卵巢上皮性癌組織中CXCL13、CXCR5表達(dá)觀察

劉瑩，張蓓，杭佳

1 徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇徐州221000； 2 徐州醫(yī)科大學(xué)徐州臨床學(xué)院

卵巢癌是一種高致死性婦科惡性腫瘤。病灶局限于卵巢的卵巢癌患者有約90%的無事件生存率，但超過70%的的患者確診時已處于晚期，疾病5年生存率僅為20%～30%[1]。探尋卵巢癌發(fā)生發(fā)展的具體作用機(jī)制，對卵巢癌的治療及預(yù)后具有重要意義。

趨化因子是一種低分子量、具有保守的二級結(jié)構(gòu)及超二級結(jié)構(gòu)的蛋白家族[2]，趨化因子受體是異三聚體G蛋白偶聯(lián)7跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域超家族[3]，CXC亞家族趨化因子13(CXCL13)/CXC亞家族趨化因子13受體(CXCR5)信號軸是趨化因子信號通路中的一種，CXCL13由基質(zhì)細(xì)胞在次級淋巴組織的B細(xì)胞區(qū)域(如脾、淋巴結(jié)、扁桃體和派爾集合淋巴結(jié))分泌[4]，CXCR5在成熟循環(huán)B淋巴細(xì)胞、部分濾泡輔助性T細(xì)胞和皮膚來源的遷移樹突狀細(xì)胞上高度表達(dá)，并控制它們趨近CXCL13的梯度，向二級淋巴器官遷移[5]。CXCL13及CXCR5的異常表達(dá)及結(jié)合可通過激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號、PI3K-AKT通路等影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，如前列腺癌、乳腺癌、喉鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌等[6～9]，但CXCL13、CXCR5在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)及其作用機(jī)制目前尚無研究。2018年12月～2019年12月，我們觀察了卵巢上皮性癌組織CXCL13、CXCR5的表達(dá)變化，并分析癌組織中CXCL13、CXCR5的表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年1月～2014年6月在徐州市中心醫(yī)院和徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦科收治的卵巢上皮性癌患者80例，術(shù)前均未接受化療、放療或者激素治療，均行卵巢癌全面分期手術(shù)或腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，術(shù)后規(guī)律化療，鉑類為基礎(chǔ)化療≥4次，病理證實為卵巢上皮性癌，根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2009年的分期標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ期10例、Ⅱ期12例、Ⅲ期45例、Ⅳ期13例，其中Ⅰ～Ⅱ期為早期、Ⅲ～Ⅳ期為晚期；根據(jù)組織學(xué)類型分類為漿液性癌56例、黏液性癌12例、子宮內(nèi)膜樣癌6例、透明細(xì)胞癌 6例；根據(jù)病理分化程度分類為高分化12例、中分化13例、低分化55例。其病理診斷均經(jīng)兩位有5年以上經(jīng)驗的副高級以上病理科醫(yī)師確診，患者臨床病理資料均完整，術(shù)中保留卵巢上皮癌組織80例份(觀察組)。另取同期因子宮肌瘤或?qū)m頸良性病變行子宮及一側(cè)(或雙側(cè))附件切除術(shù)，且術(shù)后經(jīng)病理檢查證實為正常卵巢組織標(biāo)本40例份作為對照組。本研究經(jīng)各醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，樣本采集取得患者本人或家屬知情同意。

1.2 癌組織及正常卵巢組織CXCL13、CXCR5檢測 采用免疫組化法。甲醛固定組織標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋， 4μm切片，實驗步驟按照超敏兔二步法檢測試劑盒說明書進(jìn)行，經(jīng)烤片、脫蠟、水化后，EDTA抗原修復(fù)液微波進(jìn)行抗原修復(fù)高火3 min，低火7 min，冷卻、PBS沖洗；滴加一抗(CXCL13一抗滴度1∶150，CXCR5一抗滴度為1∶100；以 PBS代替一抗為陰性對照)，37 ℃孵育1.5 h，PBS沖洗；滴加二抗(快捷型酶標(biāo)羊抗兔IgG聚合物)，室溫孵育20 min，PBS沖洗；滴加DAB顯色液，顯微鏡下觀察并控制顯色時間，每張切片顯色1～2 min，自來水沖洗終止顯色；蘇木素復(fù)染、返藍(lán)、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片固定。CXCL13多克隆抗體購自美國NOVUS公司，CXCR5多克隆抗體購自英國Abcam公司；超敏兔二步法檢測試劑盒、抗體稀釋液、DAB等均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。CXCL13主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，CXCR5主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜。400倍鏡下由兩位病理科醫(yī)師隨機(jī)選取5個不同視野的代表性區(qū)域，采用乘法積分法進(jìn)行判定，依照陽性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度進(jìn)行評分，陽性細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞比例<5%計0分、5%～25%計1分、25%～50%計2分、50%～80%計3分、≥80%計4分；細(xì)胞染色強(qiáng)度為無著色計0分、淡黃色計1分、棕黃色計2分、棕褐色計3分，細(xì)胞染色強(qiáng)度評分和陽性細(xì)胞比例評分相乘得到最終得分，5個視野取平均值。總分0～4分為陰性表達(dá)、5～12分為陽性表達(dá)，并計算CXCL13、CXCR5陽性表達(dá)率。

