張歡妍， 馬永賓， 董利陽， 張文哲， 薛菲， 單文琪， 汪雪峰

(1. 江蘇大學附屬醫(yī)院中心實驗室， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001； 2. 江蘇大學附屬金壇醫(yī)院神經(jīng)病學實驗室， 江蘇 金壇 213200)

胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是由細胞膜分離的納米級膜泡，具有亞細胞結(jié)構(gòu)，負載多種生物活性物質(zhì)(蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA )介導(dǎo)細胞間信息通訊[1]。來源于不同細胞的EVs具有多種生物學功能，例如細胞增殖、存活和轉(zhuǎn)化，其在組織工程和再生醫(yī)學領(lǐng)域已被廣泛關(guān)注[1]。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞[2]。研究表明，MSCs源EVs在肝臟[3]、腎臟[4]、中樞神經(jīng)[5]等組織損傷治療中具有預(yù)防和保護作用。本課題組前期的研究結(jié)果也證實，人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)源EVs(hUCMSC-EVs)能顯著促進大鼠坐骨神經(jīng)切斷性損傷的修復(fù)[6]，具體機制不明。施萬細胞是周圍神經(jīng)的膠質(zhì)細胞，可為神經(jīng)軸突提供代謝和營養(yǎng)支持。周圍神經(jīng)損傷后，施萬細胞增殖并遷移至損傷部位，吞噬軸突和髓鞘碎片，并形成Büngner帶以引導(dǎo)軸突定向再生[7]。提示促進施萬細胞增殖和遷移可有助于受損的周圍神經(jīng)修復(fù)?；诖?，hUCMSC-EVs是否通過影響施萬細胞增殖和遷移，進而促進坐骨神經(jīng)損傷的再生修復(fù)，仍然未知。本研究旨在探討hUCMSC-EVs對施萬細胞增殖和遷移的影響，初步闡明其修復(fù)機制，從而為周圍神經(jīng)損傷提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

hUCMSCs的提取和鑒定參照本課題組前期報道[6]；hUCMSCs培養(yǎng)基(美國Cyagen公司)；原代施萬細胞培養(yǎng)基(上海中喬新舟生物科技有限公司)；兔抗人CD9抗體、兔抗人CD63抗體(美國Abcam公司)；兔抗大鼠S100抗體、兔抗大鼠GFAP抗體、Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔、Cy3標記的山羊抗兔(武漢Servicebio公司)；CCK8和BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；DIO熒光染料(上海Invitrogen 公司)；T25 cm2細胞培養(yǎng)瓶、96孔板、12 mm TranswellTM小室(美國Corning公司)；胞嘧啶阿糖胞苷(美國Sigma公司)；CKX-53熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，ICC50正置顯微鏡(德國Leica公司)；Eclipse Ti激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1 hUCMSC-EVs提取 hUCMSCs在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)融合度約為80%，用PBS洗滌2次(去除殘留血清)，加入去除EVs的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集hUCMSCs培養(yǎng)上清液，300×g離心10 min、2 000×g離心20 min，然后通過0.45 μm濾器過濾去除細胞碎片，收集上清液并以4℃、100 000×g超高速離心90 min；棄上清液留取沉淀(約1 mL)，用PBS重懸以去除大分子蛋白絡(luò)合物，超高速重復(fù)離心1次，棄上清液，收集hUCMSC-EVs，用BCA蛋白濃度測試試劑盒檢測濃度，EP管分裝，-80℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 透射電鏡觀察hUCMSC-EVs形態(tài)特征 取20 μL純化后的hUCMSC-EVs充分混懸后滴加到直徑2 mm的載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置1 min，用濾紙吸去銅網(wǎng)邊緣液體；磷鎢酸溶液(pH 6.8)滴加于銅網(wǎng)上，室溫負染5 min；白熾燈烘干后置于電鏡樣品室，透射電鏡下觀察hUCMSC-EVs形態(tài)及拍照。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測hUCMSC-EVs分子標志物CD9和CD63的表達 取100 μL純化后的EVs，加入等體積的蛋白裂解液(RIPA)，充分震蕩混勻后置于冰上，每10 min重復(fù)震蕩1次，重復(fù)3次后12 000×g離心15 min，取上清液， BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，加入上樣緩沖液充分混勻， 95℃煮沸10 min。取100 μg蛋白加至10%聚丙烯酰胺膠中電泳，并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5% BSA室溫封閉1 h，分別加入CD9抗體和CD63抗體(1 ∶ 500)，4 ℃孵育過夜； 用1×TBST洗膜3次，加入HPR標記的山羊抗兔二抗(1 ∶ 2 000)，37 ℃孵育1 h，1×TBST洗膜3次后ECL曝光顯影。

