NIX在機(jī)械牽張誘導(dǎo)的急性肺損傷中的表達(dá)及其嚴(yán)重程度的相關(guān)性

賴志遠(yuǎn) 劉振玉 李修江 周強(qiáng)平

胸部創(chuàng)傷作為目前較為常見的急癥之一，它是直接或間接引起急性肺損傷(acute lung injury, ALI)的最重要因素，且已經(jīng)成為創(chuàng)傷患者早期死亡的主要原因，已超過創(chuàng)傷患者早期死亡病例的50%[1]。肺作為胸部創(chuàng)傷中最常累計的部位，若早期的肺組織創(chuàng)傷得不到有效的處理，將進(jìn)一步誘發(fā)急性肺損傷[2]，而有大約3.6%的胸部外傷患者將發(fā)展成急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)[3]；嚴(yán)重的肺組織損傷后，將使得肺通氣及氧彌散功能障礙，肺順應(yīng)性急劇下降，肺泡萎縮，通氣比例失調(diào)等一系列病理改變，導(dǎo)致ARDS的發(fā)生；甚至繼續(xù)惡化，最終發(fā)生多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，最終威脅生命安全[4-5]。ALI的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，就目前所知，肺組織損傷后引起的一系列以血管通透性改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的全身炎癥級聯(lián)反應(yīng)及肺組織缺血缺氧后肺泡上皮細(xì)胞的凋亡都在急性肺損傷的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[6-8]。Nix作為一種促凋亡蛋白，研究發(fā)現(xiàn)Nix蛋白在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(AT-Ⅱ細(xì)胞)的凋亡途徑中發(fā)揮了重要作用[9]。本研究以大鼠撞擊傷模型及肺泡上皮細(xì)胞為研究對象，通過統(tǒng)計不同肺組織中Nix RNA及Nix蛋白的表達(dá)情況，探討Nix在機(jī)械牽張誘導(dǎo)的急性肺損傷中的表達(dá)及其嚴(yán)重程度的相關(guān)性，并為進(jìn)一步探明Nix在胸部撞擊傷后誘導(dǎo)急性肺損傷的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實驗材料

選取8～10周齡雄性SD大鼠若干只，體重(250±20)g，購自南昌大學(xué)動物實驗室，在室溫25 ℃、45%濕度、12 h自然光照的標(biāo)準(zhǔn)條件下自然喂養(yǎng)。實驗開始前禁食8 h，正常飲水，保持周圍環(huán)境安靜無任何干擾。參考相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]，利用BIM-Ⅱ型多功能小生物撞擊機(jī)對大鼠進(jìn)行精準(zhǔn)胸部撞擊后處死大鼠以建立不同程度的大鼠胸部撞擊模型，再結(jié)合AIS分級法將大鼠撞擊模型分為輕傷、重傷、嚴(yán)重傷三個不同肺傷情組，每組按損傷標(biāo)準(zhǔn)各納入10只大鼠，另選取10只不予處理作為實驗對照組。

山羊血清(美國Gibco公司)，PBS緩沖液(美國Gibco公司)山羊兔抗(上海斯信公司)，兔抗人單抗(上海斯信公司)，HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(上海斯信公司)，F(xiàn)ast-Plus EvaGreen熒光定量PCR試劑盒(美國ABI公司)，SDS-PVDE凝膠電泳試劑盒(上海斯信公司)，ECL發(fā)光試劑盒(上海斯信公司)，其他常規(guī)國產(chǎn)分子生物學(xué)實驗耗材等；BIM-Ⅱ型多功能小生物撞擊機(jī)(參考陸軍軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所)，PCR儀(美國ABI公司)，顯微成像系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)，凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國BIOTOP公司)，超高速低溫離心機(jī)(上海安亭公司)，其他國產(chǎn)常規(guī)儀器等主要設(shè)備

二、觀察指標(biāo)

