女陰硬化性苔蘚皮損黑素細(xì)胞和表皮厚度分析

高小曼 李子媛 孫凱律 常建民

北京醫(yī)院皮膚科 國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院100730

硬化性苔蘚（lichen sclerosus，LS）是一種慢性炎癥性皮膚疾病，可發(fā)生于全身各部位，其中以女性外陰部位最為常見［1-2］。女陰LS（VLS）多表現(xiàn)為對(duì)稱分布的瓷白色或灰白色斑片，同時(shí)可伴有水腫、糜爛、血皰、紫癜等［3］。由于本病以皮膚萎縮為特征，故以往稱為“硬化萎縮性苔蘚”，但近年發(fā)現(xiàn)，部分病例沒有發(fā)生皮膚萎縮，故將“萎縮”去除。我們通過分析LS皮損表皮黑素細(xì)胞以及厚度變化，探討LS最為突出的兩種臨床表現(xiàn)——色素減退和皮膚萎縮可能的病理學(xué)機(jī)制。

一、對(duì)象

VLS 組：2018 年6- 12 月于北京醫(yī)院皮膚科診治的15 例成年VLS 患者，年齡19 ～59 歲，經(jīng)臨床及病理活檢確診。根據(jù)外陰典型皮損病理表現(xiàn)分為初期組7例和后期組8例。分組標(biāo)準(zhǔn)：初期皮損可見棘層輕度不規(guī)則增厚，真皮淺層水腫，但尚無明顯均質(zhì)帶形成，大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，淋巴細(xì)胞接近表皮；后期皮損可見表皮角化過度，棘層細(xì)胞減少，基底細(xì)胞液化，真皮淺層膠原纖維變性形成均質(zhì)帶，其下方大量淋巴細(xì)胞呈帶狀浸潤(rùn)（圖1）。

對(duì)照組：隨機(jī)選擇2018 年6-12 月于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院婦科整形中心行外陰整形手術(shù)的15 例成年女性的外陰標(biāo)本，所有標(biāo)本經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色證實(shí)為正常皮膚組織。術(shù)前診斷分別為先天性陰唇肥厚11例、陰蒂包皮過長(zhǎng)2例、陰道松弛2例。

本研究符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》（www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/index.html）的要求，所有患者均簽署知情同意書。

二、方法

1.試劑：一抗為大鼠抗人多巴色素異構(gòu)酶（DCT）多克隆抗體和大鼠抗人細(xì)胞角蛋白14（Krt14）單克隆抗體，均由北京生命科學(xué)研究所制備，稀釋度1∶200。二抗為Alexa Fluor 546 驢抗大鼠IgG（H + L），產(chǎn)自美國(guó)ThermoFisher 公司，稀釋度1∶500。

2.免疫熒光染色檢測(cè)黑素細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、表皮全層厚度和表皮細(xì)胞層厚度：OCT包埋標(biāo)本，-80 ℃液氮冷凍，制作16 μm 厚冰凍切片，2.4%多聚甲醛溶液固定標(biāo)本，0.3%H2O2-甲醇溶液透膜處理，封閉液封閉，加入一抗，4 ℃下孵育8～24 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次15 min，加入二抗，4 ℃下孵育2 h，4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色30 min，50%甘油-DAPI溶液封片，-20 ℃條件保存。

圖1 不同時(shí)期女陰硬化性苔蘚皮損組織病理（HE×40） 1A：初期可見棘層不規(guī)則增厚，真皮淺層水腫，大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，淋巴細(xì)胞接近表皮；1B：后期可見角化過度，表皮萎縮，基底細(xì)胞液化，真皮淺層均質(zhì)帶形成，其下方大量淋巴細(xì)胞呈帶狀浸潤(rùn)

用Zeiss-M1 正置熒光顯微鏡（德國(guó)Zeiss 公司）拍攝免疫熒光染色圖像。使用Imaris x64 7.4 軟件（Bitplane 公司，瑞士）和ZEN blue edition 2012軟件（德國(guó)Zeiss公司）進(jìn)行圖像處理。在DCT染色切片中計(jì)算表皮黑素細(xì)胞數(shù)與基底層細(xì)胞總數(shù)的比值作為黑素細(xì)胞密度；在Krt14染色切片中測(cè)量表皮全層厚度和細(xì)胞層厚度，表皮全層厚度為皮膚表面至基底層最下方的垂直距離，表皮細(xì)胞層厚度為角質(zhì)層最下方至基底層最下方的垂直距離。每張切片選擇3 個(gè)視野，每個(gè)視野測(cè)量3 組真皮乳頭處和表皮突處的表皮全層厚度及表皮細(xì)胞層厚度，取平均值。

