蓋塔病毒TaqMan探針熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

朱翔宇，魯榮光，胡 博，蔡熙姮，劉 昊，史 寧*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 佛山 528000)

蓋塔病毒(Getah virus，GETV)是披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬(Alphavirus)西門利克病毒復(fù)合組的一種單鏈RNA病毒，屬于由蚊蟲傳播的蟲媒病毒[1]。1955年從馬來西亞捕獲的雪背庫蚊(Culexgelidus)中首次被分離并命名為Getah virus[2]。隨后在日本、東南亞和澳大利亞等地，從蚊蟲體內(nèi)、馬和豬的血液樣品中分離到GETV[3-5]。GETV能在節(jié)肢動物和脊椎動物體內(nèi)增殖，血清學(xué)檢測結(jié)果顯示目前GETV廣泛分布于馬來西亞、日本、澳大利亞、中國、蒙古國和俄羅斯等國家[6-14]。我國于1964年首次在海南庫蚊樣品中分離到GETV(M1株)后相繼在中國多個省市采集的蚊蟲樣品中分離到多株GETV[11,15]，最近國內(nèi)有報道稱，在湖南省的某養(yǎng)豬場和山東省的某藍(lán)狐養(yǎng)殖場中分別發(fā)生了GETV的暴發(fā)，并成功分離到GETV[16-17]，并且近期對云南省家畜的病毒血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，在采集的多數(shù)家畜血清樣品中檢測到了GETV的中和抗體[18]，此外，2018年周峰等[19]在某豬場的豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)減毒活疫苗中發(fā)現(xiàn)有GETV污染并進(jìn)行了GETV的分離鑒定，在此之前周峰等[20]曾在河南省某養(yǎng)豬場疑似PRRS流產(chǎn)胎兒病料中分離到1株GETV，而2個毒株間具體有什么聯(lián)系，尚未有明確定論。目前一般認(rèn)為GETV是可以感染人的動物源性蟲媒病毒[21-22]。盡管目前尚無人感染流行GETV的報道，但是國外已有報道在健康人血清樣本和發(fā)熱患者血清標(biāo)本中均能檢測到GETV中和抗體[11,23-24]，表明該病毒很有可能引起人類感染，因此不可忽視GETV對人類健康產(chǎn)生的潛在威脅。

GETV感染家畜可以引發(fā)疾病，如馬的發(fā)熱、皮疹、后腿水腫及淋巴結(jié)腫大，并能引起豬的致死性疾病和生殖障礙等[3-4]，因此GETV被列為重要動物源性病原體[25-26]。常用于診斷GETV的幾種方法包括間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence，IFA)、血凝和血凝抑制方法、免疫電鏡觀察、GETV C基因特異性引物PCR擴增等方法。近年來反轉(zhuǎn)錄PCR(retro-transcription-PCR，RT-PCR)及實時熒光定量PCR(real-time PCR，RT-qPCR)因快速、敏感等特點在病毒檢測方面廣泛應(yīng)用，并且已經(jīng)建立了針對部分蟲媒病毒的RT-PCR、RT-qPCR檢測方法[27-30]。本研究利用TaqMan探針熒光定量RT-PCR技術(shù)，建立一種快速檢測GETV方法，為蟲媒病毒檢測提供方法學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1 毒株與臨床樣品GETVSD1709株(MH106780)用于建立RT-qPCR測定。赤羽病毒(Akabane disease virus，AKAV)NM/BS/1株；巴泰病毒(Batai virus，BATV)NM/12株；日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)YN0901株；豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)CC-1株；偽狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)DL14/089株；豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(porcine circovirus type 2，PCV2)NM2002株；犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)HBF-1株；水貂細(xì)小病毒(mink enteritis virus，MEV)LT-18株，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部經(jīng)濟動物疫病重點實驗室保存，用于RT-qPCR方法的特異性評價。樣本來源于2017年7月至2018年9月在吉林省收集的10 000只三帶喙庫蚊(Culextritaeniorhynchus)，50～100只分裝，共100管。