1.免疫組化觀察：大鼠處死后取肺組織，先用生理鹽水沖洗，再用4%多聚甲醛灌注固定24 h，置于不同濃度的酒精中再脫水；取肺組織進(jìn)行石蠟包埋并制成5um厚等組織切片置于載玻片上。再用二甲苯化蠟，之后將石蠟切片置于梯度乙醇中脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)修復(fù)抗原5 min。0.3% H2O2室浸泡15 min，PBS沖洗5 min 2次，后用5%～10%正常山羊血清封閉，室溫孵育20 min，傾去血清。滴加生物素標(biāo)記的Nix抗體，4 ℃孵育過夜，并于PBS代替NIX抗體處理切片作為隱形對照組。PBS沖洗后滴加生物素標(biāo)記的TNF-α抗體，37 ℃水浴箱孵育20 min。再次PBS沖洗5 min 3次，DAB顯色10 min，之后蘇木素復(fù)染并脫水后用中性樹脂封片。在光鏡下觀察鏡片上棕色區(qū)域的分布，用image-pro plus6.0軟件分析各組織中棕色區(qū)域的IOD值。

2.肺組織病理學(xué)觀察：剛致死大鼠肺組織，先用生理鹽水沖洗，再灌注4%多聚甲醛固定24 h，石蠟連續(xù)切片，厚度約為5 μm然后用二甲苯化蠟，再經(jīng)由高濃度到低濃度的乙醇水合后進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色5min，再脫水后用中性樹脂封片。電鏡下觀察不同時間肺組織病理學(xué)變化。

3.RT-PCR 檢測Nix在mRNA水平表達(dá)：肺組織離體模型建立參考相關(guān)文獻(xiàn)[11]。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行不同時間點(diǎn)各模型組待檢測細(xì)胞總RNA的提取；Nix引物序列：上游：5′-ATG TCT CAC TTA GTC GAG CCG-3′,下游：5′-CTC ATG CTG TGC ATC CAG GA-3′；再根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書立即進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄，以β-actin為內(nèi)參，反應(yīng)條件：第一階段反轉(zhuǎn)錄：42 ℃ 15 min，85 ℃ 10 s；第二階段PCR：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。

4.Western Blot 檢測NIX在蛋白水平表達(dá)：取不同肺部損傷程度的AT-Ⅱ細(xì)胞培養(yǎng)株，倒掉培養(yǎng)液，加入4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞株3次，吸盡PBS后將培養(yǎng)瓶置于冰上。向各細(xì)胞株中加入含1%苯甲基磺酰氟的裂解液，在冰上裂解30 min，于4 ℃超高速低溫離心機(jī)上以1 200 r/min離心20 min，將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至離心管中于-80 ℃保存?zhèn)溆?。BCA法測定上清液中BNIP3蛋白濃度，SDS-PVDE凝膠電泳分離目的蛋白并用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉液孵育2 h。4 ℃過夜孵育兔抗NIX一抗，之后用TBST洗3次，每次10 min，將PVDF膜在兔抗一抗中室溫孵育1 h，用同樣方法將HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗與PVDF膜接觸。用ECL發(fā)光液顯影并曝光，以β-actin作為內(nèi)參，使用其曝光的灰度值來表示Nix蛋白的相對表達(dá)值。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、大鼠肺組織病理學(xué)結(jié)果

模型大鼠胸部撞擊傷0.5、2、12、24、48、72 h后各組大鼠肺組織內(nèi)血管及肺泡壁毛細(xì)血管均出現(xiàn)擴(kuò)張充血，雙肺出現(xiàn)不同程度的增大、肺水腫，肺泡腔及肺泡間隔之間可見大量液體及紅細(xì)胞滲出，并可見大量的炎性細(xì)胞浸潤。以撞擊傷后48 h這一變化較為明顯，見圖1。

