宮頸癌組織中微小RNA-585、性別決定區(qū)Y-box 9 mRNA的表達(dá)變化及其臨床意義

朱軍，姚超

十堰市婦幼保健院，湖北十堰 442000

宮頸癌是全球女性中第二大常見(jiàn)腫瘤，也是腫瘤相關(guān)死亡的第四大原因[1]。盡管目前已經(jīng)使用包括手術(shù)、化療、放療和靶向治療在內(nèi)的綜合治療來(lái)改善宮頸癌患者的臨床癥狀，但是患者的預(yù)后仍然不滿意，5年生存率較低，約為40%[2]。因此新的宮頸癌治療手段迫切需要研究。微小RNA(miRNA)是一類由19～25個(gè)核苷酸組成的新型小型非編碼RNA，可參與細(xì)胞發(fā)育、增殖、轉(zhuǎn)移、代謝、分化、細(xì)胞周期和凋亡等生物學(xué)過(guò)程[3]。近幾十年，miRNA在腫瘤中的生物學(xué)功能成為腫瘤研究的熱點(diǎn)，可以作為腫瘤治療靶點(diǎn)抑制惡性腫瘤進(jìn)展[4]。miR-585是新近發(fā)現(xiàn)的miRNA之一，首次在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中被報(bào)道，被認(rèn)為是NSCLC復(fù)發(fā)的預(yù)后標(biāo)志物[5]。miR-585可抑制結(jié)直腸癌、NSCLC和胃癌的發(fā)生發(fā)展[6]，miR-585在宮頸癌中的研究未見(jiàn)有報(bào)道。此外miRNA可通過(guò)降解mRNA或抑制翻譯在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)性別決定區(qū)Y-box 9(SOX9)可能是miR-585的靶基因，SOX9在不同的腫瘤中的表達(dá)水平及發(fā)揮的作用不同[7]，同時(shí)在宮頸癌中發(fā)揮的作用仍有爭(zhēng)議[8]。我們觀察了宮頸癌組miR-585、SOX9 mRNA的表達(dá)變化情況，并探討其臨床意義?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月～2014年1月期間我院診治的宮頸癌患者80例(觀察組)，年齡30～62(45.87±12.63)歲，>50歲者52例，≤50歲者28例；宮頸鱗癌48例，腺癌32例；FIGO分期為ⅠA2期10例，ⅠB1期19例，ⅠB2期22例，ⅡA1期18例，ⅡA2期11例；組織學(xué)分級(jí)為中高分化45例，低分化35例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57例；浸潤(rùn)深度：淺肌層例37例，深肌層43例。納入標(biāo)準(zhǔn)：初次診治，未接受過(guò)放化療、免疫治療及靶向治療等抗腫瘤治療；穿刺活檢或術(shù)后組織經(jīng)2位病理專家明確診斷為宮頸癌；完整的臨床病例資料和隨訪資料。及排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；患有嚴(yán)重的宮頸炎；患有威脅生命健康的全身性疾病。另選擇宮頸良性病變(子宮肌瘤)組織40例作為正常對(duì)照組，年齡35～58(47.36±9.24)歲，兩組年齡具有可比性。兩組均行手術(shù)切除腫瘤或子宮肌瘤，術(shù)中保存保留宮頸癌及宮頸良性病變組織。本研究倫理由我院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，患者及家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑與儀器 DP501 miRcute miRNA 提取分離試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；PrimeScriptTM RT Reagent Kit試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；miR-585、SOX9、內(nèi)參U6和GAPDH引物由美國(guó)Invitrogen公司合成；Nanodrop2000分光光度儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；7500熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3 宮頸癌及宮頸良性病變組織miR-585、SOX9 mRNA檢測(cè) 應(yīng)用qRT-PCR法。手術(shù)中切除新鮮病理組織快速置于-80 ℃液氮凍存后，按照miRNA 提取分離試劑盒說(shuō)明書(shū)提取組織中總的RNA，測(cè)得RNA的濃度和純度后，放置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ蕴崛〉目俁NA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)合成cDNA。以cDNA為模板，按照qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：94 ℃、4 min，94 ℃、30 s，60 ℃、1 min，72 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)反應(yīng)復(fù)孔，得到各樣品的循環(huán)閾值(threshold cvcle，Ct)。以U6基因?yàn)閮?nèi)參，以2-ΔΔCt代表miR-585相對(duì)表達(dá)量，其中ΔCt=CtmiR-585-CtU6。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，以2-ΔΔCt法代表SOX9 mRNA相對(duì)表達(dá)量，其中ΔCt=CtSOX9-CtU6。miR-585引物F: 5′-ACGCGTTCTCCTTACCATCCCTGA-3′, R: 5′-CGATCTGGAAGTAACCCAAGCC-3′；SOX9引物F: 5′-AGCGAACGCACATCAAGAC-3′, R: 5′-CTGTAGGCGATCTGTTGGGG-3′；內(nèi)參U6引物F: 5′-GATTCCTATGTGGGCGACGAG-3′, R: 5′-CCATCTC-TTGCTCGAAGTCC-3′。內(nèi)參GAPDH引物F: 5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′, R: 5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′。