1.2 主要試劑與儀器QIAamp Viral RNA Mini Kit，美國QIAGEN公司產(chǎn)品；Vazyme HiS-cript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品；Probe qPCR Mix，Ex Taq聚合酶，DH5α感受態(tài)細(xì)胞，250 bp DNA Ladder Marker，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；小劑量質(zhì)粒(去內(nèi)毒素)抽提試劑盒，Omega公司產(chǎn)品；FastStart Essential DNA Probes Master，羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)品。

Nanodrop 2 000，Thermo公司產(chǎn)品；PCR儀，Applied Biosystems公司產(chǎn)品；凝膠成像儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；LightCycler?96實時熒光定量PCR儀，羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.3 引物與探針從GenBank下載了6株GETV序列(KY363862，AB859822，EF631999，MG865965，LC107870，LC223131)，利用DNAStar進(jìn)行比對非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1)基因序列后，以759 ～948 nt的保守區(qū)域作為鑒定區(qū)域，并在此區(qū)域內(nèi)設(shè)計引物和探針序列(表1)，探針的5'端和3'端分別標(biāo)記熒光報告基團熒光素(HEX)和熒光淬滅基團(TAMRA)，擴增片段約為200 bp。引物和探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 GETV的RT-PCR熒光探針及擴增引物

將GETV基因與其他親緣關(guān)系較近的甲病毒如東部馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒和辛德畢斯病毒進(jìn)行序列比對，結(jié)果顯示GETV毒株與其他甲病毒毒株的核苷酸序列同源性在61.1%～70.5%范圍內(nèi)，且設(shè)計的引物與其他的甲病毒基因不匹配，表明引物具有良好的特異性。

1.4 病毒RNA的提取與質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備使用QIAamp Viral RNA Mini Kit從含有106PFU/mL GETV的200 μL Vero細(xì)胞培養(yǎng)上清液中提取GETV RNA。使用Vazyme HiS-cript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA通過常規(guī)PCR進(jìn)行擴增，PCR程序如下：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s和72℃ 30 s，共35個循環(huán)；最后72℃下延伸10 min。將PCR產(chǎn)物純化后與pET-30a載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定。按照小劑量質(zhì)粒抽提試劑盒說明書提取序列正確的陽性質(zhì)粒GETV-pET-30a作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，檢測其濃度并計算出陽性標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。

1.5 RT-qPCR方法的建立及優(yōu)化以已知拷貝數(shù)的GETV陽性標(biāo)準(zhǔn)品GETV-pET-30a作為模板，利用FastStart Essential DNA Probes Master試劑盒中的試劑，總體系為25 μL，將探針和引物進(jìn)行不同濃度的配比(濃度控制在0.1～2 μmol/L)來選擇最佳濃度，根據(jù)SeqMan軟件設(shè)計提供的引物與探針的最佳退火溫度來調(diào)整反應(yīng)溫度與反應(yīng)時間(溫度為55～65℃，時間為20～40 s)，循環(huán)參數(shù)分別為35，40和45，按照以上條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將制備的GETV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品2.03×100～2.03×108copies/μL進(jìn)行10倍連續(xù)倍比稀釋后作為模板，按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系，反應(yīng)條件進(jìn)行RT-qPCR檢測，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為x軸，Ct值為y軸建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 RT-qPCR方法的特異性、敏感性、重復(fù)性試驗提取GETV,AKAV,BATV,JEV,PRRSV,PRV,PCV2,CDV和CPV的DNA或RNA，以DNA或RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，用建立的RT-qPCR方法進(jìn)行檢測，驗證RT-qPCR方法的特異性，用無菌水作為陰性對照。將制備的GETV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品100～108copies/μL進(jìn)行10倍連續(xù)倍比稀釋后作為模板，以評估和比較RT-qPCR和常規(guī)RT-PCR測定的靈敏度。RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定分析。

