中空纖維超濾技術(shù)在死后溶血血液總IgE檢測(cè)中的應(yīng)用

王天琦，賈宇晴，劉添翼，劉逸凡，曹志鵬，朱寶利

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110122；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)臨床三系，遼寧 沈陽(yáng)110122）

過(guò)敏性休克（anaphylactic shock）是由藥物、食物等致敏原引起的全身超敏反應(yīng)，主要以Ⅰ型超敏反應(yīng)為主。在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，過(guò)敏性休克死亡案例較為常見(jiàn)，且由于缺乏特征性病理形態(tài)學(xué)變化，是法醫(yī)病理學(xué)鑒定中的一大難題[1]。IgE作為介導(dǎo)Ⅰ型超敏反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，已有報(bào)道[2-3]其血清檢測(cè)值可用于法醫(yī)學(xué)過(guò)敏性休克案例的輔助診斷。然而，由于我國(guó)尸體以冷凍保存為主，在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，血液受溶血干擾嚴(yán)重?zé)o法分離血清。在臨床研究中，溶血對(duì)多項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均存在重大干擾[4-6]，而實(shí)際情況中死后檢材的溶血程度遠(yuǎn)比臨床樣本嚴(yán)重，特別是我國(guó)大多數(shù)死后尸體因冷凍保存而產(chǎn)生的重度溶血，使得常規(guī)方法檢測(cè)總IgE的結(jié)果失去了可信價(jià)值。因此，建立有效的溶血樣本IgE檢測(cè)的前處理方法、推測(cè)溶血前血清總IgE濃度對(duì)過(guò)敏性休克死亡的法醫(yī)學(xué)鑒定具有重要意義。

超濾（ultrafiltration）是指應(yīng)用固定孔徑的超濾膜通過(guò)膜兩側(cè)壓力不同對(duì)液體中不同分子量大小的物質(zhì)進(jìn)行分離、純化的技術(shù)，在工業(yè)凈水及廢水處理、蛋白質(zhì)的分離純化中得到廣泛應(yīng)用[7-8]。本研究選用適當(dāng)孔徑的切向流超濾膜柱對(duì)溶血樣本進(jìn)行超濾處理，探究超濾技術(shù)能否對(duì)溶血樣本進(jìn)行有效處理，并探究超濾液中IgE的濃度是否能還原至溶血前血清濃度。

1 材料與方法

1.1 樣本

本研究選取33例中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)司法鑒定中心在2016—2018年間所受理的非冷凍尸體解剖案例（非過(guò)敏性死亡）心血樣本（表1），每例取4 mL血液，其中1mL用Z323K高速離心機(jī)（德國(guó)HERMLE公司）以3000×g[9]，離心20min，獲得血清，-80℃保存?zhèn)錂z。由于血漿樣品中脂質(zhì)對(duì)多項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)會(huì)造成影響，采用Z323K高速離心機(jī)（德國(guó)HERMLE公司）以12 000×g，離心 5 min，去除脂質(zhì)對(duì)檢測(cè)的影響[10]。余3 mL血液-20℃冷凍24 h，室溫下30 min使其完全融化，反復(fù)3～5次，制備全溶血樣品，于-80℃保存?zhèn)錂z。

本研究通過(guò)了中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

表1 33例非冷凍尸體心血樣品Tab.1 The 33 heart blood samples of non-frozen corpses

1.2 超濾裝置及處理過(guò)程

選取中空纖維超濾組件（MicroKros?，mPES，截留相對(duì)分子質(zhì)量100000，20cm2，美國(guó)Spectrum Laboratories公司），以生理鹽水為稀釋基質(zhì)對(duì)全溶血樣品進(jìn)行超濾處理，具體過(guò)程如下。

超濾裝置的組裝：通過(guò)兩通、三通連接器將中空纖維超濾組件和4個(gè)注射器如圖1所示組裝。其中，1號(hào)、2號(hào)注射器作為超濾血樣使用，3號(hào)注射器作為添加生理鹽水使用，4號(hào)注射器作為抽取廢棄液體使用。

