頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)水塔陳醋揮發(fā)性風(fēng)味成分的分析

楊馥秀,周考文,2,*

(1.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院,北京 100023;2.生物質(zhì)廢棄物資源化利用北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100023)

食醋早在我國西周時(shí)期就己出現(xiàn),是一種發(fā)酵的酸味液態(tài)調(diào)味品,多由糯米、高梁、大米、玉米、小麥以及糖類和酒類發(fā)酵制成,因有著濃郁的特殊香氣成分以及含有豐富的營養(yǎng)價(jià)值[1-2]而成為餐桌上不可或缺的重要調(diào)味料品。食品的氣味種類繁雜,容易變化,不同的原料、產(chǎn)地、氣候以及釀造工藝,使食醋的風(fēng)味以及口感千差萬別,因此食醋的氣味成為影響消費(fèi)者接受度和滿意度的一個(gè)重要因素,食品氣味主要涉及揮發(fā)性物質(zhì)與非揮發(fā)性物質(zhì)的相互作用,一般來講,揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)是食品具有特殊香氣和風(fēng)味的主要原因[3],因此對(duì)于食醋中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究具有重要意義。

樣品前處理是食品分析過程中最重要的前處理過程,會(huì)直接影響到測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。固相微萃取技術(shù)集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體[4],操作簡(jiǎn)便,快速,不需要溶劑提取[5],靈敏度高,屬于環(huán)境友好型的樣品前處理方式。其中,靜態(tài)頂空固相微萃取(headspace solid phase microextraction,HS-SPME)被廣泛用于分析環(huán)境[5-6]、食品[7-10]、醫(yī)藥[11-12]等具有揮發(fā)特性的樣品中的風(fēng)味成分。HS-SPME過程主要分為兩步:即吸附過程和脫附過程,前者是揮發(fā)性物質(zhì)根據(jù)“相似相溶”的原理吸附到涂有特定涂層的萃取頭上,后者則是萃取頭在一定條件下將被萃取成分解吸后再被分析。影響HS-SPME的提取效果的參數(shù)[13]主要有:涂層纖維的種類、NaCl添加量、攪拌速度、萃取溫度、萃取時(shí)間、平衡時(shí)間(被萃取物質(zhì)與體系之間的動(dòng)態(tài)平衡時(shí)間)、解吸時(shí)間。此外,涂層的厚度、樣品pH值、進(jìn)樣口襯管類型、樣品體積、萃取頭插入樣品瓶的深度等都會(huì)對(duì)萃取結(jié)果有影響,因此在對(duì)樣品進(jìn)行分析時(shí)要保證分析條件的一致性。

目前,利用HS-SPME與各種分析方法聯(lián)用分析不同種類醋的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)己有文獻(xiàn)報(bào)道,例如Al-Dalali等[14]采用SPME-氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)以及氣相色譜-嗅聞(GC-olfactometry,GC-O)聯(lián)用方法分析了鎮(zhèn)江香醋在傳統(tǒng)和現(xiàn)代陳化方法下的風(fēng)味物質(zhì)的變化;Zhang Xin等[15]用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用法以及主成分分析法分析了北京米醋的香味標(biāo)志物;Liang Xu等[8]利用多次頂空-SPMEGC-氫火焰離子方法分析了不同種類醋中四甲基吡嗪的總含量;范夢(mèng)蝶等[16]采用HS-SPME-GC-MS和GC-O對(duì)山西老陳醋曬制前后風(fēng)味物質(zhì)的變化進(jìn)行了分析。然而,到目前為止,對(duì)水塔陳醋中揮發(fā)性風(fēng)味成分研究報(bào)道較少,水塔老陳醋產(chǎn)于山西省清徐縣,選用優(yōu)質(zhì)高梁、大麥、豌豆等五谷經(jīng)蒸、酵、熏、淋、曬的過程釀造而成,發(fā)展歷史源遠(yuǎn)流長,至今己有3 000余年的歷史,素有“天下第一醋”的盛譽(yù)。因此,本研究通過對(duì)HSSPME中萃取頭種類、解吸時(shí)間、NaCl添加量、萃取時(shí)間、萃取溫度5 個(gè)因素的優(yōu)化,結(jié)合香氣活度值(odor activity value,OAV)研究水塔陳醋中的主要揮發(fā)性物質(zhì)及所起的作用,對(duì)于今后控制水塔陳醋的產(chǎn)品質(zhì)量以及發(fā)酵過程工藝改進(jìn)提供一定的參考作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水塔陳醋 山西水塔醋業(yè)股份有限公司;NaCl(分析純) 北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司;C8～C40正構(gòu)烷烴 北京百靈威科技有限公司;2-辛醇(分析純,≥97.0%) 默克生命科學(xué)(上海)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890-5977 GC-MS聯(lián)用儀、HP-5ms色譜柱(30 m×250 μm,0.25 μm) 美國Agilent公司;SPME進(jìn)樣手柄,50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS)、100 μm PDMS、75 μm CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB萃取纖維頭 美國Supelco公司;固相微萃取裝置(LCD數(shù)控加熱型磁力攪拌器)、20 mL頂空瓶(聚四氟乙烯硅膠墊) 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品準(zhǔn)備