1.2.4 施萬細胞的提取 取新生3～4 d的SD大鼠，75%乙醇消毒10～15 min，用眼科剪取雙側(cè)坐骨神經(jīng)和臂叢神經(jīng)，加入D-Hanks緩沖液并剪碎，然后加入0.25%胰蛋白酶和0.3 mg/mL Ⅰ型膠原酶，(D-Hanks ∶ 胰蛋白酶 ∶ Ⅰ型膠原酶=1 ∶ 1 ∶ 1)，37℃、5% CO2孵箱內(nèi)消化30 min(15 min時取出用1 mL加樣槍吹打混勻1次)。消化完成后10%胎牛血清終止消化，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后換成含5 μg/mL胞嘧啶阿糖胞苷的原代施萬細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，換成施萬細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)并傳代，用于本實驗的施萬細胞為P5～P7代。

1.2.5 施萬細胞的鑒定 取1×105個施萬細胞接種于24孔板中培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)基；4%多聚甲醛固定30 min；PBS洗2次；隨后加入0.5% Triton X-10反應(yīng)10 min；PBS洗2次；5%BSA封閉20 min；加入S100抗體(1 ∶ 200)和GFAP抗體 (1 ∶ 200)，4℃孵育過夜；PBS洗3次；加入二抗綠色熒光染料Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔(1 ∶ 200)和紅色熒光染料Cy3標記的山羊抗兔(1 ∶ 200)，37℃孵育1 h；PBS洗3次；隨后加入5 μg/mL 4,6-二氨基-2-苯基吲哚 (DAPI)染核10 min；PBS洗2次，在CKX-53熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 CCK8細胞增殖實驗 將施萬細胞接種于96孔板(5×103個/孔)，每組設(shè)置5個復(fù)孔，分別加入對照培養(yǎng)液及5、25、50 μg/mL hUCMSC-EVs培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8，充分混勻，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，在酶標儀450 nm波長處檢測光密度(D)值。

1.2.7 Transwell遷移實驗 分別用對照培養(yǎng)液及5、25、50 μg/mL hUCMSC-EVs預(yù)處理施萬細胞 24 h后，分別計數(shù)并取1×105用200 μL無血清培養(yǎng)基重懸后，滴加到Transwell小室中，下室加入800 μL 施萬細胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)12 h后，用4%多聚甲醛固定30 min；PBS洗3次，結(jié)晶紫染色15 min；PBS洗3次，晾干后ICC50顯微鏡拍照。

1.2.8 激光共聚焦顯微鏡觀察 用DIO綠色熒光染料標記hUCMSC-EVs，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育20 min，PBS洗2次；超高速離心并洗滌后與施萬細胞37 ℃孵育2 h；PBS洗2次，4%多聚甲醛中固定30 min；PBS洗2次，加入0.5% Triton X-100 10 min；然后用PBS洗2次，5 μg/mL DAPI染核10 min；PBS洗2次，應(yīng)用Eclipse Ti共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 hUCMSC-EVs的形態(tài)及鑒定

透射電鏡結(jié)果顯示，hUCMSC-EVs呈圓形或橢圓形的膜性結(jié)構(gòu)(圖1A)；hUCMSCs和hUCMSC-EVs亦表達胞外囊泡特異性標志蛋白CD9和CD63(圖1B)。提示成功提取hUCMSC-EVs。

2.2 施萬細胞形態(tài)及鑒定

通過酶消化法貼壁培養(yǎng)并純化，傳代至P5代形態(tài)均一，呈梭形；熒光染色結(jié)果表明，細胞表達施萬細胞特異性表面標志蛋白S-100和GFAP，提示成功提取施萬細胞。見圖2。

A：透射電鏡觀察hUCMSC-EVs形態(tài)特征(黑色箭頭指示為EVs)；B：蛋白質(zhì)印跡檢測hUCMSC-EVs標志蛋白CD9、CD63表達

圖2 施萬細胞特異性表面標志蛋白S100、GFAP表達(100×)

2.3 hUCMSC-EVs促進施萬細胞的增殖

CCK8細胞增殖實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，hUCMSC-EVs處理后，不同濃度的EVs都可促進施萬細胞的增殖(F=40.14，P<0.05)；各濃度之間比較發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的升高，施萬細胞的增殖能力顯著增加(P<0.05或P<0.01)。說明hUCMSC-EVs顯著促進施萬細胞的增殖且呈濃度依賴。見圖3。

a：P<0.05， b：P<0.01，與對照組比較； c：P<0.05，d：P<0.01，與5 μg/mL EVs比較； e：P<0.01，與25 μg/mL EVs比較

2.4 hUCMSC-EVs促進施萬細胞的遷移

與對照組比較，hUCMSC-EVs預(yù)處理后，施萬細胞的遷移能力增強(F=101.6，P<0.01)；hUCMSC-EVs各濃度之間比較，施萬細胞遷移能力隨著濃度的增加也顯著增加(P均<0.01)。見圖4。

