叢枝菌根真菌對(duì)太白貝母生長(zhǎng)及質(zhì)量標(biāo)志物的影響

張建海，馮彬彬，吳翠色

1.重慶三峽醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，重慶 404120；2.重慶市神女藥業(yè)股份有限公司，重慶 404700

叢枝菌根（arbuscular mycorrhiza，AM）真菌在自然界分布廣泛，并能與80%以上被子植物根系建立良好的共生體系，改善宿主植物水分和營(yíng)養(yǎng)狀況，提高植物抗逆性，影響次生代謝活動(dòng)，具有促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)作用。我國(guó)藥用植物資源十分豐富，近年來(lái)，將AM 真菌作為菌劑使用已成為提高栽培藥用植物產(chǎn)量和品質(zhì)、穩(wěn)定其藥效與藥源的新途徑[1-3]。太白貝母Fritillaria TaipaiensisP. Y. Li為2015 年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）川貝母的基源植物之一[4]。目前川貝母類(lèi)藥材資源匱乏，而太白貝母是人工栽培成功的極少數(shù)川貝母品種之一，具有很高的藥用研究?jī)r(jià)值[5-6]。本研究通過(guò)盆栽接種試驗(yàn)，研究4 種AM 真菌對(duì)太白貝母生長(zhǎng)的生理生化影響，探討太白貝母質(zhì)量標(biāo)志物含量與AM 真菌侵染之間的關(guān)系，為提高人工栽培藥用植物質(zhì)量標(biāo)志物含量、揭示中藥材道地性的形成機(jī)理，以及創(chuàng)新藥用植物人工栽培技術(shù)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1260 智能柱溫箱、VWD 紫外檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司；KQ5200E 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BSA224S 電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DGX-9143B-1 型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH.SYZ1-NI 型電熱恒溫水浴鍋，北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司；SHB-IV雙A 循環(huán)式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；LI-6400 便攜式光合作用測(cè)定儀，北京力高泰科技有限公司；1860PC 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海譜元儀器有限公司；SG-5404A 磁力攪拌器，上海碩光電子科技有限公司；SZ51 奧林巴斯顯微鏡，上海普赫光電科技有限公司； Millipore 純水系統(tǒng)。

地表球囊霉Glomus versiforme（GV）、聚叢球囊霉Glomus aggregatum（GA）、摩西球囊霉Glomus mosseae（GM）、縮球囊霉Glomus constrictum（GC1），購(gòu)自北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源研究所中國(guó)AM 真菌種質(zhì)資源庫(kù)；太白貝母，產(chǎn)自重慶巫山篤坪鎮(zhèn)重慶神女藥業(yè)股份有限公司種植基地，由重慶三峽醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校付紹智教授鑒定為百合科貝母屬太白貝母Fritillaria TaipaiensisP. Y. Li。西貝母堿苷、貝母堿甲、貝母堿乙、貝母辛對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為111917-201202、110750-201612、110751-201712、111892-201402；磷酸、甲醇、乙腈為色譜純，石油醚、三氯甲烷、甲醇為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水；KH2PO4，牛血清蛋白，30%過(guò)氧化氫。

2 方法

2.1 接種

取田間耕作層土壤，風(fēng)干過(guò)篩，在高壓滅菌鍋中滅菌1.5 h。采用室溫盆栽方法，分為接種GV、GA、GM、GC1 和不接種（對(duì)照）5 個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3 次，每盆裝土5 kg，每千克土壤分別加氮肥（硫酸銨）、磷肥（磷酸二氫鉀）、鉀肥（硫酸鉀）各0.1、0.15、0.15 g 作底肥。每盆選擇大小一致的太白貝母鱗莖10 株定植，每盆層施AM 真菌50 g，對(duì)照組不加任何真菌，所有處理于生長(zhǎng)期間施有機(jī)肥1 次，于太白貝母種植基地溫室大棚培養(yǎng)，定期管理。所取材料帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理，備用。