1.3 預(yù)后隨訪方法 以電話或來院復(fù)查形式對80例卵巢上皮性癌患者進(jìn)行隨訪，患者手術(shù)日期為隨訪起點，死亡日為隨訪終點，隨訪截止時間為2019年06月30日，隨訪時間為60～107個月(中位隨訪時間74個月)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS Version 25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理。癌組織與正常組織CXCL13、CXCR5的表達(dá)比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用四格表χ2檢驗，預(yù)后情況采用Kaplan-Meier生存分析及Cox回歸分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CXCL13、CXCR5陽性表達(dá)率比較 觀察組、對照組CXCL13陽性表達(dá)率分別為56.25%(45/80)、15.0%(6/40)(χ2= 18.568，P=0.000)，觀察組、對照組CXCR5陽性表達(dá)率分別為48.75%(39/80)、7.5%(3/40)(χ2= 19.945，P=0.000)。

2.2 卵巢上皮性癌組織CXCL13、CXCR5表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 卵巢上皮性癌組織CXCL13、CXCR5陽性表達(dá)與FIG0分期晚、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡、病理類型及腫瘤直徑均無關(guān)(P均>0.05)，見表1。

表1 不同卵巢上皮性癌患者癌組織CXCL13、 CXCR5陽性率

2.3 卵巢上皮性癌組織CXCL13、CXCR5表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 80例患者中，卵巢上皮性癌組織CXCL13表達(dá)陰性、陽性者的生存時間分別為52.2、32.4月(χ2= 9.179，P=0.002)。卵巢上皮性癌組織CXCR5表達(dá)陰性、陽性的生存時間分別為51.0、31.5月(χ2= 11.836，P=0.001)。年齡、病理類型不是影響卵巢上皮性癌預(yù)后的危險因素(P均>0.05)；病理學(xué)分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、原發(fā)腫瘤最大直徑、術(shù)后殘留灶直徑、CXCL13及CXCR5陽性表達(dá)為影響卵巢上皮性癌預(yù)后的重要危險因素(P均<0.05),見表2。將病理學(xué)分化程度、FIGO分期、原發(fā)腫瘤最大直徑、術(shù)后殘留灶直徑、CXCL13及CXCR5納入Cox多因素分析，結(jié)果顯示病理分化程度、FIGO分期、原發(fā)腫瘤最大直徑、術(shù)后殘留灶直徑是卵巢上皮性癌的獨立預(yù)后因素，見表3。

表2 卵巢上皮性癌患者預(yù)后的單因素COX分析結(jié)果

表3 卵巢上皮性癌患者預(yù)后的Cox多因素分析結(jié)果

3 討論

趨化因子是一種低分子量、具有保守的二級結(jié)構(gòu)及超二級結(jié)構(gòu)的蛋白家族，根據(jù)氨基酸排列順序及連接多肽的二硫鍵不同分4類：C、CC、CXC和CX3C，趨化因子受體是異三聚體G蛋白偶聯(lián)7跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域(GPCR-7TM)超家族，趨化因子配體/受體的相互作用，對特異性白細(xì)胞亞群精細(xì)調(diào)節(jié)、細(xì)胞吸引起關(guān)鍵作用[10]。CXCL13/CXCR5信號軸是趨化因子信號軸中的一種，異常表達(dá)的CXCL13/CXCR5信號通路與多種實體腫瘤的遷移、侵襲、免疫相關(guān)[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CXCL13及CXCR5在卵巢癌組織的陽性表達(dá)率均高于正常卵巢組織，與在乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌[9, 12, 13]中的相關(guān)研究結(jié)論一致，提示CXCL13/CXCR5異常表達(dá)可能與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