1.4 隨訪方法 觀察組術(shù)后每1～3個(gè)月隨訪1次，由專業(yè)隨訪人員采用電話及門(mén)診的方式進(jìn)行，隨訪時(shí)間為術(shù)后60個(gè)月，直至患者死亡或者截止到隨訪時(shí)間2019年1月。收集數(shù)據(jù)，計(jì)算患者生存時(shí)間。

1.5 miR-585與SOX9靶向關(guān)系的預(yù)測(cè) 利用Target Scan7.2生物學(xué)信息軟件(tp://www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測(cè)miR-585與SOX9靶向關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 兩組miR-585和SOX9 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 觀察組、對(duì)照組miR-585相對(duì)表達(dá)量分別為0.83±0.39、1.00±0.36，二者比較，P<0.05；觀察組、對(duì)照SOX9 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.48、1.46±0.75，二者比較，P<0.05。

2.2 miR-585、SOX9 mRNA表達(dá)與宮頸癌組織患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 見(jiàn)表1。miR-585、SOX9 mRNA的表達(dá)與宮頸癌患者的年齡、組織類型和組織學(xué)分級(jí)均無(wú)關(guān)(P均>0.05)，與宮頸癌患者FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)深度顯著相關(guān)(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同臨床病理參數(shù)的宮頸癌患者癌組織 miR-585、SOX9 mRNA表達(dá)

2.3 宮頸癌組織中miR-585、SOX9 mRNA表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響 80例宮頸癌患者成功隨訪73例，有7例失訪病例，共45例患者5年內(nèi)死亡，5年生存率為38.36%(28/73)。

按miR-585在宮頸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量平均數(shù)0.83為界，將80例宮頸癌患者分為miR-585低表達(dá)患者(41例)和miR-585高表達(dá)患者(39例)，繪制Kaplan-Meier生存曲線，miR-585低表達(dá)組失訪3例，38例中死亡29例，5年生存率為23.68%(9/38)；miR-585高表達(dá)組失訪4例，35例中死亡16例，5年生存率為54.29%(19/35)；與miR-585高表達(dá)患者相比，miR-585低表達(dá)患者預(yù)后較差(χ2=7.11，P=0.008)。按SOX9 mRNA在宮頸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量平均數(shù)1.46為界，將80例宮頸癌患者分為SOX9低表達(dá)患者(49例)和SOX9高表達(dá)患者(31例)，繪制Kaplan-Meier生存曲線，SOX9低表達(dá)組失訪4例，45例中死亡23例，5年生存率為48.89%(22/45)；SOX9高表達(dá)組失訪3例，28例中死亡22例，5年生存率為21.43%(6/28)；與SOX9mRNA低表達(dá)患者相比，SOX9mRNA高表達(dá)患者預(yù)后較差(χ2=6.57，P=0.010)。

2.4 miR-585與SOX9mRNA靶向關(guān)系 SOX9的3′UTR區(qū)存在miR-585的結(jié)合位點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-585與SOX9的3′UTR區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)

2.5 miR-585和SOX9mRNA在宮頸癌組織中表達(dá)相關(guān)性 miR-585與SOX9mRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.315，P=0.006)。

3 討論

宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一[1]。其中，34～44歲年齡組女性是宮頸癌高發(fā)人群。由于宮頸癌患者早期癥狀不明顯，晚期患者出現(xiàn)迄今已確定的兩種轉(zhuǎn)移類型，包括淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移，使得目前宮頸癌的治療手段有限，達(dá)不到預(yù)期的治療效果，轉(zhuǎn)移性宮頸癌預(yù)后十分差，中位生存期僅為8～13個(gè)月，與其他腫瘤一樣，轉(zhuǎn)移進(jìn)展是宮頸癌治療的難點(diǎn)[9]。針對(duì)晚期患者的分子靶向藥物開(kāi)啟了惡性腫瘤的全新治療治療模式，宮頸癌現(xiàn)有的分子靶向藥物并不能達(dá)到理想的臨床治療效果，在現(xiàn)有的治療基礎(chǔ)上尋找不同的分子靶向藥物，實(shí)施聯(lián)合治療的方法為宮頸癌的治療提供新的方向[10]。目前人乳頭瘤病毒HPV被認(rèn)為是宮頸癌主要的致病因子，超過(guò)99%的宮頸癌患者持續(xù)存在HPV感染，此外還有許多與致癌作用有關(guān)的危險(xiǎn)因素[11]，但是宮頸癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，因此探索宮頸癌進(jìn)展過(guò)程的分子機(jī)制對(duì)于新型治療靶標(biāo)的開(kāi)發(fā)是迫切需要的。