2.2 指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 侵染率將采集的太白貝母根系用水沖洗干凈，剪成l cm根段，采用Phillips 和Hayman 方法（即KOH 透明-乳酸甘油曲利本蘭染色法）測(cè)定AM 真菌侵染率。將太白貝母根系置于10%KOH 溶液中，90 ℃水浴處理45 min，棄去KOH，用自來(lái)水沖洗干凈，置于1%HCl中酸化，再將植物根系移至乳酸甘油曲利本蘭染液中，90 ℃水浴染色15 min。于顯微解剖鏡20×40 倍鏡下采用十字交叉法測(cè)定太白貝母根系的AM 真菌侵染率[7]。

2.2.2 生物量于太白貝母生長(zhǎng)期開(kāi)花前葉片完全伸展后，利用直尺測(cè)定葉片的長(zhǎng)度和寬度；開(kāi)花期測(cè)定地上部分的鮮重和干重；地上部分枯萎后挖取鱗莖，測(cè)定鱗莖的鮮重和干重，并計(jì)算折干率。折干率（%）＝干重÷鮮重×100%。

2.2.3 葉片光合指標(biāo)在太白貝母生長(zhǎng)旺盛期每日10:00 左右，用LI-6400 便攜式光合作用測(cè)定儀，選用人工光源測(cè)定葉片凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和胞間CO2濃度（Ci）[8]。

2.2.4 葉片生化指標(biāo)

取0.5 g 鮮葉片，加入8 mL 磷酸緩沖液，于冰浴中研磨，勻漿轉(zhuǎn)入離心管，于4 ℃、8000 r/min 離心10 min，上清液用于保護(hù)酶系統(tǒng)測(cè)定。超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和過(guò)氧化物酶（POD）活性分別采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化學(xué)還原法（以抑制NBT 降解50%作為1 個(gè)酶活單位）、愈創(chuàng)木酚比色法（以l min 光密度值變化0.01 作為1 個(gè)酶活單位）和紫外吸收法（以光密度值變化0.01 作為1 個(gè)酶活單位）測(cè)定[8]?？扇苄蕴呛坑幂焱壬y(cè)定，可溶性蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法測(cè)定。

2.2.5 質(zhì)量標(biāo)志物采用周濃等[9-11]測(cè)定方法，將太白貝母干燥鱗莖粉碎，取樣品粉末3.0 g，置250 mL 圓底燒瓶中，加150 mL 石油醚（30～60 ℃）浸泡12 h 進(jìn)行脫脂處理，過(guò)濾，濾渣水浴揮干后加質(zhì)量分?jǐn)?shù)28%濃氨試液10 mL，浸潤(rùn)2 h，精密加入三氯甲烷-甲醇（4∶1）混合溶液150 mL，混勻，置70 ℃水浴中加熱回流3 h，放冷，過(guò)濾，回收濾液至干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜? mL量瓶中，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，HPLC 測(cè)定不同處理太白貝母中總生物堿、貝母辛、西貝母堿苷、貝母堿甲、貝母堿乙含量。色譜條件:采用Agilent Extend-C18色譜柱（4.0 mm×250 mm，5 μm），以0.03%二乙胺水-甲醇為流動(dòng)相梯度洗脫，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用—x±s表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 叢枝菌根真菌對(duì)太白貝母的侵染率

不同處理太白貝母的AM 真菌侵染率見(jiàn)圖1?？梢钥闯觯煌珹M 真菌均能顯著提高太白貝母侵染率（P＜0.05），且不同AM 真菌對(duì)太白貝母根系的侵染能力有所不同，GA 對(duì)太白貝母的侵染率顯著高于其他3 種AM 真菌。同時(shí)，對(duì)照組也有一定侵染率，說(shuō)明太白貝母栽種前根系已被少量AM 真菌侵染。

