作用，且奈諾沙星的抑制作用有特異性，主要作用于巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，對中性粒細(xì)胞基本無抑制作用。

圖1 流式細(xì)胞技術(shù)檢測小鼠脾臟免疫細(xì)胞數(shù)量Figure 1 Population of immune cells in spleen by flow cytometry

2.2 奈諾沙星對巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬肺炎克雷伯菌的影響

巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬肺炎克雷伯菌試驗中，加入無菌蒸餾水后2 h由于滲透壓不同，巨噬細(xì)胞會裂解并釋放出吞噬的肺炎克雷伯菌，檢測有無奈諾沙星干預(yù)的兩組胞內(nèi)菌菌落計數(shù)，各組均檢測了6個巨噬細(xì)胞樣本，結(jié)果如圖2所示。其中奈諾沙星+肺炎克雷伯菌組胞內(nèi)菌計數(shù)為（4.12±2.10）×103CFU/mL，而肺炎克雷伯菌組胞內(nèi)菌計數(shù)為（2.08±1.09）×103CFU/mL，奈諾沙星+肺炎克雷伯菌組菌落計數(shù)均數(shù)是肺炎克雷伯菌組的2.0倍，兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.047），結(jié)果顯示當(dāng)奈諾沙星存在時，巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬入胞內(nèi)的肺炎克雷伯菌數(shù)量增加1.0倍，提示奈諾沙星可以提高巨噬細(xì)胞的細(xì)菌吞噬能力。

圖2 奈諾沙星+肺炎克雷伯菌組和肺炎克雷伯菌組巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌計數(shù)Figure 2 Count of the bacteria engulfed by macrophages after treatment with nemonoxacin + K. pneumoniae or K. pneumoniae alone

2.3 奈諾沙星對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控作用

采用Western blot方法研究奈諾沙星對IL-6、TNF-α的抑制作用主要依賴于MAPK還是NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路途徑，結(jié)果見圖3。本試驗采用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)模型，加以奈諾沙星干預(yù)后，檢測MAPK通路的p-p38 MAPK、p-JNK1、ERK1/2，NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的p-100蛋白表達(dá)水平。Western blot結(jié)果顯示對于p-p38 MAPK的表達(dá)，在LPS作用后3 h，LPS組與LPS+奈諾沙星組p-p38 MAPK表達(dá)水平類似，而在LPS作用后6 h，LPS組表達(dá)水平明顯較LPS+奈諾沙星為強，在12 h兩組又基本相同；對于p-JNK1，LPS作用后3 h，LPS組與LPS+奈諾沙星組p-JNK1表達(dá)水平類似，而在LPS作用后6 h，LPS組表達(dá)水平明顯較LPS+奈諾沙星為強，在12 h，LPS組較LPS+奈諾沙星組p-JNK1表達(dá)水平仍高，但兩組差異變??；對于MAPK通路的另一家族成員ERK1/2，LPS作用后3、6、12 h，LPS組與LPS+奈諾沙星組ERK1/2的表達(dá)水平基本相同；檢測 NF-κB其p-52亞基的前體形式p-100，LPS作用后3、6、12 h，LPS組與LPS+奈諾沙星組p-100的表達(dá)水平基本相同。提示奈諾沙星對IL-6、TNF-α的抑制作用主要還是依賴于MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路途徑，奈諾沙星可能通過抑制p-p38 MAPK、p-JNK1的表達(dá)，進(jìn)而抑制IL-6等促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，從而抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的炎性反應(yīng)。奈諾沙星在LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)時，抑制NF-κB表達(dá)的作用不強，推測NF-κB不是奈諾沙星抑制巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路途徑。

圖3 Western blot方法檢測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Figure 3 Western blot assay of signal transduction pathways

3 討論

奈諾沙星是一種新型無氟喹諾酮類抗菌藥物，具有良好的抗菌活性，在臨床上得以廣泛應(yīng)用[9]。本課題組前期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，奈諾沙星具有一定的免疫介導(dǎo)作用，體內(nèi)、體外試驗均顯示奈諾沙星對LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)有抑制作用，表現(xiàn)為抑制IL-6、TNF-α等促炎因子的分泌，促進(jìn)IL-10等抑炎因子的分泌；并且奈諾沙星能降低LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥小鼠的病死率，保護(hù)作用達(dá)60%[8]。但以上前期實驗僅僅是研究奈諾沙星免疫調(diào)控作用的初步試驗，即藥物對細(xì)胞因子的作用。但奈諾沙星是否對巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞具有特異性免疫抑制作用，是否能增強巨噬細(xì)胞的吞噬能力，以及奈諾沙星抑制IL-6等促炎細(xì)胞因子是否依賴于MAPK或NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路途徑未見相關(guān)研究報道，課題組就以上問題進(jìn)行了深入研究。