將水塔陳醋樣品稀釋10 倍常溫保存?zhèn)溆?。? mL稀釋后的樣品加入20 mL頂空瓶中,并加入適量的NaCl,放入磁力攪拌子,每次萃取前預(yù)平衡20 min,使被分析物質(zhì)在樣品基質(zhì)與頂空瓶上達(dá)到平衡狀態(tài)。

1.3.2 HS-SPME條件

100 μm PDMS、75 μm CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維頭每次使用前按分別在進(jìn)樣口溫度250、300、250 ℃和260 ℃老化0.5、1、0.5 h和1 h。磁力攪拌器恒定400 r/min,隨后通過進(jìn)樣手柄將老化好的萃取頭插入頂空瓶中,推出纖維頭,在一定溫度和一定萃取時(shí)間吸附揮發(fā)性物質(zhì)。每次實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。

1.3.3 GC-MS條件

GC條件:HP-5ms毛細(xì)管色譜柱(30 m×250 μm,0.25 μm);進(jìn)樣口溫度250 ℃,采用不分流進(jìn)樣,5 min后吹掃流量20 mL/min;載氣為高純氦氣,柱流量1 mL/min;程序升溫條件:初始柱溫箱40 ℃,保持5 min,以8 ℃/min速率升至120 ℃/min,保持2 min;以20 ℃/min升至140 ℃后再以9 ℃/min升至250 ℃,保持1 min。后運(yùn)行條件為250 ℃、5 min。

MS條件:電子電離源;離子源溫度230 ℃;單四極桿溫度150 ℃;離子傳輸管溫度280 ℃;電子能量70 eV;質(zhì)量掃描范圍m/z 35～600,全掃描模式。

1.3.4 HS-SPME提取參數(shù)的優(yōu)化

4 種不同的萃取纖維頭老化后參照文獻(xiàn)[17]萃取條件,分別在加NaCl 1.5 g、50 ℃金屬浴條件下萃取40 min,根據(jù)總離子流色譜圖譜選擇最佳的萃取纖維頭。然后經(jīng)單因素試驗(yàn)考察NaCl添加量、萃取時(shí)間、萃取溫度、解吸時(shí)間,考察范圍分別為0～2.5 g、30～90 min、40～100 ℃、4～7 min,以總峰面積與有效化合物個(gè)數(shù)為指標(biāo),確定各因素最佳水平。

1.3.5 定性分析

總離子流色譜圖用Agilent MassHunter Qualitative Analysis Workstation B.07.00分析,經(jīng)色譜解卷積算法識(shí)別化合物,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)譜庫NIST14檢索化合物(分?jǐn)?shù)＞80 分),C8～C40正構(gòu)烷烴與樣品同樣程序升溫條件,經(jīng)Agilent定量分析軟件計(jì)算各化合物相對(duì)保留指數(shù),結(jié)合保留指數(shù)與質(zhì)譜庫同時(shí)對(duì)化合物進(jìn)行定性分析。

1.3.6 定量分析

2-辛醇為內(nèi)標(biāo),各化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比計(jì)算各化合物的相對(duì)含量。

1.3.7 OVA的計(jì)算

按下式計(jì)算OAV:

式中:Ci為各化合物的相對(duì)含量/(μg/L);OTi為該化合物在空氣中的嗅覺閾值/(μg/L)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Graphpad 6.02作圖,SPSS 24分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HS-SPME纖維頭的選擇

圖1 4 種不同極性萃取頭對(duì)水塔陳醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析Fig. 1 TIC profiles of volatile flavor substances from Shuita-branded vinegar extracted with four extraction fibers with different polarities