圖1 不同處理太白貝母的AM 真菌侵染率比較

3.2 叢枝菌根真菌對(duì)太白貝母生物量的影響

太白貝母生物量指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。可以看出，與對(duì)照比較，不同處理的太白貝母鱗莖鮮重和干重均顯著增加（P＜0.05），其中接種GA 鱗莖鮮重和干重增加最多，分別比對(duì)照高49.52%和77.82%，接種GV鮮重和干重增加最少，分別比對(duì)照高 31.59%和47.28%；不同處理的太白貝母鱗莖折干率與對(duì)照比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照比較，不同處理的太白太母地上部分鮮重和干重均顯著增加（P＜0.05），其中接種GA 地上部分鮮重和干重增加最多，分別比對(duì)照高66.15%和76.45%；接種GC1 鮮重和干重增加最少，分別比對(duì)照高42.10%和49.42%；不同處理的太白貝母地上部分折干率與對(duì)照比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同處理的太白貝母葉長(zhǎng)和葉寬均高于對(duì)照，其中GA 處理增加較多，GC1 處理增加較少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 不同處理太白貝母生物量比較（—x±s，n＝3）

3.3 叢枝菌根真菌對(duì)太白貝母光合特性的影響

不同處理的太白貝母葉片光合指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。與對(duì)照比較，接種GV、GA、GM、GC1 均能顯著提高葉片凈光合速率（P＜0.05），分別比對(duì)照提高15.11%、55.14%、30.74%、24.92%，其中接種GA最高；氣孔導(dǎo)度與對(duì)照比較均顯著增加（P＜0.05），分別提高36.32%、59.20%、29.01%、41.75%，其中接種GA 最高；蒸騰速率與對(duì)照比較均不同程度增加，分別提高21.42%、29.59%、11.22%、10.20%，接種GV、GA 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中接種GA 增加最多；胞間CO2濃度與對(duì)照比較均不同程度增加，分別提高5.84%、24.81%、16.35%、10.75%，接種GA、GM、GC1 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中接種GA 增加最多。

圖2 不同處理太白貝母葉片光合指標(biāo)比較（—x±s，n＝3）

3.4 叢枝菌根真菌對(duì)太白貝母葉片生理特性的影響

不同處理的太白貝母葉片生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。不同處理均可顯著提高葉片CAT、SOD、POD 活性（P＜0.05）。CAT 活性以接種GA 最高，為110.25 U/（g·min）；接種GM 最低，為89.14 U/（g·min）。SOD 活性以接種GA 最高，為122.14 U/（g·FW），接種GC1 最低，為117.16 U/（g·FW）；POD 活性以接種GA 最高，為95.12 U/（g·min），接種GC1 最低，為88.21 U/（g·min）。接種GV、GA、GM、GC1 后葉片可溶性蛋白含量顯著高于對(duì)照（P＜0.05），分別提高21.06%、26.76%、16.29%、20.36%，其中GA最高，GM 最低；可溶性糖含量均高于對(duì)照，分別提高20.44%、21.73%、15.65%、2.56%，接種GV、GA、GM 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中GA 最高。

圖3 不同處理太白貝母保護(hù)酶系統(tǒng)比較（—x±s，n＝3）

圖4 不同處理太白貝母可溶性糖和可溶性蛋白含量比較（—x±s，n＝3）

3.5 叢枝菌根真菌對(duì)太白貝母質(zhì)量的影響

不同處理太白貝母質(zhì)量標(biāo)志物含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。不同處理均可提高太白貝母總生物堿、貝母辛、西貝母堿苷、貝母堿甲、貝母堿乙含量（P＜0.05）。接種GV、GA、GM、GC1 后太白貝母總生物堿含量分別比對(duì)照提高35.94%、40.21%、32.03%、30.60%；貝母辛含量分別比對(duì)照提高 40.91%、41.67%、26.52%、21.97%；西貝母堿苷含量分別比對(duì)照提高27.13%、17.83%、13.95%、19.83%；貝母堿甲含量分別比對(duì)照提高16.67%、23.33%、6.67%、3.33%；貝母堿乙含量分別比對(duì)照提高16.67%、25.00%、8.33%、16.67%。