圖1 中空纖維超濾裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of hollow fiber ultrafiltration device

超濾處理過(guò)程：

（1）使用1號(hào)注射器抽取2mL全溶血樣品，調(diào)整三通連接器，關(guān)閉3號(hào)注射器，緩慢推動(dòng)1號(hào)注射器至整個(gè)中空纖維超濾組件內(nèi)芯充滿(mǎn)樣品，記下此時(shí)1號(hào)注射器體積。此時(shí)，2號(hào)注射器內(nèi)會(huì)存在部分氣體，排空2號(hào)注射器后重新將其連接至裝置上。

（2）調(diào)整三通連接器，關(guān)閉1號(hào)注射器、打開(kāi)3號(hào)注射器，向超濾組件中推注適量生理鹽水后關(guān)閉3號(hào)注射器、打開(kāi)1號(hào)注射器，反復(fù)推動(dòng)1號(hào)、2號(hào)注射器對(duì)超濾組件中液體進(jìn)行超濾，使用4號(hào)注射器抽取外管廢液并棄去。

（3）重復(fù)上步操作至外管廢液幾乎無(wú)色，此時(shí)調(diào)整內(nèi)芯濾液體積至2號(hào)注射器排空時(shí)1號(hào)注射器內(nèi)液體體積與（1）操作中所記錄的體積相同，保留內(nèi)芯液體，用Z323K高速離心機(jī)以12 000×g，離心5 min，保留上清液（即超濾液）-80℃保存?zhèn)錂z。

1.3 血紅蛋白、總IgE的檢測(cè)

應(yīng)用文齊氏液（天津市現(xiàn)代高新技術(shù)研究院中山研究所）在UV-1800紫外-分光光度計(jì)（日本島津公司）對(duì)血清、全溶血樣品及其超濾液中血紅蛋白進(jìn)行檢測(cè)（氰化高鐵血紅蛋白法）。超濾液、血清中總IgE應(yīng)用Cobas e411電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀（瑞士Roche公司）及配套人免疫球蛋白E檢測(cè)試劑盒（瑞士Roche公司）進(jìn)行檢測(cè)。由于試劑盒要求血紅蛋白質(zhì)量濃度小于1g/L，因此依據(jù)血紅蛋白檢測(cè)結(jié)果，將存在溶血的血清使用生理鹽水稀釋2～3倍使其符合檢測(cè)要求。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 20.0軟件（美國(guó)IBM公司），利用線(xiàn)性回歸對(duì)超濾液及對(duì)應(yīng)血清IgE檢測(cè)值進(jìn)行回歸分析并計(jì)算相關(guān)系數(shù)。超濾液校正后IgE含量與對(duì)應(yīng)血清IgE檢測(cè)值以及全溶血樣品與超濾液血紅蛋白含量的比較分析采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)。根據(jù)TRAN等[11]IgE血清參考值，以＞60U/mL為陽(yáng)性，應(yīng)用四格表χ2檢驗(yàn)比較血清與超濾液校正值的陽(yáng)性率。雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 超濾液與血清中總IgE含量的相關(guān)性與回歸分析

對(duì)33例樣品超濾液與對(duì)應(yīng)血清中總IgE濃度進(jìn)行相關(guān)性，結(jié)果可見(jiàn)，超濾液中IgE檢測(cè)值（x）與血清中總IgE濃度（y）有強(qiáng)相關(guān)性（r=0.984），并通過(guò)回歸分析得出兩者的回歸方程（圖2）：

圖2 超濾液與血清總IgE檢測(cè)值線(xiàn)性回歸圖Fig.2 Linear regression plot of total IgE detection value between ultrafiltrate and serum

2.2 血清、全溶血樣品及其超濾液中血紅蛋白和IgE含量的比較分析

血清、全溶血樣品及其超濾液的血紅蛋白濃度及血清、超濾液及超濾液回歸校正的總IgE檢測(cè)值見(jiàn)表2。超濾后濾液呈淡紅色，比超濾前全溶血樣品顏色淺淡、清亮。超濾液中血紅蛋白濃度遠(yuǎn)小于全溶血樣品，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。將超濾液的檢測(cè)值通過(guò)回歸方程校正后與血清中總IgE濃度進(jìn)行比較，兩者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 血紅蛋白質(zhì)量濃度和IgE含量Tab.2 Hemoglobin concentration and IgE content（n=33）

