都勻毛尖茶多酚氧化酶粗酶的酶學(xué)性質(zhì)*

姚玉仙，張明澤，劉麗萍，徐 波

(黔南民族師范學(xué)院，貴州 都勻 558000)

茶產(chǎn)業(yè)是貴州省黔南州近年來進(jìn)行農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、推進(jìn)扶貧開發(fā)的重要產(chǎn)業(yè)之一[1]。黔南州茶樹種質(zhì)資源豐富，目前發(fā)現(xiàn)有200多個(gè)株系，既有適制綠茶的品系，也有適制紅茶的品系，部分品系可兼制紅綠茶[2]。為發(fā)展茶產(chǎn)業(yè)，實(shí)現(xiàn)多元化經(jīng)營，茶產(chǎn)品類型逐漸增加，參照金駿眉加工工藝，利用都勻毛尖茶相同原料生產(chǎn)的都勻紅茶產(chǎn)量迅速增長，其品質(zhì)也獨(dú)樹一幟[3]。紅茶發(fā)酵過程中主要生化成分變化是由多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO，EC 1.10.3.1)催化引起的。PPO是一種Cu2+輔基結(jié)合酶[4]，其催化形成的茶黃素總含量與紅茶整體品質(zhì)及估值呈極顯著正相關(guān)[5]，是形成紅茶色澤與香氣的關(guān)鍵酶。不同地區(qū)和不同品種茶樹的PPO特性差異較大，酶的最適反應(yīng)條件也有所差異[6]。因此，為進(jìn)一步了解都勻地方茶樹品種的酶學(xué)性質(zhì)，本研究以都勻毛尖茶地方品種鮮葉為對(duì)象，研究其酶的最適反應(yīng)條件，為篩選適制都勻紅茶的茶樹品系及優(yōu)化茶葉加工提供參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材 料

材料：于夏季采摘都勻毛尖地方品種茶樹鮮葉，采摘規(guī)格為一芽一葉。

試劑：石英砂(SiO2)、冷丙酮(C3H6O)、檸檬酸(C6H8O7)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鈉(H2NaPO4·2H2O)、不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、鄰苯二酚(C6H6O2)、脯氨酸，所有化學(xué)試劑均為分析純級(jí)，所有用水均為蒸餾水。

1.2 方 法

1.2.1 粗酶提取[7]

取鮮葉10 g、冷丙酮40 mL、PVPP 2 g于冷凍的研缽中，快速研磨直至勻漿，抽濾，濾渣用80%冷丙酮淋洗至無色，此時(shí)濾渣即是丙酮粉。將1∶3(重量體積比)的丙酮粉和pH 5.6的檸檬酸-磷酸緩沖液混合，加入少量石英砂混合置于低溫環(huán)境中的冰研缽中研磨勻漿20 min，將勻漿好的混合液于4000 r/min的高速冷凍離心機(jī)(溫度4 ℃)離心15 min，得上清液，即PPO粗酶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酶活力測(cè)定[7]

取粗酶液1 mL，加反應(yīng)混合液3 mL(2 mL pH 5.6檸檬酸磷酸緩沖液、0.4 mL 0.1%脯氨酸溶液、0.6 mL 0.1 mol·L-1鄰苯二酚溶液)在37 ℃下溫浴10 min后立即加入6 mol·L-1尿素液3 mL終止反應(yīng)，4000 r/min離心10 min，上清液置于1 cm比色皿，在波長460 nm處測(cè)吸光度，空白對(duì)照的反應(yīng)混合液中的鄰苯二酚用緩沖液代替，其他條件相同。酶活力單位以每克樣品每分鐘A460改變0.01為一個(gè)活力單位(U)。

式中，V為樣品體積，mL；T為反應(yīng)時(shí)間，min；A460為反應(yīng)終止時(shí)以空白為對(duì)照在460 nm處的吸光度。

1.2.3Km及vmax值測(cè)定

于五支離心管中加入酶液0.6 mL，分別加入0.1 mol·L-1鄰苯二酚溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL，再用pH 5.6檸檬酸-磷酸緩沖液補(bǔ)充至3.0 mL，按照1.2.2步驟處理后測(cè)定吸光度。按以下公式計(jì)算Km值和vmax值。

式中，U為測(cè)得的酶活力，Km為米氏常數(shù)，mol·L-1；v為酶促反應(yīng)速率，vmax為酶的最大反應(yīng)速率，U/min；[S]為底物濃度，mol·L-1。采用雙倒數(shù)方程計(jì)算出Km和vmax的值，即是1/v=(Km/vmax)×(1/[S])+1/vmax，以底物濃度倒數(shù)(1/[S])為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率倒數(shù)(1/v)為縱坐標(biāo)，通過求得兩者的線性函數(shù)關(guān)系，推出Km值和vmax值[8]。

1.2.4 不同溫度和pH處理后測(cè)定PPO酶活力

在試管中加入PPO酶液0.6 mL、0.1 mol·L-1鄰苯二酚0.6 mL、pH 5.6檸檬酸-磷酸緩沖液1.8 mL混勻作為反應(yīng)體系溶液(不同pH處理的反應(yīng)體系與此相同)，分別在20～70 ℃(10 ℃為一個(gè)梯度變化)下水浴10 min，測(cè)定各溫度下PPO的吸光度。pH 3.0～8.0(pH 0.5為一個(gè)梯度變化)的反應(yīng)體系溶液于37 ℃水浴10 min后測(cè)定混合液PPO的吸光度。pH 3.0～5.5緩沖液用檸檬酸和磷酸氫二鈉配制，pH 6.0～8.0緩沖液用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配制。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同鄰苯二酚濃度下PPO反應(yīng)速率及Km值

