453例胃癌患者胃黏膜幽門螺桿菌毒力相關(guān)基因分型及抗生素耐藥性分析▲

李倩倩 李偉之 饒秦文 吳育美

(1 西安醫(yī)學(xué)院附屬寶雞醫(yī)院胃腸鏡科，陜西省寶雞市 721006，電子郵箱：baolqianqian@163.com；2 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西省西安市 710061；3 陜西省寶雞市中心醫(yī)院消化科，寶雞市 721008)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)是定植于胃黏膜上皮細(xì)胞的革蘭陰性菌，Hp感染與多種胃腸疾病的發(fā)生有密切關(guān)系[1-2]。世界衛(wèi)生組織/國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)于1994年將Hp定為胃癌的Ⅰ類致癌原，也是當(dāng)前唯一確定為Ⅰ類致癌原的細(xì)菌性病原微生物[3]。全球近一半人群存在HP感染情況，然而Hp相關(guān)的胃潰瘍、十二指腸潰瘍發(fā)病率卻遠(yuǎn)不及其感染率高，且其患病類型多樣化[4]。微生物的血清型或基因型不同常會(huì)導(dǎo)致其感染與結(jié)局的差異，而病原菌的毒力是影響疾病程度的重要因素之一[5]。此外，細(xì)菌的抗生素耐藥現(xiàn)象也是當(dāng)前Hp根除治療中所面臨的重要問題。由于Hp分離培養(yǎng)和藥敏實(shí)驗(yàn)的開展相對(duì)比較困難，專家普遍建議通過了解當(dāng)?shù)氐目股啬退幝蕘頉Q定Hp的根除療法[6-7]。因此，本研究分析西安醫(yī)學(xué)院附屬寶雞醫(yī)院收治的453例胃癌患者Hp感染的情況，分析其毒力基因及分型，同時(shí)對(duì)Hp進(jìn)行抗生素敏感性試驗(yàn)，為了解該地區(qū)Hp對(duì)抗生素的耐藥性，以及臨床選擇治療方法提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月至2019年12月期間西安醫(yī)學(xué)院附屬寶雞醫(yī)院收治的453例胃癌患者作為研究對(duì)象，其中男性261例，女性192例，年齡58～73 (68.2±1.7)歲?；颊呔?jīng)胃鏡病理活檢確診，且經(jīng)13C呼氣試驗(yàn)檢測(cè)均呈陽性，排除1個(gè)月內(nèi)服用抗生素、鉍劑和質(zhì)子泵抑制劑者。本研究經(jīng)由我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 2.5 L微需氧產(chǎn)氣袋及密封培養(yǎng)盒(日本三菱化學(xué)株式會(huì)社，批號(hào)：9235ZJ-2)，阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星E-Test藥敏條均購自法國(guó)生物梅里埃公司(批號(hào)：412243、412315、412404、412393)，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、Taq PCR MasterMix擴(kuò)增試劑均購自北京天根生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：OSR-M401)，PCR儀和凝膠成像儀購自美國(guó)Bio-Rad公司，Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11637來源于本院實(shí)驗(yàn)室。

1.3 方法

1.3.1 Hp菌株的鑒定：取453例研究對(duì)象的胃黏膜組織標(biāo)本，經(jīng)全自動(dòng)組織研磨儀充分研磨后制成組織勻漿，用無菌膠頭滴管將組織混懸液接種于Hp選擇性培養(yǎng)基(重慶龐通醫(yī)療器械有限公司)上，在厭氧條件下用凡士林封口密閉培養(yǎng)，5～7 d后觀察培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，挑選出疑似Hp的菌落(透明細(xì)砂或水滴樣，針尖大小，0.1～1 mm直徑)，革蘭染色后鏡檢，氧化酶、脲酶和觸酶試驗(yàn)均呈陽性，可鑒定為Hp。本研究共獲得62株Hp臨床分離株，并于-80℃保存待檢。

1.3.2 Hp毒力相關(guān)基因分型檢測(cè)：本研究檢測(cè)的Hp毒力基因包括細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(cytotoxin-associated gene A,CagA)、細(xì)胞空泡毒素A(vacuolating cytotoxin A, VacA)s1、VacAs2、VacAm1、VacAm2，參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]對(duì)基因保守區(qū)域片段設(shè)計(jì)特異性引物，具體的特異性引物序列見表1所示。將凍存于-80℃的Hp臨床分離株在血平板中復(fù)蘇培養(yǎng)48 h，使用生理鹽水沖洗菌落后按照試劑盒說明書提取DNA。采用PCR進(jìn)行Hp毒力基因的擴(kuò)增和測(cè)序。PCR具體實(shí)驗(yàn)參數(shù)和步驟為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，52～60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共持續(xù)35個(gè)循環(huán)；72℃溫育5 min，4 ℃保存。必要時(shí)可對(duì)可疑條帶進(jìn)行膠回收后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 特異性引物序列

1.3.3 抗生素耐藥性試驗(yàn)：將凍存于-80℃的Hp臨床分離株在血平板中復(fù)蘇培養(yǎng)48 h，將復(fù)蘇成功并傳代一次的菌株用0.45%氯化鈉溶液稀釋為2.0麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙?，均勻涂布于M-Ⅱ血平皿中，并貼上阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星的E-test藥敏試條，于微需氧條件下培養(yǎng)3 d后觀察結(jié)果，于橢圓形抑菌環(huán)與E-Test試條交界點(diǎn)讀取最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)值。使用NCTC11637菌株作為質(zhì)控菌株。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示。