2.5 hUCMSC-EVs可被施萬細胞內(nèi)吞

DIO標記的hUCMSC-EVs與施萬細胞共孵育24 h后，共聚焦顯微鏡觀察可見，施萬細胞的胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光，而對照組沒有綠色熒光。說明hUCMSC-EVs可被施萬細胞內(nèi)吞。見圖5。

A：遷移的施萬細胞(結(jié)晶紫染色×100)；B：施萬細胞遷移的細胞數(shù)量；a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.01，與5 μg/mL EVs比較；c：P<0.01，與25 μg/mL EVs比較

白色箭頭指示為DIO標記的EVs

3 討論

MSCs是源自中胚層和外胚層早期發(fā)育的成體干細胞，具有自我更新和多向分化潛能，且來源于多種組織(如骨髓、臍帶、脂肪、鼻黏膜等)[8]。然而，在眾多來源的MSCs中，hUCMSCs被認為是最有吸引力的一種，具有易于獲取、便于體外培養(yǎng)及低免疫原性等優(yōu)勢，其已成為MSCs領(lǐng)域的研究焦點[9-10]。目前，hUCMSCs在多種疾病的治療和預(yù)防中已顯示出獨特的效果[11]。然而，直接使用hUCMSCs用于治療仍存在潛在的危險因素，如促瘤[12]和血栓形成[13]。

EVs具有膜性結(jié)構(gòu)，負載蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA， 能夠與受體細胞結(jié)合，進而傳遞內(nèi)容物引發(fā)下游信號激活及細胞間通訊等效應(yīng)[1]。EVs可由多種細胞分泌，且表達CD9、CD63、CD81等保守蛋白[12-14]。在本研究中，我們采用超高速離心法提取hUCMSCs上清液中的EVs，透射電鏡結(jié)果顯示，EVs呈圓形或橢圓形的膜性結(jié)構(gòu)，且表達EVs特異性分子標志物CD9和CD63。然而，對照組同樣表達CD9和CD63，這可能與EVs來源于hUCMSCs細胞膜有關(guān)。EVs無細胞核，致瘤可能性極低，也可解決臨床給藥過程中的栓塞問題，且兼具MSCs表面標志及趨化特性等優(yōu)勢，說明MSC-EVs可作為替代MSCs治療的新策略。

施萬細胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)特有的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，包繞外周神經(jīng)軸突形成髓鞘并為神經(jīng)軸突提供營養(yǎng)支持。周圍神經(jīng)損傷后，施萬細胞去分化形成前體細胞并大量增殖和遷移，為軸突的再生提供微環(huán)境[7]。因此，基于施萬細胞增殖和遷移修復(fù)周圍神經(jīng)損傷已成為潛在的治療靶點。近年來MSC-EVs已成為再生醫(yī)學的研究熱點， 基于MSC-EVs對周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的相關(guān)報道日益增多。Vesna等[15]發(fā)現(xiàn)，大鼠脂肪MSCs源EVs顯著促進施萬細胞的增殖及神經(jīng)軸突的生長。Rao等[16]發(fā)現(xiàn)，人牙齦MSCs源EVs促進背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的生長，且促進施萬細胞的增殖。然而，Zhou等[17]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠骨髓來源的EVs抑制RSC96(永生化的大鼠施萬細胞系)的增殖和遷移，這種MSCs對施萬細胞增殖和遷移結(jié)果的差異可能與MSCs的來源以及施萬細胞類型不同有關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠尾靜脈注射hUCMSC-EVs后，能趨化到坐骨神經(jīng)受損部位并顯著促進施萬細胞包繞神經(jīng)軸突形成髓鞘[6]。然而hUCMSC-EVs是否通過促使施萬細胞的增殖和遷移，從而促進坐骨神經(jīng)修復(fù)仍然不明。

本實驗提取了大鼠原代施萬細胞并應(yīng)用不同濃度的hUCMSC-EVs處理，結(jié)果表明hUCMSC-EVs顯著促進了施萬細胞的增殖和遷移。研究發(fā)現(xiàn)[18]，EVs對受體細胞的作用方式有① 與表面受體的結(jié)合； ② 傳遞EVs負載的內(nèi)容(miRNA、mRNA、蛋白)； ③ 通過靶細胞對EVs的內(nèi)吞。在本研究中，我們通過共聚焦顯微鏡觀察，DIO標記的EVs在施萬細胞的胞質(zhì)中大量聚集，提示EVs被施萬細胞內(nèi)吞，可能啟動了施萬細胞下游的信號，從而促進施萬細胞的增殖和遷移。然而，EVs內(nèi)吞后如何影響施萬細胞增殖和遷移的潛在機制仍然需要進一步探究。

綜上所述，hUCMSC-EVs可顯著促進施萬細胞的增殖和遷移且呈濃度依賴，這種作用機制可能與hUCMSC-EVs被施萬細胞內(nèi)吞有關(guān)。