饑餓誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的自噬應(yīng)答觀察

劉宇坤，胡楊，卯升義，許安永，鄒迪，熊喆，成文敏，趙紅業(yè)1,

1 大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，大理 671000；2 云南省動(dòng)物基因編輯與體細(xì)胞克隆技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院；4云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院；5 云南省異種器官移植工程研究中心

乳腺癌是一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，根據(jù)激素狀態(tài)可分為激素受體陽性、人類表皮生長因子2(HER-2)陽性和三陰性等不同亞型[1]。2019年美國乳腺癌新診斷病例數(shù)占全部新診斷腫瘤病例數(shù)的30%[2]。我國每年新發(fā)乳腺癌患者約30.4萬例，其中發(fā)展中地區(qū)發(fā)病率略高于發(fā)達(dá)地區(qū)。他莫昔芬、依西美坦等抗腫瘤藥物可通過干擾激素的合成治療激素受體陽性型乳腺癌，曲妥株單抗可用于治療HER-2陽性型乳腺癌[3]。三陰性乳腺癌患者無法進(jìn)行靶向治療，主要治療方法為化療，但化療易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐受，達(dá)不到理想的治療效果[4]，且化療后患者復(fù)發(fā)概率較大。研究[5]認(rèn)為，具有耐藥性的休眠癌細(xì)胞發(fā)生了傳播是三陰性乳腺癌復(fù)發(fā)的原因之一，這種特殊的耐藥機(jī)制可能源于自噬對(duì)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。自噬(autophagy)是真核細(xì)胞中一種高度保守的細(xì)胞生物學(xué)行為，是細(xì)胞自體的吞噬、消化過程，可為細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)和能量，維持細(xì)胞的代謝平衡，緩解應(yīng)激壓力[6]。當(dāng)遇到不利環(huán)境，如營養(yǎng)缺乏、代謝受阻、輻射、抗癌藥物等外界因素刺激時(shí)，細(xì)胞會(huì)發(fā)生自噬，作為一個(gè)暫時(shí)的生存機(jī)制[7]。LC3B的增加是自噬的重要標(biāo)志。自噬相關(guān)基因(autophagy related gene, ATG)的表達(dá)是形成自噬體的關(guān)鍵因素，參與調(diào)控自噬過程。自噬調(diào)控機(jī)制的失調(diào)與惡性腫瘤、自身免疫疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。自噬抑制劑巴弗洛霉素通過抑制自噬基因ATG5、BECN1、ATG10的激活，提高天然抗癌化合物對(duì)人鱗癌、膠質(zhì)母瘤細(xì)胞的毒性[8]。ATG7表達(dá)被降低后，腫瘤微環(huán)境形成受到抑制[9,10]，ATG4B拮抗劑可抑制骨肉瘤腫瘤的形成[11]。Beclin1缺失的小鼠更容易患淋巴瘤、肺癌和卵巢癌等上皮細(xì)胞及造血系統(tǒng)類腫瘤[12,13]，表明癌細(xì)胞中自噬水平的高低在惡性腫瘤的發(fā)生、逃避和抵抗中發(fā)揮重要作用。因此，了解自噬相關(guān)基因?qū)ψ允傻恼{(diào)控作用，開發(fā)控制自噬的特異性藥物，將有利于解決三陰性乳腺癌的耐藥性問題。

我們觀察了饑餓條件下三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的自噬應(yīng)答水平，檢測(cè)自噬相關(guān)基因ATG4A和ATG7，并探討其相關(guān)分子機(jī)制，旨在為臨床上三陰性乳腺癌的靶向治療提供新治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購于上海中科院細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、Earle′s平衡鹽溶液(EBSS)購于美國Gibco公司，巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1)購于上海生工生物工程有限公司；雙抗(青霉素-鏈霉素)購于Biological industries；胎牛血清購于ExCell Bio公司；微管相關(guān)蛋白輕鏈1(LC3B)、β-actin、自噬相關(guān)蛋白7(ATG7)一抗購于美國Sigma公司；自噬相關(guān)蛋白4A(ATG4A)一抗購于美國圣克魯司公司；Trizol 購于賽默飛世爾公司；Prime-Script RT試劑盒、SYBR酶購于美國Takara公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、發(fā)光顯色液、蛋白提取試劑(RiPA Lysis Buffer)、蛋白 Marker和Western一抗稀釋液均購于碧云天生物科技有限公司；血清白蛋白購于北京索萊寶有限公司。