在前列腺癌組織中，腫瘤微環(huán)境中CXCL13及CXCR5相互作用可能通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK), PI3K/AKT,應(yīng)激活化蛋白激酶 (SAPK)/c-jun 蛋白激酶(JNK),及 C型蛋白激酶(PKCε)/ NF-κB等信號通路，促進(jìn)前列腺癌腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[6]。雄激素/雄激素受體誘導(dǎo)的CXCL13過表達(dá)可增加前列腺癌細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白B1(Cyclin B1)、轉(zhuǎn)錄因子Ets-1和鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail的產(chǎn)生，從而促進(jìn)了細(xì)胞周期和細(xì)胞相(G2/M)的轉(zhuǎn)變，增強(qiáng)雄激素受體介導(dǎo)的前列腺腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、遷移和侵襲[14]。在乳腺癌中，CXCL13/CXCR5信號通路可能通過ERK介導(dǎo)釋放炎性細(xì)胞因子白介素(IL-1β)和腫瘤壞死因子促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展[7]。也有研究[15]表明CXCR5的表達(dá)升高可能有助于缺乏功能性抑癌基因p53的乳腺腫瘤的異常細(xì)胞存活和遷移。在結(jié)直腸癌中，CXCL13/CXCR5信號軸可能激活PI3K/AKT通路，通過分泌基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-13促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)病、遷移和侵襲[16]。在肺癌中，CXCL13/CXCR5相互作用誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)分泌磷蛋白1 (SPP1)，SPP1可能形成一個正反饋循環(huán)網(wǎng)絡(luò)，通過激活和核本地化上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞上的β連環(huán)蛋白促進(jìn)EMT和肺癌進(jìn)展[17]。本研究對CXCL13及CXCR5表達(dá)情況與卵巢上皮性癌臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析，CXCL13及CXCR5的表達(dá)與患者年齡、病理類型及腫瘤直徑均無顯著關(guān)系，CXCL13表達(dá)與更高的FIGO分期、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，CXCR5表達(dá)與病理分化差、更高的FIGO分期及伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示CXCL13及CXCR5與卵巢癌轉(zhuǎn)移、遷徙、進(jìn)展相關(guān)，可作為評估腫瘤進(jìn)展的指標(biāo)。根據(jù)CXCL13及CXCR5的生理作用及在其他癌癥中的作用機(jī)制，推測可能通過細(xì)胞內(nèi)促癌信號通路激活，影響癌細(xì)胞自身增值、轉(zhuǎn)移、侵襲能力；或通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞組成及分化，調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲，其具體的信號傳遞機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，CXCL13及CXCR5陽性表達(dá)卵巢上皮性癌患者的生存時間更短，多因素相關(guān)分析顯示病理分化程度、FIGO分期、原發(fā)腫瘤最大直徑、術(shù)后殘留灶直徑是影響卵巢癌預(yù)后的獨立危險因素，而CXCL13及CXCR5不是影響卵巢上皮性癌預(yù)后的獨立危險因素，但根據(jù)CXCL13及CXCR5臨床病理學(xué)因素的相關(guān)性，及單因素分析其為影響卵巢上皮性癌預(yù)后的危險因素，推測CXCL13及CXCR5可能通過影響卵巢上皮性癌進(jìn)展某過程而影響預(yù)后，可作為判斷卵巢上皮性癌患者預(yù)后的參考指標(biāo)，阻斷CXCL13及CXCR5途徑可能有望為新的抗腫瘤治療的可能靶點。

本研究為回顧性研究，存在選擇偏倚可能，實驗僅采用臨床標(biāo)本進(jìn)行免疫組化研究，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量及用其他實驗方法驗證研究結(jié)果，對CXCL13及CXCR5與卵巢上皮性癌的具體關(guān)系有待進(jìn)一步探索，其調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲具體的信號傳導(dǎo)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，卵巢上皮性癌組織中CXCL13、CXCR5表達(dá)升高。CXCL13、CXCR5與FIG0分期晚、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，病理分化程度、FIGO分期、原發(fā)腫瘤最大直徑、術(shù)后殘留灶直徑是卵巢上皮性癌的獨立預(yù)后因素。CXCL13、CXCR5可能參與了卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展，可作為卵巢上皮性癌不良預(yù)后的參考指標(biāo)及潛在治療靶點。