圖2 萃取纖維頭對(duì)水塔陳醋揮發(fā)性物質(zhì)的萃取結(jié)果的影響Fig. 2 Effect of different extraction fibers on extraction efficiency of volatile substances from Shuita-branded vinegar

如圖1、2所示,4 種萃取頭對(duì)水塔陳醋揮發(fā)性成分萃取效果有明顯區(qū)別,100 μm PDMS和75 μm CAR/PDMS萃取頭對(duì)食醋樣品揮發(fā)性物質(zhì)的通量與敏感性明顯劣于65 μm PDMS/DVB和50/30 μm DVB/CAR/PDMS,后兩者峰數(shù)量明顯增多。由圖2可知,CAR/PDMS萃取頭峰面積最大,但是化合物個(gè)數(shù)最少,只有7 個(gè);DVB/CAR/PDMS、PDMS/DVB、PDMS峰面積逐級(jí)遞減,PDMS萃取頭有效化合物個(gè)數(shù)較少,PDMS/DVB次之,DVB/CAR/PDMS萃取的化合物個(gè)數(shù)最多且峰面積最大,表明DVB/CAR/PDMS對(duì)于萃取水塔陳醋揮發(fā)性化合物更有效,這一結(jié)果與之前研究結(jié)果也符合[18-19]。因此綜合考慮本實(shí)驗(yàn)確定50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2 HS-SPME單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 解吸時(shí)間的選擇

圖3 解吸時(shí)間對(duì)水塔陳醋揮發(fā)性成分的影響Fig. 3 Effect of desorption time on detection of volatile components of Shuita-branded vinegar

由圖3可知,解吸時(shí)間對(duì)于水塔陳醋揮發(fā)性化合物總峰面積及化合物個(gè)數(shù)影響不大,因此本實(shí)驗(yàn)確定解吸時(shí)間為5 min,即柱溫箱在初始溫度保持5 min之后打開吹掃閥吹掃掉多余物質(zhì)。每次萃取針頭在進(jìn)樣口解吸5 min之后多停留2～3 min以盡可能避免萃取頭上還有其余干擾物質(zhì)。

2.2.2 NaCl添加量的選擇

圖4 NaCl添加量對(duì)水塔陳醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響Fig. 4 Effect of NaCl addition on detection of volatile flavor substances of Shuita-branded vinegar

HS-SPME過程中,可以對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)母男?例如可以通過加入適量的無機(jī)鹽((NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl、H2CO3等)降低有機(jī)化合物與基質(zhì)的親和力,使其更易于從基質(zhì)中分離出以提高萃取效率。為避免其他離子的干擾,本研究選用NaCl對(duì)樣品進(jìn)行改性增加醋樣溶液的分配系數(shù)。如圖4所示,隨著NaCl添加量的增加,總峰面積持續(xù)增加,化合物個(gè)數(shù)在2 g左右較為穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)過程中當(dāng)NaCl添加量達(dá)到2.5 g時(shí),由于樣品體積一定,部分鹽己不能完全溶解,說明此時(shí)鹽溶液己趨于飽和,原則上,由于鹽析作用,過飽和鹽溶液使得分析物可以更有效地進(jìn)入萃取纖維[13],因此確定最優(yōu)加鹽量為2.5 g。

2.2.3 萃取時(shí)間的選擇

如圖5所示,在NaCl添加量2.5 g、萃取溫度50 ℃條件下,在30～80 min之間,隨著萃取時(shí)間的延長,總峰面積及化合物個(gè)數(shù)都呈增加趨勢(shì),在80 min之后,總峰面積基本趨于平穩(wěn),化合物個(gè)數(shù)有上下波動(dòng),經(jīng)SPSS 24軟件單因素方差分析,80、90 min和100 min三水平化合物個(gè)數(shù)之間F值為2.177,P＝0.195＞0.05,表明三水平之間化合物個(gè)數(shù)沒有顯著差異。可能原因是萃取體系中被萃取物質(zhì)與萃取頭固定相間己經(jīng)達(dá)到飽和,盡管延長萃取時(shí)間,化合物個(gè)數(shù)變化不大,因此確定80 min為最佳萃取時(shí)間。

圖5 萃取時(shí)間對(duì)水塔陳醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響Fig. 5 Effect of extraction time on detection of volatile flavor substances of Shuita-branded vinegar

2.2.4 萃取溫度的選擇

圖6 萃取溫度對(duì)水塔陳醋揮發(fā)性成分的影響Fig. 6 Effects of extraction temperature on detection of volatile components of Shuita-branded vinegar