2.3 血清與超濾液回歸校正值的陽(yáng)性率比較

應(yīng)用χ2檢驗(yàn)對(duì)血清與超濾液校正值的檢測(cè)陽(yáng)性率進(jìn)行比較（表3）得出，血清與超濾液校正值檢測(cè)陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 血清與超濾液校正值的IgE陽(yáng)性率Tab.3 The positive rate of IgE in serum and ultrafiltrate

3 討 論

溶血對(duì)多項(xiàng)生化指標(biāo)檢測(cè)具有重大影響[5-6]，米麗等[12]的研究也證實(shí)隨著溶血程度增加，ELISA法檢測(cè)總IgE的干擾也隨之增加，究其原因，包括血細(xì)胞破裂后對(duì)血清造成的稀釋作用、血細(xì)胞內(nèi)容物釋放后對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生干擾及大量血紅蛋白造成的顏色干擾等[13]。在死后樣品總IgE檢測(cè)中，由于溶血常常導(dǎo)致無(wú)法分離獲得血清，雖然在近年研究中已證實(shí)心包液可作為血清替代檢材進(jìn)行總IgE檢測(cè)[11]，但心包液不是經(jīng)?？梢垣@取。因此，探究溶血樣品前處理方法，建立死后溶血樣品IgE檢測(cè)的解決對(duì)策仍是法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中亟待解決的實(shí)際問(wèn)題。

由于IgE的相對(duì)分子質(zhì)量為196000，因此本研究選用截留相對(duì)分子質(zhì)量為100000的中空纖維超濾膜柱，不僅能截留住大分子量的IgE，還能有效去除產(chǎn)生顏色干擾的血紅蛋白（相對(duì)分子質(zhì)量64 000）及其他小分子量雜質(zhì)。本研究結(jié)果顯示，雖然中空纖維超濾處理不能徹底去除血紅蛋白，但通過(guò)超濾處理后大部分血紅蛋白被過(guò)濾（2.24～27.71 g/L），與全血（23.34～223.32g/L）相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明超濾對(duì)溶血樣品具有良好的處理效果，同時(shí)也使樣品更接近試劑盒檢測(cè)要求（＜1g/L），極大地減少了溶血對(duì)檢測(cè)造成的影響。在總IgE檢測(cè)方面，將樣品進(jìn)行超濾處理后發(fā)現(xiàn)，超濾液IgE檢測(cè)值與血清IgE檢測(cè)值之間具有良好的相關(guān)性（r=0.984），并將超濾檢測(cè)值通過(guò)回歸方程校正后發(fā)現(xiàn)，超濾液校正值與血清檢測(cè)值之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2檢驗(yàn)證實(shí)超濾液校正值僅有1例假陰性，二者檢測(cè)陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明超濾處理并校正后的檢測(cè)值及檢測(cè)陽(yáng)性率接近溶血前血清水平。但本研究也有一定局限性，實(shí)驗(yàn)所選33例非冷凍尸體心血樣品，均為非過(guò)敏死亡，但并未對(duì)是否存在過(guò)敏性疾病做詳細(xì)調(diào)查，推測(cè)在這33例中存在生前患有過(guò)敏性疾病的死者，因此血清IgE檢測(cè)值較為分散（3.53～647.2U/mL），但校正后結(jié)果均接近血清水平，說(shuō)明超濾處理的方法有初步的實(shí)際意義。

綜上所述，超濾技術(shù)既可去除大量溶血雜質(zhì)又能很大程度上還原溶血前血清總IgE水平，在溶血樣品總IgE檢測(cè)中具有實(shí)用價(jià)值，同時(shí)也為溶血后其他大分子量蛋白檢測(cè)提供一個(gè)新的可行性方案，也為法醫(yī)學(xué)中冷凍尸體溶血樣品總IgE檢測(cè)提供了新的方向。