2 結(jié) 果

2.1 Hp毒力相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果 453例胃癌患者的胃黏膜標(biāo)本中共分離出62例Hp臨床菌株，其中CagA檢出率為100.0%(62/62)，VacAs1a、VacAs1a+VacAm1、VacAs1a+VacAm2、VacAs1a+VacAs1c+VacAm2、VacAs1c+VacAm2和VacAm1+VacAm2檢出率依次為19.35%(12/62)、46.77%(29/62)、8.06%(5/62)、8.06%(5/62)、8.06%(5/62)、9.68%(6/62)，大多數(shù)患者同時(shí)攜帶多個(gè)亞型。

2.2 Hp抗生素耐藥性試驗(yàn) 62株Hp臨床株，對(duì)阿莫西林的耐藥率最高，達(dá)到79.03%(49/62)，MIC范圍為0.016～32.000 mg/L；對(duì)克拉霉素的耐藥率為61.29%(38/62)，MIC范圍為0.016～256.000 mg/L；對(duì)甲硝唑的耐藥率為58.06%(36/62)，MIC范圍為0.016～125.000 mg/L；對(duì)左氧氟沙星的耐藥率為22.58%(14/62)，MIC范圍為0.008～32.000 mg/L；對(duì)四聯(lián)抗生素的耐藥率為20.97%(13/62)，MIC范圍為0.006～24.000 mg/L。

3 討 論

Hp感染率高而胃腸道疾病發(fā)病率低、發(fā)病表型多樣化的特點(diǎn)已逐漸引起學(xué)者們廣泛關(guān)注，但其具體機(jī)制仍未完全明確，一般認(rèn)為Hp的毒力相關(guān)基因可能是其中一項(xiàng)原因。研究表明，Hp的主要毒力因子涉及黏附、炎癥、免疫等方面，包括CagA、VacA、上皮細(xì)胞接觸誘導(dǎo)因子(induced by contact with epithelium gene A,IceA)、前炎性外膜蛋白等[8]。本研究結(jié)果顯示，62例Hp臨床菌株中CagA檢出率占100.0%(62/62)，而VacAs1a、VacAs1a+VacAm1、VacAs1a+VacAm2、VacAs1a+VacAs1c+VacAm2、VacAs1c+VacAm2和VacAm1+VacAm2檢出率依次為19.35%、46.77%、8.06%、8.06%、8.06%、9.68%，說明大多數(shù)患者同時(shí)攜帶多個(gè)亞型。有學(xué)者認(rèn)為，IceA基因的IcaA1亞型可能與胃潰瘍的發(fā)生密切相關(guān)[9]。VacA基因根據(jù)其S區(qū)、M區(qū)可分為2個(gè)等位基因，其中VacAs1m1較VacAs1m2具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，而VacAs2m2無細(xì)胞毒性[10]。最近的研究也顯示VacAs1相關(guān)亞型與消化道炎癥有相關(guān)性，而VacAs2相關(guān)亞型并未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性[11]。本研究未檢測(cè)到VacAs2亞型菌株，可能與本研究只納入胃癌患者及樣本量較少有關(guān)。

Hp感染盡管僅部分發(fā)生于消化道潰瘍、Hp相關(guān)消化不良、惡性腫瘤，但感染者幾乎都存在慢性活動(dòng)性胃炎，即Hp胃炎?！兜谖宕稳珖?guó)幽門螺桿菌感染處理共識(shí)報(bào)告》指出，對(duì)于Hp胃炎患者應(yīng)采取根除療法，包括無癥狀患者[12]，而Hp的根除治療多根據(jù)區(qū)域內(nèi)抗生素的耐藥情況而制定。本研究結(jié)果顯示，62株Hp臨床株中，對(duì)阿莫西林的耐藥率最高，達(dá)到79.03%，而對(duì)左氧氟沙星的耐藥率最低，為 22.58%?！兜谖宕稳珖?guó)幽門螺桿菌感染處理共識(shí)報(bào)告》推薦如果該區(qū)域內(nèi)Hp對(duì)兩種抗生素的雙重耐藥率>39.3%，則不推薦含這兩種抗生素的非鉍劑四聯(lián)療法，提示該區(qū)域尚可使用含其他抗生素的方案，但仍需密切關(guān)注抗生素耐藥率的動(dòng)態(tài)變化[12]。本研究中，Hp對(duì)四聯(lián)抗生素的耐藥率為20.97%，均低于4種抗生素單獨(dú)用藥的耐藥率，因此可考慮我國(guó)拓展的相關(guān)鉍劑四聯(lián)方案[質(zhì)子泵抑制劑+鉍劑+阿莫西林+甲硝唑(或四環(huán)素)][12]。

綜上所述，我院胃癌患者胃黏膜Hp菌株毒力相關(guān)基因最常見為CagA基因，可使用耐藥性相對(duì)較低的左氧氟沙星或者抗生素四聯(lián)療法進(jìn)行治療。Hp感染與疾病發(fā)生相關(guān)性的研究中，除需進(jìn)一步了解毒力基因外，還應(yīng)該考慮宿主易感性因素、基因多態(tài)性或者多因素分析(如社會(huì)經(jīng)濟(jì)學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)等因素)可能產(chǎn)生的影響[13]，這也是我們下一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探討的方向。