表2 不同處理太白貝母質(zhì)量標(biāo)志物比較（—x±s，mg/g，n＝3）

4 討論

AM 真菌生長(zhǎng)發(fā)育呈“S”形曲線(xiàn)，開(kāi)始時(shí)為滯緩期，侵染過(guò)程緩慢，隨后快速侵染，達(dá)到高峰后持續(xù)侵染，與植物根系生長(zhǎng)形成動(dòng)態(tài)平衡。不同AM 真菌在太白貝母中的侵染情況有所不同，可能與其對(duì)寄主的選擇性有一定關(guān)系，提示AM 菌劑在實(shí)際應(yīng)用中需要考慮不同AM 真菌與植物之間的選擇性。AM 真菌侵染太白貝母根系是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和菌根研究的深入，將進(jìn)一步闡明其機(jī)制。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，太白貝母能與AM 真菌形成良好共生關(guān)系，不同AM 真菌對(duì)太白貝母根系有不同程度的侵染，接種AM 真菌明顯提高了菌根侵染率，從而提高太白貝母的生物量。4 種AM 真菌接種后積累干物質(zhì)的量不盡相同，這可能是由不同菌種的特點(diǎn)決定的，也可能是土壤的理化性質(zhì)對(duì)不同菌種產(chǎn)生的影響導(dǎo)致，有待于進(jìn)一步觀察。地下鱗莖干重與地上部分干重比值不同，會(huì)影響植物的生長(zhǎng)狀況，進(jìn)而影響太白貝母的產(chǎn)量。本試驗(yàn)中，接種不同AM 真菌的太白貝母地下鱗莖干重與地上部分干重比值有所不同，接種GV、GM 者低于對(duì)照，而接種GA、GC1 者高于對(duì)照，表明接種不同AM 真菌對(duì)太白貝母地上部分和地下部分的生長(zhǎng)影響不同，可為提高太白貝母產(chǎn)量提供試驗(yàn)依據(jù)。

凈光合速率是葉片光合特性的重要指標(biāo)，也是影響生物產(chǎn)量的重要因素，植物的生長(zhǎng)與其光合性能之間存在著必然的關(guān)系。本研究結(jié)果表明，接種不同AM 真菌均能顯著提高太白貝母葉片凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度。接種AM 真菌后凈光合速率的提高伴隨著氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率和胞間CO2濃度的提高，提示AM 真菌處理導(dǎo)致太白貝母光合作用提高可能與氣孔導(dǎo)度的提高有關(guān)，說(shuō)明太白貝母光合作用增強(qiáng)是氣孔因素造成的。

太白貝母葉片保護(hù)酶系統(tǒng)包括SOD、CAT和POD等，其中SOD 是植物細(xì)胞中重要的活性氧清除酶之一，CAT 和POD 能分解H2O2，減輕細(xì)胞損傷。三者相互協(xié)調(diào)，使活性氧自由基維持在較低水平，從而防止活性氧引起的膜脂過(guò)氧化及其他損害過(guò)程，保證植物正常生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中，接種AM 真菌使太白貝母SOD、POD 和CAT 活性均呈現(xiàn)明顯增加趨勢(shì)，說(shuō)明AM 真菌能有效防止植株衰老，提高植株抗逆性。

可溶性糖含量和可溶性蛋白質(zhì)含量是衡量植物幼苗健壯程度常用的生理指標(biāo)。接種AM 真菌后，太白貝母中可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量均顯著高于對(duì)照，表明接種AM 真菌可培育具有較強(qiáng)生理活性的太白貝母植株。

AM 真菌可能通過(guò)參與寄主植物代謝途徑，影響次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[12-14]。太白貝母的質(zhì)量標(biāo)志物包括總生物堿、貝母辛、西貝母堿、貝母堿甲、貝母堿乙等，其主要質(zhì)量標(biāo)志物含量受產(chǎn)地、品種、生長(zhǎng)階段及環(huán)境因素的影響而存在一定差異。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AM 真菌的侵染可明顯影響太白貝母中總生物堿、貝母辛、西貝母堿苷、貝母堿甲、貝母堿乙的代謝，接種不同AM 真菌的太白貝母上述成分含量均高于對(duì)照，表明共生真菌是影響太白貝母質(zhì)量標(biāo)志物含量的重要因素之一。AM 真菌對(duì)質(zhì)量標(biāo)志物含量及其在藥用植物體內(nèi)累積分布規(guī)律影響的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。