如圖6所示,在NaCl添加量2.5 g、萃取時(shí)間80 min條件下,40～80 ℃,總峰面積和化合物個(gè)數(shù)總體趨勢(shì)呈平穩(wěn)增長;80 ℃以后,峰面積基本保持不變,化合物個(gè)數(shù)經(jīng)SPSS 24單因素方差分析,F值為3.961,P值為0.080(＞0.05),表明80、90 ℃和100 ℃之間化合物個(gè)數(shù)無顯著差異。萃取溫度過高可能會(huì)導(dǎo)致某些化合物分解,因此確定最佳萃取溫度為80 ℃。

2.3 水塔陳醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

圖7 最優(yōu)條件萃取水塔陳醋揮發(fā)性成分色譜圖Fig. 7 TIC patterns of volatile components of Shuita-branded vinegar extracted under optimal conditions

應(yīng)用最優(yōu)條件對(duì)水塔陳醋揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析,結(jié)果見圖7。經(jīng)譜庫檢索識(shí)別化合物共鑒定出75 種揮發(fā)性物質(zhì),如表1所示。其中包括酯類16 種、醛類15 種、酸類12 種、雜環(huán)類10 種、醇類6 種、酮類10 種、酚類3 種和醚類3 種。酸味不論是味覺上還是嗅覺上都是醋類產(chǎn)品的最直觀、最經(jīng)典的味道,也是影響醋類風(fēng)味和品質(zhì)的一類化合物。由表1可知,醋中酸味物質(zhì)主要有醋酸(4.39 μg/L)、苯甲酸(6.22 μg/L)、辛酸(1.16 μg/L)、月桂酸(0.22 μg/L)、癸酸(0.45 μg/L)、壬酸(0.80 μg/L)等,辛酸具有奶酪味及少許的澀味,癸酸有令人不愉快的脂肪味[20],月桂酸具有月桂油香味。除此之外,醋酸相對(duì)含量雖然較低,但是其閾值較低,對(duì)于水塔陳醋產(chǎn)品風(fēng)味影響很大,這些酸類物質(zhì)在水塔陳醋中互相作用,互相影響從而賦予水塔陳醋獨(dú)特的酸味成分。

酯類化合物在香味中占有特別重要的地位,大多具有花香、果香、酒香或蜜香香氣,是評(píng)價(jià)醋類產(chǎn)品的一個(gè)主要指標(biāo)。水塔陳醋中共鑒定出16 種化合物,是所有鑒定出化合物種類最多的,其中相對(duì)含量較高的是2-氯乙基苯甲酸酯(5.30 μg/L)、苯甲酰異硫氰酸酯(4.55 μg/L)、4-庚基丁基鄰苯二甲酸酯(1.87 μg/L)、5-羥基-2,4-二丁基苯基酯(1.43 μg/L)、乙酸乙酯(0.54 μg/L)等,不同酯類物質(zhì)的不同氣味為水塔陳醋貢獻(xiàn)其特殊的風(fēng)味。

另外,水塔陳醋中還含有醛酮類、醇酚類、醚類等化合物。3-呋喃甲醛、苯甲醛在醛類化合物中相對(duì)含量較高,分別占6.40 μg/L和4.78 μg/L,有研究表明,3-呋喃甲醛、5-甲基糠醛、2-乙基-1-己醇是羥甲基糠醛的衍生物[21],可能是水塔陳醋在發(fā)酵過程經(jīng)過美拉德反應(yīng)生成的黑色物質(zhì),可以給食醋增香調(diào)色,但是過量對(duì)于身體健康會(huì)有副作用[22];苯甲醛有杏仁味[23],苯乙醛具有濃郁的玉簪花香氣,壬醛有玫瑰花香[24-25];苯乙醇是醇類化合物中相對(duì)含量最高的物質(zhì),占3.64 μg/L,具有玫瑰香、紫羅蘭香、茉莉花香等多種風(fēng)味,可由苯丙氨酸經(jīng)Strecker降解產(chǎn)生的苯乙醛還原生成;4-乙烯基-2-甲氧基苯酚具有強(qiáng)烈的丁香和發(fā)酵似香氣[26]。二甲基三硫醚是蛋氨酸降解產(chǎn)生的甲硫醇進(jìn)一步轉(zhuǎn)化產(chǎn)生,是蛋氨酸經(jīng)過酵母代謝的中間產(chǎn)物;此外,美拉德反應(yīng)經(jīng)Strecker降解反應(yīng)生成的醛類與氨基化合物進(jìn)行醛基-氨基反應(yīng)生成類黑精的同時(shí),還有一系列中間體及雜環(huán)化合物的生成,對(duì)食品的風(fēng)味起著重要的作用,四甲基吡嗪(川穹嗪)是雜環(huán)類風(fēng)味物質(zhì)中變化最大的物質(zhì),有降低血壓、改善腦循環(huán)、抗腫瘤等功效[27],具有堅(jiān)果香和燒烤香味[8]。這些化合物共同作用賦予了水塔陳醋獨(dú)特的香味成分與營養(yǎng)功能。