對GETV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇2.03×105～2.03×107copies/μL的3個不同濃度的樣品進(jìn)行檢測，每個樣品作3次重復(fù)，并在不同時間重復(fù)檢測3次，計算Cq平均值的標(biāo)準(zhǔn)差，驗證該方法的重復(fù)性。

1.7 臨床樣品的檢測將2017年7月至9月在吉林省多個農(nóng)場收集的10 000只三帶喙庫蚊樣品進(jìn)行處理，按50～100只/管分裝為100管。使用含2% FBS的MEM培養(yǎng)基將蚊子懸浮液和血清樣品制備為10%乳劑，在4℃條件下以12 000 r/min離心30 min，使用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行RNA提取并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后通過RT-qPCR和RT-PCR分別進(jìn)行檢測及分析。

1.8 病毒分離培養(yǎng)試驗病毒分離培養(yǎng)是WHO公認(rèn)鑒定病毒的金標(biāo)準(zhǔn)，參照劉帥等[31]的方法對RT-qPCR結(jié)果為陽性的樣品進(jìn)行病毒分離。取200 μL蚊懸浮液接種于含有5%胎牛血清和1%青霉素(10 000 U/mL)、1%鏈霉素(10 000 U/mL)的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的Vero細(xì)胞，置于37℃，5%CO2中恒溫培養(yǎng)箱中。72 h后，觀察到細(xì)胞病變(cytopathic effect，CPE)后將接毒的Vero細(xì)胞盲傳3代后收獲病毒。反復(fù)凍融3次后按說明書操作提取病毒RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行普通PCR擴增，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品濃度的換算使用Nano drop檢測陽性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的濃度為337.2 μg/L，根據(jù)公式換算后其拷貝數(shù)為2.03×108copies/μL。

2.1 雙重?zé)晒舛縍T-PCR方法的建立與優(yōu)化引物與探針最佳濃度分別為0.4，0.8 μmol/L，最佳退火溫度為60℃。反應(yīng)體系為20.0 μL，每個反應(yīng)管包括10.0 μL Probe qPCR Mix，7.5 μLRNase-free ddH2O，上、下游引物各0.5 μL，0.5 μL TaqMan探針和1 μL cDNA樣品(20～50 ng)。使用Roche LightCycler?96系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR，優(yōu)化后的反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，55℃退火10 s，72℃20 s，共40個循環(huán)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分析Cq值和目的基因濃度的對數(shù)之間的線性關(guān)系，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為―2.883 3，截距為31.82，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-2.883 3x+31.82(R2=1.00)(圖1)。

圖1 使用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 敏感性試驗RT-qPCR擴增曲線(圖2A)是通過檢測梯度稀釋的GETV的標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒而產(chǎn)生的，拷貝數(shù)范圍為2.03×101～2.03×108copies。RT-qPCR的檢出限為2.03×101copies/μL，而常規(guī)RT-PCR在濃度為2.03×103copies/μL時顯示為陰性(圖2B)，表明RT-qPCR的靈敏度比常規(guī)RT-PCR高100倍。

圖2 熒光定量PCR(A)和常規(guī)普通PCR法(B)敏感性比較 M.250 bp DNA Ladder Marker；1～7.分別為2.03×108～2.03×102 copies/μL

2.4 重復(fù)性試驗通過變異系數(shù)(CV)值的計算分別評估RT-qPCR檢測樣品時的批內(nèi)重復(fù)性和批間重復(fù)性。測定批內(nèi)和批間CV值分別為0.55%～0.97%和1.47%～1.66%(表2)，說明此方法的重復(fù)性良好。

表2 TaqMan RT-qPCR測定的批內(nèi)和批間離異度

2.5 特異性試驗結(jié)果顯示GETV cDNA可以出現(xiàn)特異性擴增曲線，序列分析結(jié)果證明擴增產(chǎn)物序列正確，且其他病毒DNA或cDNA的檢測結(jié)果皆為陰性，表明本試驗的引物、探針以及所建立的方法特異性良好。