圖1 撞擊傷后48 h大鼠肺組織病理學(xué)變化情況

二、肺組織中Nix mRNA及Nix蛋白的表達(dá)情況

與對照組相比，在撞擊0.5、2、12、24、48、72 h后，各模型組大鼠肺組織中Nix mRNA都存在較為明顯增高，Nix mRNA在傷后0.5 h開始增高，并在撞擊48 h后Nix的表達(dá)達(dá)到峰值，撞擊傷后72 h已有顯著下降(P<0.05)。同樣的，與對照組相比，各時間點(diǎn)各模型組大鼠肺組織中Nix蛋白表達(dá)同樣在傷后0.5 h開始增高，48 h達(dá)到峰值，72 h顯著下降(P<0.05)。見圖2，表1、2。

圖2 免疫組化、Western Blot和RT-PCR檢測；注：A：免疫組化法檢測Nix在致傷組肺組織中的表達(dá)(SP法，DAB顯色，×400)；B：RT-PCR檢測Nix mRNA表達(dá)情況；C：Western Blot檢測Nix蛋白的表達(dá)情況

表1 Nix mRNA表達(dá)情況與肺組織損傷程度的關(guān)系

三、肺組織中Nix的表達(dá)情況和肺組織損傷程度的相關(guān)性結(jié)果

由表1、表2可知，在0～48 h這段時間內(nèi)，隨著撞擊傷嚴(yán)重程度的提升，Nix mRNA表達(dá)水平也呈相應(yīng)的增高(P<0.05)。同樣的，大鼠肺組織Nix蛋白表達(dá)水平也隨撞擊傷嚴(yán)重程度的增高而增高(P<0.05)。由此可得出結(jié)論，在一定時間內(nèi)，Nix的表達(dá)情況與肺損傷程度成正相關(guān)關(guān)系。

表2 Nix蛋白表達(dá)情況與肺組織損傷程度的關(guān)系

討 論

胸部撞擊傷作為臨床常見的一種疾病類型，是創(chuàng)傷所致死亡的第二大病因，傷者主要表現(xiàn)為不同程度的呼吸衰竭、血流動力學(xué)不穩(wěn)定、肺部出血水腫，部分患者可能在傷后24～48 h引發(fā)ARDS，而呼吸窘迫綜合征則可進(jìn)一步加重患者病情，增加其死亡風(fēng)險[12-13]。肺作為胸部最大的臟器，胸部撞擊傷后肺損傷首當(dāng)其沖，它不僅能引起肺泡細(xì)胞的急性死亡，也能引起肺泡細(xì)胞的遲發(fā)性死亡[10]。Nix作為細(xì)胞凋亡基因的一員，我們通過前期研究發(fā)現(xiàn)，Nix在肺組織的繼發(fā)性損傷中也扮演著重要的角色。由于撞擊傷后Nix基因的表達(dá)情況與肺損傷的損傷程度的相關(guān)性研究并無明確定論[14]，因此，我們想通過此次分析就NIX在機(jī)械牽張誘導(dǎo)的急性肺損傷中的表達(dá)及其嚴(yán)重程度的相關(guān)性進(jìn)行進(jìn)一步的探討，以期對急性肺損傷達(dá)成更加深入的認(rèn)識，并為其預(yù)防及治療提供更多的途徑。