表1 水塔陳醋揮發(fā)性風(fēng)味成分GC-MS分析結(jié)果Table 1GC-MS analysis of volatile compounds in Shuita-branded vinegar

續(xù)表1

2.4 OAV計(jì)算鑒定香氣活性成分

OAV即化合物的香氣濃度與其閾值的比值,閾值是指能嗅到或檢測(cè)到的該化合物的最低濃度[28-29]。一般認(rèn)為OAV大于或等于1時(shí),表明該化合物對(duì)該物質(zhì)香氣成分有貢獻(xiàn)作用。在水塔陳醋檢索出的75 種化合物中,有21 種化合物OAV大于1,主要為酸類和醛類物質(zhì),另外還有醇酚醚以及雜環(huán)類,結(jié)果如表2所示。

酸類物質(zhì)如戊酸、辛酸、2-甲基丁酸OAV較高,分別為5 194.77、229.91、118.51,這些酸類物質(zhì)提供水塔陳醋特殊的風(fēng)味以及獨(dú)特的酸味口感;醛類物質(zhì)如癸醛、香草醛、壬醛OAV分別為155.73、114.79、59.86,有研究表明,C9～C12飽和醛在高度稀釋下具有良好的香氣特征[30]。另外,苯酚及草蒿腦都具有較高的OAV,分別為1 564.06、4 824.21,這些呈香能力較強(qiáng)的物質(zhì)提供了水塔陳醋獨(dú)特的風(fēng)格特征。這些化合物值得進(jìn)一步重點(diǎn)關(guān)注,其余化合物OAV雖低,但也都以一定比例相互協(xié)調(diào)發(fā)揮各自的作用。

表2 OAV確定水塔陳醋中揮發(fā)性風(fēng)味成分Table 2Potent odorants in Shuita-branded vinegar identi fied by OAV

3 結(jié) 論

本研究采用HS-SPME-GC-MS對(duì)水塔陳醋中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析。通過優(yōu)化萃取條件分析水塔陳醋揮發(fā)性風(fēng)味成分,確定最優(yōu)萃取條件為NaCl添加量2.5 g,水塔陳醋用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在80 ℃金屬浴萃取80 min。共鑒定出75 種化合物,酯類最多(16 種)、醛類次之(15 種),此外還檢測(cè)出酸類(12 種)、酮類(10 種)、雜環(huán)類(10 種)、醇類(6 種)、酚類(3 種)、醚類(3 種)。這些物質(zhì)對(duì)于醋類的特殊氣味都有重要貢獻(xiàn)。相較于優(yōu)化之前,化合物個(gè)數(shù)有明顯提升(25 種→75 種),總峰面積也隨之增加(4.57×108→1.01×109),表明萃取條件的優(yōu)化對(duì)于水塔陳醋揮發(fā)性成分有顯著影響。水塔陳醋中揮發(fā)性物質(zhì)種類復(fù)雜多樣,從OAV結(jié)果看,有21 種化合物OAV大于1,其中辛酸、癸酸、戊酸、醋酸等酸類物質(zhì)為水塔陳醋提供了獨(dú)特的酸味;另外苯乙醇、糠醛、苯乙醛、四甲基吡嗪等物質(zhì)共同作用賦予水塔陳醋其特有的風(fēng)味及口感。這些呈香物質(zhì)為研究水塔陳醋的特征香味成分以及加工工藝優(yōu)化提供一定的理論參考。但由于醋類發(fā)酵過程中受到發(fā)酵工藝、發(fā)酵菌落、陳釀時(shí)間等因素的影響,對(duì)揮發(fā)性化合物具體產(chǎn)生來源、途徑及相互之間的作用仍需要進(jìn)一步研究。