由表1可知，都勻毛尖茶鮮葉PPO反應(yīng)速率隨鄰苯二酚濃度增加而增大。采用雙倒數(shù)作圖法(圖1)，得到PPO酶活力的動(dòng)力學(xué)方程式：1/v=0.0189×1/[S]+0.1328，R2=0.9803，根據(jù)米氏方程的倒數(shù)形式推導(dǎo)出Km/vmax=0.0189，1/vmax=0.1328，可以確定vmax值為7.5301 U·min-1，Km值為0.1423 mol·L-1。同一反應(yīng)體系下的Km越大說明催化活力越低，越小則催化活力越高。

表1 不同鄰苯二酚濃度下都勻毛尖鮮葉PPO反應(yīng)速率Table 1 The reaction rate of PPO in fresh leaves with different concentrations of catechol

圖1 鮮葉PPO催化鄰苯二酚的雙倒數(shù)曲線Fig.1 Double reciprocal plots of PPO in fresh leaves with catechol as substrate

2.2 溫度對(duì)PPO酶活力的影響

在20～70 ℃的溫度范圍內(nèi)，測(cè)定PPO的活力，溫度對(duì)PPO活力的影響結(jié)果見圖 2。

圖2 溫度對(duì)PPO酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on PPO activity

由圖2可知，當(dāng)溫度在20～30 ℃條件下，PPO活力隨著溫度的升高而上升，至30 ℃達(dá)到最高值；溫度高于30 ℃時(shí)PPO活力迅速下降，到達(dá)60 ℃時(shí)，PPO活力消失，這可能是由于PPO是一種蛋白質(zhì)，不適宜的溫度會(huì)破壞PPO活性部位三維結(jié)構(gòu)的完整性，而這種結(jié)構(gòu)又是保持酶活力的關(guān)鍵因素[9]。適宜溫度范圍內(nèi)酶催化反應(yīng)速度隨溫度升高而加快，但超過某一溫度時(shí)蛋白質(zhì)變性，酶活力消失。因此在利用都勻毛尖茶鮮葉加工紅茶過程中應(yīng)選擇30 ℃左右的溫度發(fā)酵。

2.3 pH值對(duì)PPO酶活力的影響

在pH值為3.0～8.0的緩沖液中測(cè)定都勻毛尖茶鮮葉PPO粗酶的活性，pH值對(duì)PPO活力的影響結(jié)果見圖3。

圖3 pH值對(duì)PPO酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on PPO activity

由圖3可知，茶樹鮮葉PPO活力的最適pH值為4.0左右。當(dāng)pH降為3.0時(shí)，PPO活力明顯降低；當(dāng)pH從4.0逐漸增加到5.0時(shí)，PPO酶活力急劇下降。當(dāng)pH大于7.5時(shí)酶活力又明顯上升，出現(xiàn)肩峰可能是由于茶葉存在多個(gè)多酚氧化酶同工酶引起的[10]，這些酶的最適pH會(huì)受到同工酶的數(shù)量、比例及性質(zhì)的影響。在都勻紅茶加工過程中可以根據(jù)這一性質(zhì)考慮一些相關(guān)措施，如使用檸檬酸等食用酸來調(diào)控pH值在3.5～4.5之間，促進(jìn)酶的活力，縮短發(fā)酵時(shí)間。

3 結(jié) 論

關(guān)于pH對(duì)茶樹PPO活力影響的相關(guān)研究報(bào)道較多，但結(jié)果有所差異。研究顯示，茶樹品種福云6號(hào)[11]、櫧葉齊[12]、白毫早[13]、烏牛早和平陽特早[14]粗酶的最適pH分別為8.6、5.6、6.0、8.6。本研究發(fā)現(xiàn)都勻毛尖茶鮮葉PPO粗酶的最適反應(yīng)pH為4.0，這與伍夢(mèng)瑤等[15]測(cè)定勐庫大葉種PPO最適反應(yīng)pH為4.4的結(jié)果較為相近。因此，不同茶樹PPO粗酶活性的最適pH差異可能與品種有關(guān)。紅茶發(fā)酵過程中葉片pH值逐漸降低而趨于酸性環(huán)境[16]，研究表明，偏酸性條件更利于紅茶重要品質(zhì)成分茶黃素的形成且保持穩(wěn)定[17]。因此，PPO最適pH偏酸性的都勻毛尖茶地方品種適宜作為紅茶加工的原料。發(fā)酵是紅茶品質(zhì)特征成分轉(zhuǎn)化形成的關(guān)鍵工序，而PPO是茶多酚轉(zhuǎn)化為紅茶品質(zhì)成分的關(guān)鍵酶[18]。PPO活性受發(fā)酵葉溫的調(diào)控，傳統(tǒng)紅茶生產(chǎn)中發(fā)酵葉溫一般為30 ℃左右[19]，采用先高溫(30 ℃左右)后低溫的發(fā)酵模式，有利于促進(jìn)PPO酶活性的激活和后期活性的保持，促進(jìn)初中級(jí)氧化產(chǎn)物的形成，充分發(fā)揮酶促氧化作用[18]。本研究表明，都勻毛尖茶PPO粗酶的最適反應(yīng)溫度為30 ℃，而此條件下發(fā)酵有利于與紅茶品質(zhì)呈正相關(guān)的茶黃素和茶紅素含量的累積[20-21]，為了更好地控制紅茶品質(zhì)，盡量控制發(fā)酵在最適溫度下進(jìn)行。本研究結(jié)果為都勻毛尖地方品種紅茶適制性研究提供參考。