已知超過(guò)四分之一的人類miRNA在至少一種腫瘤類型中顯著失調(diào)，這表明miRNA可能代表腫瘤惡性進(jìn)展過(guò)程中新型基因調(diào)節(jié)因子之一[12]。已經(jīng)在多種類型的腫瘤中鑒定出miRNA異常表達(dá)譜，這些成千上百個(gè)表達(dá)失調(diào)的miRNA可以通過(guò)作為癌基因或腫瘤抑制因子發(fā)揮致癌作用[4，5]。越來(lái)越多的研究表明，各種miRNA參與了宮頸癌的進(jìn)展，是宮頸癌潛在的治療靶點(diǎn)和預(yù)后生物標(biāo)志物[6]。miR-585是眾多抑癌因子之一，目前關(guān)于miR-585的研究較少，Chen等[13]報(bào)道m(xù)iR-585表達(dá)升高參與冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)生；循環(huán)腫瘤RNA_102958通過(guò)miR-585/CDC25B軸在結(jié)直腸癌中發(fā)揮新型致癌作用[8]；在NSCLC組織和細(xì)胞系中miR-585的表達(dá)下調(diào)，miR-585的異位表達(dá)在體外抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力以及在體內(nèi)miR-585降低了裸鼠中異種移植腫瘤的生長(zhǎng)速度[9]。而miR-585在宮頸癌中的表達(dá)情況未知，本文采用qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-585在宮頸癌組織中表達(dá)下調(diào)，并與患者的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度和生存預(yù)后較差顯著相關(guān)，可能是抑癌因子，與miR-585在胃癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，并且miR-585的表達(dá)與胃癌侵襲程度、TNM分期、淋巴結(jié)侵襲和預(yù)后不良相關(guān)的結(jié)果[10]相似。本研究結(jié)果提示miR-585可能是宮頸癌預(yù)后不良生物標(biāo)志物和治療候選靶標(biāo)。

成熟miRNA是通過(guò)與靶基因的3′非翻譯區(qū)(UTR)內(nèi)的種子位點(diǎn)互補(bǔ)結(jié)合引起mRNA的降解或翻譯抑制來(lái)參與多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)控[4]。miRNA的靶基因不止一個(gè)，在腫瘤中已經(jīng)證實(shí)的miR-585靶基因有CDC25B、hSMG-1和MAPK1[8]，我們采用Target Scan7.2生物學(xué)信息軟件發(fā)現(xiàn)SOX9的3′UTR區(qū)存在miR-585的結(jié)合位點(diǎn)，可能是miR-585的靶基因。SOX9屬于SOX家族成員之一，由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，包括保守的高遷移率基團(tuán)(HMG)。SOX9是HMG-box類中的轉(zhuǎn)錄因子，影響細(xì)胞的存活、增殖和分化，SOX9依賴于腫瘤的來(lái)源可以作為癌基因和腫瘤抑制因子[11，12]。而目前SOX9在宮頸癌中的報(bào)道不一致，研究[13]發(fā)現(xiàn)，與正常宮頸組織相比，原位宮頸癌尤其是浸潤(rùn)性宮頸癌中SOX9的表達(dá)逐漸降低。SOX9的過(guò)表達(dá)抑制體外細(xì)胞生長(zhǎng)和體內(nèi)腫瘤形成，為抑癌基因。Liu等[8]報(bào)道SOX9在宮頸癌組織中表達(dá)增加，并作為miR-215-3p的靶基因促進(jìn)宮頸癌的進(jìn)展。此外，SOX9表達(dá)升高促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的化學(xué)耐藥[9]。本文采用qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SOX9在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，并與患者的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度和生存預(yù)后較差顯著相關(guān)，可能是促癌因子，與Liu等[8]的研究一致，而與研究[13]相反，可能是樣本來(lái)源和樣本量等不同導(dǎo)致的。同時(shí)我們分析了miR-585和SOX9兩者在宮頸癌組織中的表達(dá)相關(guān)性，結(jié)果顯示兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，表明miR-585可能通過(guò)負(fù)調(diào)控SOX9抑制宮頸癌進(jìn)展，但其具體作用機(jī)制仍需后續(xù)探討。

綜上所述，宮頸癌組織中miR-585表達(dá)增加，SOX9 mRNA表達(dá)降低，兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，miR-585可能通過(guò)靶向SOX9 mRNA抑制宮頸癌的進(jìn)展。miR-585 和SOX9 mRNA均與患者不良預(yù)后相關(guān)，可能是宮頸癌患者預(yù)后不良的生物標(biāo)志物和治療的新型靶點(diǎn)。