胸部撞擊傷后肺組織暴露在缺血缺氧及失控性的炎癥反應(yīng)等一系列不利條件下，極易發(fā)生肺組織的結(jié)構(gòu)及功能的改變，而后發(fā)生的AT-Ⅱ細(xì)胞的凋亡在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[9，15-16]。細(xì)胞凋亡是指由基因調(diào)控的細(xì)胞的程序性死亡過程，我們機(jī)體通過細(xì)胞凋亡的途徑來維持自身的平衡，其中許多的基因及其產(chǎn)物都有序參與其中。細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制被認(rèn)為是Bcl-2家族在線粒體凋亡通路中發(fā)揮了重要的作用，而Nix蛋白作為Bcl-2家族的一個促凋亡蛋白,也可通過誘導(dǎo)線粒體自噬，在低氧環(huán)境下誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。細(xì)胞凋亡的途徑可分為內(nèi)源行凋亡途徑和外源性凋亡途徑，其中外源性凋亡途徑又稱為死亡受體途徑，是由細(xì)胞外的腫瘤壞死因子等引發(fā)的；內(nèi)源性凋亡途徑又稱為線粒體/細(xì)胞色素C介導(dǎo)的通路，而在內(nèi)源性凋亡途徑中主要又是通過Caspase依賴性凋亡通路發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]，除了Caspase依賴性凋亡通路外，Bratton等還發(fā)現(xiàn)了另外一種非Caspase依賴性凋亡通路同樣在細(xì)胞凋亡中至關(guān)重要[19-20]。其中Nix基因正是通過非Caspase依賴性凋亡通路參與細(xì)胞凋亡的過程并在其中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[21-22]。

Nix也稱為與Bcl-2/E1B-19K相互作用的蛋白3-like(BNIP3L蛋白)，屬于Bcl-2家族成員，含有Bcl-2家族相似的區(qū)域，因此也被認(rèn)為是一種促凋亡蛋白[23-24]；他的作用機(jī)制尚未十分明確，目前認(rèn)為它既可以通過自身結(jié)構(gòu)的改變誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也可以通過與多種細(xì)胞因子等結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25]。McLelland等[26]在帕金森病的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)了線粒體通過形成線粒體來源的囊泡，靶向溶酶體進(jìn)行降解，最終發(fā)生Nix相關(guān)的線粒體自噬過程，這也為我們進(jìn)一步的研究提供了可能。通過不斷的深入研究，已經(jīng)有越來越多的證據(jù)證實了Nix相關(guān)線粒體自噬在細(xì)胞凋亡中的作用[27-29]。更重要的是，Rajasekaran等[30-32]發(fā)現(xiàn)肺組織損傷后肺組織中的Nix表達(dá)明顯升高，這提示了Nix可能與肺組織的凋亡存在一定關(guān)系。但是，關(guān)于Nix與肺組織損傷程度的相關(guān)研究報道較少。

本文通過機(jī)械牽張建立急性肺損傷大鼠模型發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在撞擊傷0.5、2、12、24、48、72 h后，各模型組大鼠肺組織中Nix mRNA及Nix蛋白都有不同程度的升高，提示Nix表達(dá)水平在急性肺損傷后顯著升高。且在48 h內(nèi)，肺組織損傷越重，Nix表達(dá)水平越高；肺損傷48 h后，Nix表達(dá)水平逐漸下降，并將在一定時間后回歸正常水平。Diwan等[33]研究發(fā)現(xiàn)，組織缺氧后，Nix的表達(dá)可以通過影響線粒體的功能，進(jìn)而影響細(xì)胞的凋亡過程，造成肺組織損傷。而肺組織細(xì)胞的凋亡壞死又將影響肺換氣功能，加之創(chuàng)傷后機(jī)體啟動應(yīng)激系統(tǒng)，觸發(fā)多種炎性介質(zhì)、活性氧簇(ROS)等有害物質(zhì)的過多聚集，進(jìn)一步加重肺組織損傷[34]。

對于胸部撞擊傷后引起的急性肺損傷，如若早期不能得到有效的干預(yù)，進(jìn)而將發(fā)展為急性呼吸衰竭，更嚴(yán)重的將導(dǎo)致ARDS或MODS，將極大影響患者的生存時長及生活質(zhì)量。通過此次研究，我們知道了胸部撞擊傷后肺組織Nix的表達(dá)水平會顯著升高，并且與肺損傷程度呈一定的正相關(guān)，而這一過程主要發(fā)生在創(chuàng)傷后48 h之內(nèi)，這為我們對創(chuàng)傷后急性肺損傷的早期病情評估及相關(guān)預(yù)后判定提供了新的思路方法，以便我們對疾病進(jìn)行早期干預(yù)，提高臨床療效。