1.2 細(xì)胞饑餓處理及分組 取MDA-MB-231細(xì)胞，接種于涂有明膠的75 cm2細(xì)胞瓶中，培養(yǎng)于10 mL 含10%熱滅活胎牛血清、100 IU/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h換液一次，待細(xì)胞長至培養(yǎng)瓶80%左右進(jìn)行細(xì)胞傳代，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞分別接種于10 cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿和六孔板。細(xì)胞密度長至70%左右，將細(xì)胞分為四組，對(duì)照組加入DMEM培養(yǎng)液正常培養(yǎng)，Baf-A1組在DMEM培養(yǎng)液中加入100 nM的Baf-A1，EBSS(饑餓)組加入EBSS培養(yǎng)液，EBSS+ Baf-A1(自噬阻斷)組在EBSS培養(yǎng)液中加入100 nM的Baf-A1，四組均處理8 h，備用。

1.3 各組細(xì)胞LC3B、ATG4A、ATG7 mRNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量法(Q-PCR)法。取各組細(xì)胞，Trizol提取總RNA，cDNA使用Prime-Script RT試劑盒合成。獲得的cDNA作為SYBR Greenbased q-PCR的模板(CFX-96,Bio-Rad, Hercules, CA, USA)，定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)各組LC3B、 ATG4A、ATG7 mRNA。引物序列由深圳華大基因有限公司合成，甘油-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，基因序列見文獻(xiàn)[14]。以2-ΔΔCT值代表目的基因相對(duì)表達(dá)量，重復(fù)3次取平均值。

1.4 各組細(xì)胞LC3B、ATG4A、ATG7蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。取各組細(xì)胞PBS洗滌2次，收集細(xì)胞，加入等體積通用蛋白裂解液(內(nèi)含1 μM的蛋白酶抑制劑)，4 ℃裂解15 min。4 ℃，13 500 rpm/min離心7 min提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。變性后，取30 μg總蛋白上樣，12%凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，放入5%血清白蛋白(BSA)中，常溫封閉2 h，阻止非特異性結(jié)合。加入一抗LC3B、ATG4A、ATG7、β-actin(工作濃度：1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000)，4 ℃孵育過夜。磷酸緩沖鹽溶液(PBST)洗膜，10 min×3次，加入配好的二抗(兔抗或鼠抗)，室溫下?lián)u床孵育2 h，PBST洗滌10 min×3次，化學(xué)發(fā)光ECL(Easysee Western Blotting Kit, Transgenes，中國)孵育1 min后成像系統(tǒng)(Bio-Rad, Hercules，美國)進(jìn)行顯影，以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)LC3B、ATG4A和ATG7蛋白的相對(duì)表達(dá)量，重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞LC3B、ATG7、ATG4A mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 各組細(xì)胞LC3B、ATG7、ATG4A mRNA相對(duì)表達(dá)量比較見表1。

表1 各組細(xì)胞LC3B、ATG7、ATG4A mRNA相對(duì) 表達(dá)量比較

2.2 各組細(xì)胞LC3B、ATG7、ATG4A 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 各組細(xì)胞LC3B、ATG7、ATG4A蛋白相對(duì)表達(dá)量見表2。

表2 各組細(xì)胞LC3B、ATG7、ATG4A 蛋白相對(duì)表達(dá)量 比較

3 討論

自噬是一種在應(yīng)激狀態(tài)下維持細(xì)胞內(nèi)外穩(wěn)態(tài)的分解代謝途徑，自噬在營養(yǎng)剝奪或其他類型的應(yīng)激條件下易被誘導(dǎo)，在此過程中LC3B通過幾種ATG蛋白與脂質(zhì)磷脂酰乙醇胺結(jié)合，隨后作為脂化的LC3BⅡ整合到自噬體膜中，因此LC3BⅡ的積累是反應(yīng)自噬水平的重要標(biāo)志。本研究中，EBSS組細(xì)胞LC3B mRNA的相對(duì)表達(dá)量和LC3BⅡ/LC3BⅠ均升高，表明EBSS可提高M(jìn)DA-MB-231細(xì)胞的自噬水平。細(xì)胞LC3BⅡ/LC3BⅠ上升除了自噬通量增加，還可能是因?yàn)樽允审w降解失敗[15]。為了區(qū)分這兩種情況，必須進(jìn)行溶酶體降解被阻斷的自噬通量實(shí)驗(yàn)，Baf-A1是自噬溶酶體抑制劑，可完全抑制溶酶體酸化，阻止自噬泡與溶酶體結(jié)合，達(dá)到阻斷自噬的作用[16]。本研究中，使用Baf-A1處理MDA-MB-231細(xì)胞，LC3BⅡ/LC3BⅠ在EBSS處理的基礎(chǔ)上進(jìn)一步積累，這個(gè)結(jié)果表明EBSS處理增加MDA-MB-231細(xì)胞的自噬體形成，不影響溶酶體的降解。