2.6 臨床樣品的檢測及應(yīng)用通過RT-qPCR法共檢測出8個陽性樣品編號201707022,201807026,201708018,201708023,201709006,201809021,201709131和201809146)GETV RNA在蚊子樣本中拷貝數(shù)分別為9.366×103，8.663×103，9.014×103，1.896×102，1.331×103，8.964×103，1.289×103和1.913×102copies/μL。而常規(guī)RT-PCR檢測僅有4個樣品結(jié)果為陽性(201707022,201807026,201708018和201809021)(表2)，初步推測可能與病毒滴度有關(guān)。

表3 應(yīng)用RT-qPCR方法和常規(guī)RT-PCR方法檢測臨床樣品

2.7 病毒分離培養(yǎng)將RT-qPCR結(jié)果陽性的8份樣品接種Vero細(xì)胞后，第3天開始出現(xiàn)CPE，盲傳3代后第4天出現(xiàn)明顯CPE，細(xì)胞間隙增大、皺縮、變圓并大面積脫落，形成空斑，第6天細(xì)胞完全脫落，收獲病毒。提取病毒RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用GETV特異性引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示8份樣品皆為陽性。

3 討論

GETV是一種以蚊媒傳播為主的病毒，迄今為止我國對該病毒的研究僅局限于對人群的血清流行病學(xué)調(diào)查和蚊子帶毒情況研究，至于蚊子體內(nèi)的病毒從何而來以及動物在該病毒傳播過程中所起的作用尚不得而知。目前研究GETV的來源、在我國的生態(tài)學(xué)分布、對動物和人的致病性、確定其終末宿主以及蚊子是否在人和動物間扮演媒介角色等均具有重要的公共衛(wèi)生意義和動物生產(chǎn)應(yīng)用價值。

病毒分離培養(yǎng)是目前國際上公認(rèn)的鑒定病毒的金標(biāo)準(zhǔn)，但是操作繁瑣、對檢驗員和試驗條件的要求都很高，很難在基層實驗室應(yīng)用。建立一種特異、靈敏和快速的診斷技術(shù)是有效防控傳染病的重要措施之一，檢測病毒的方法免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。但免疫學(xué)方法存在一定的誤差，分子生物學(xué)方法可以做到更為精確的檢測。常用的既可靠又精確的方法是熒光定量PCR，其中TaqMan探針法熒光定量PCR具有高度的特異性，比普通PCR結(jié)果更直觀、精確。王傲杰等[32]建立了GETV的RT-PCR方法，特異性良好、敏感度較高，檢出最低滴度為102.25TCID50/mL。

本研究在相對保守NSP1序列應(yīng)用DNAStar等軟件設(shè)計引物和探針，并借助NCBI網(wǎng)站在線Blast分析引物和探針的特異性，篩選出最佳引物和探針。經(jīng)過條件優(yōu)化成功建立了GETV實時熒光定量RT-PCR檢測方法，并驗證了其靈敏度、特異性和重復(fù)性。通過驗證該方法具有較好的特異性，對本實驗室其他病毒如AKAV、BATV、JEV、PRRSV、PRV、PCV2、CDV和CPV等無交叉反應(yīng)。整個試驗過程僅需3～4 h，且能高通量檢測，敏感度達(dá)2.03×101copies/μL，比普通RT-PCR高100倍。對3種濃度病毒cDNA進(jìn)行檢測，每個濃度Cq值變異系數(shù)均≤2%，表明該方法具有良好重復(fù)性。應(yīng)用本方法對現(xiàn)場蚊蟲樣品攜帶GETV進(jìn)行檢測，共檢出8份陽性樣品，經(jīng)病毒分離及測序，確定8份標(biāo)本均為GETV，表明本方法在對現(xiàn)場樣品GETV的篩查中具有良好的應(yīng)用價值。

總之，在本研究中，我們建立了一種快速，簡便，特異且靈敏的TaqMan RT-qPCR方法用于檢測GETV，尤其適用于少量感染GETV的蚊子和血清樣品的快速檢測和定量。