本研究采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測LPS組和LPS+奈諾沙星組小鼠脾臟髓樣細(xì)胞亞群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠腹腔注射LPS后，會誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，處死小鼠后分離小鼠脾臟免疫細(xì)胞，可以看到無論免疫細(xì)胞總量、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞都較正常小鼠有明顯上升，達(dá)到正常小鼠的3.6～8.2倍，而LPS+奈諾沙星組以上免疫細(xì)胞數(shù)量較正常小鼠有所上升，但免疫細(xì)胞總量、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞數(shù)量較LPS組有明顯降低，其中免疫細(xì)胞總量下降55.1%，巨噬細(xì)胞數(shù)量下降63.1%，樹突狀細(xì)胞數(shù)量下降66.1%，而中性粒細(xì)胞數(shù)量兩組相仿，無明顯差異。這一結(jié)果提示奈諾沙星能夠抑制LPS誘導(dǎo)小鼠的炎性反應(yīng)，且能夠抑制小鼠脾臟中與炎性相關(guān)的免疫細(xì)胞數(shù)量上升，但此種免疫抑制作用有特異性，即奈諾沙星特異性地抑制小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的數(shù)量，而對中性粒細(xì)胞基本無抑制作用，但奈諾沙星的抑制作用是抑制髓樣細(xì)胞亞群的增殖還是減少趨化因子的分泌、抑制免疫細(xì)胞在脾臟等炎癥部位的聚集需要進(jìn)一步研究證實。

本研究通過體外試驗檢測了奈諾沙星對巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬肺炎克雷伯菌功能的影響，結(jié)果顯示8 mg/L奈諾沙星可以提高巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬肺炎克雷伯菌的能力，加入奈諾沙星2 h后，巨噬細(xì)胞吞噬入胞內(nèi)的肺炎克雷伯菌數(shù)量增加1.0倍，這一結(jié)果提示奈諾沙星可提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力。其他氟喹諾酮類藥物也有類似的研究結(jié)果，如采用0.5 MIC加替沙星對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞預(yù)處理，該藥能顯著增強巨噬細(xì)胞的吞噬并提高細(xì)胞內(nèi)殺菌能力。半體內(nèi)試驗即小鼠靜脈給加替沙星20 mg/kg，收集腹腔巨噬細(xì)胞體外測定對細(xì)菌的吞噬作用，結(jié)果表明也有增強作用 [10]。

本課題組既往研究結(jié)果提示奈諾沙星對LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)有抑制作用，表現(xiàn)為抑制IL-6的分泌[8]，相關(guān)研究顯示與IL-6相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要為LPS與炎性細(xì)胞表面受體結(jié)合后，通過Toll樣受體4（TLR4），激活I(lǐng)L-1受體連接的蛋白激酶（IRAK），從而激活MAPK或NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[11-12]，其中MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路又包括ERK、JNK和p-38 MAPK等蛋白[13]。本研究仍采用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)，通過Western blot方法檢測奈諾沙星+LPS及LPS組 ERK、JNK、p-38 MAPK以及NF-κB等蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示奈諾沙星主要抑制p-p38 MAPK、p-JNK的表達(dá)，對JNK及NF-κB抑制作用不強，推測p-p38 MAPK、p-JNK是奈諾沙星抑制LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)主要依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路途徑而非NF-κB。國外相關(guān)報道顯示其他氟喹諾酮類抗菌藥物對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控作用與奈諾沙星不同[14]，如莫西沙星既通過抑制NF-κB的活性起到抗炎效應(yīng)，也能抑制LPS刺激后引起的ERKl/2、p-JNKl/2的活性增強[15]，這與奈諾沙星明顯不同。

以上研究結(jié)果是在前期研究基礎(chǔ)上更加深入地研究了奈諾沙星的免疫調(diào)控作用機制，結(jié)果提示奈諾沙星能夠抑制小鼠脾臟中與炎性相關(guān)的免疫細(xì)胞數(shù)量上升，同時可以顯著提高巨噬細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬功能，這將可能有助于重癥感染性疾病患者免疫功能的改善，并提高疾病治療的有效率和治愈率，降低宿主的病死率。應(yīng)在動物實驗及臨床研究中進(jìn)一步驗證奈諾沙星對感染炎性反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用的獲益。