ATG7介導(dǎo)ATG12-ATG5共軛系統(tǒng)的形成，參與泛素化反應(yīng)，是傳統(tǒng)自噬形成的必要途徑。本研究結(jié)果中，自噬發(fā)生時(shí)ATG7 mRNA相對(duì)表達(dá)量上升，但是ATG7 蛋白表達(dá)不改變，這與Wang等[17]結(jié)果一致，大部分自噬相關(guān)基因表達(dá)的增加不依賴于自噬流量。另外，我們的研究發(fā)現(xiàn)Baf-A1可降低EBSS處理的ATG7 mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)，但是在阿霉素誘導(dǎo)自噬的研究中，巴弗洛霉素的阻斷處理不會(huì)改變MCF-7細(xì)胞中ATG7的表達(dá)[18]，這與我們的研究結(jié)果相反，這可能是由于細(xì)胞異質(zhì)性導(dǎo)致，但是具體原因還需要進(jìn)一步探索。哺乳動(dòng)物巨噬細(xì)胞可通過至少兩種不同的途徑發(fā)生自噬，包括依賴ATG5/ATG7的常規(guī)途徑和不依賴ATG5/ ATG7的替代途徑。ATG7在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)水平顯示，自噬誘導(dǎo)時(shí)ATG7 mRNA表達(dá)水平上升，自噬阻斷時(shí)ATG7 mRNA和蛋白水平均下降，由此結(jié)果表明，ATG7在EBSS誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞自噬過程中起到了重要作用，ATG5/ATG7途徑可能是EBSS誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞自噬的主要途徑。

ATG4A是半胱氨酸蛋白酶家族的一員，是ATG4的四種亞型之一，是ATG4的一個(gè)同源基因，介導(dǎo)LC3BⅠ的加工，從而參與自噬溶酶體的延伸，是調(diào)節(jié)自噬通量的中心節(jié)點(diǎn)。脂化LC3B促進(jìn)自噬體形成進(jìn)而結(jié)合溶酶體降解胞內(nèi)的大分子及細(xì)胞器，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，ATG4A的表達(dá)上調(diào)[17]，與我們的結(jié)果相反，而且在我們的結(jié)果中自噬阻斷時(shí)ATG4A表達(dá)也沒有發(fā)生變化。最新的研究表明ATG4缺陷的細(xì)胞中表達(dá)高水平的LC3B可以修復(fù)SQSTM1/p62的降解缺陷，維持細(xì)胞的自噬能力，ATG4的脂化作用不再是自噬小體形成和與溶酶體融合的必要條件[19]。因此推測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞饑餓條件下發(fā)生的自噬可能不涉及ATG4對(duì)LC3B的脂化，但其具體原因還需要進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)ATG7和ATG4A在EBSS處理MDA-MB-231細(xì)胞自噬過程中的作用進(jìn)行了初步的探討，但是這兩個(gè)基因在該細(xì)胞自噬中的具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。我們將借用siRNA干擾技術(shù)分別敲降以上兩個(gè)基因的表達(dá)水平，探索其在自噬過程中的具體分子機(jī)制。另外，除了MDA-MB-231細(xì)胞以外，我們也將對(duì)其他不同類型乳腺癌細(xì)胞自噬過程中ATG7和ATG4A的作用機(jī)制進(jìn)行探索。

綜上所述，EBSS處理的MDA-MB-231細(xì)胞自噬水平升高，LC3B、ATG7 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高，ATG4A mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，不影響溶酶體降解，其機(jī)制可能為ATG7 mRNA表達(dá)升高。