3.統(tǒng)計(jì)分析：應(yīng)用SPSS Statistics 20軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較；采用Welch′s anova方法比較3組間年齡和表皮細(xì)胞層厚度，采用Games-Howell檢驗(yàn)對(duì)表皮細(xì)胞層厚度進(jìn)行組間兩兩比較。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、結(jié)果

1.年齡比較：初期組（39.71±14.33）歲，后期組（35.25±11.20）歲，對(duì)照組（30.40±8.14）歲，3 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.535，P=0.257）。

2.表皮黑素細(xì)胞密度：免疫熒光染色顯示，黑素細(xì)胞分布在表皮基底層（圖2）。VLS 初期和后期組表皮黑素細(xì)胞密度均低于對(duì)照組（t = 4.952、8.203，均P＜0.001），且后期組低于初期組（t=2.560，P=0.016）。見表1。

3.表皮厚度：見圖3、表1。3組間表皮全層厚度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.487）。表皮細(xì)胞層厚度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007），其中，初期組與對(duì)照組（t=0.443，P=0.899）和后期組（t=1.484，P=0.354）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但后期組顯著低于對(duì)照組（t=3.811，P=0.003）。

四、討論

皮膚色素減退在臨床上非常常見，出現(xiàn)的原因可能是原發(fā)性黑素細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能破壞，如白癜風(fēng)［4］，或繼發(fā)于其他皮膚病，如銀屑病、接觸性皮炎、特應(yīng)性皮炎等［5-6］。大部分VLS患者可出現(xiàn)色素減退［7］，但機(jī)制尚不完全明確，可能是多種原因共同作用的結(jié)果，包括：①黑素細(xì)胞數(shù)目減少；②黑素顆粒產(chǎn)生減少；③黑素顆粒向角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)障礙等［8］。DCT 是黑素合成過程中的一種特異性酶，我們選用DCT 標(biāo)記黑素細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組外陰皮膚表皮黑素細(xì)胞密度平均值為0.275，VLS 初期組為0.170，后期組為0.110。無論初期還是后期VLS 表皮黑素細(xì)胞密度均較對(duì)照組明顯減少，說明黑素細(xì)胞數(shù)目減少是VLS 出現(xiàn)色素減退的機(jī)制之一。另外，本研究顯示，后期VLS表皮黑素細(xì)胞密度較初期減少，提示隨著病情進(jìn)展，黑素細(xì)胞在逐漸減少。這一現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是VLS 患者皮膚免疫反應(yīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的多種炎癥因子抑制黑素細(xì)胞生成或造成黑素細(xì)胞損傷、凋亡等所致［8］。而對(duì)于VLS皮損中是否存在黑素顆粒產(chǎn)生減少或黑素顆粒向角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)障礙等其他機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

圖2 不同時(shí)期女陰硬化性苔蘚（VLS）皮損表皮黑素細(xì)胞熒光染色圖 2A：初期VLS；2B：后期VLS；2C：正常對(duì)照 圖3 不同時(shí)期女陰期硬化性苔蘚（VLS）皮損表皮角質(zhì)形成細(xì)胞熒光染色圖 3A：初期VLS；3B：后期VLS；3C：正常對(duì)照

表1 不同時(shí)期女陰硬化性苔蘚（VLS）表皮黑素細(xì)胞密度、表皮厚度（±s）

表1 不同時(shí)期女陰硬化性苔蘚（VLS）表皮黑素細(xì)胞密度、表皮厚度（±s）

組別初期VLS組后期VLS組對(duì)照組F值P值例數(shù)78 15表皮黑素細(xì)胞密度0.170±0.071 0.110±0.035 0.275±0.036 36.426＜0.001表皮全層厚度（μm）203.682±137.997 150.020±70.914 194.030±82.996 0.738 0.487表皮細(xì)胞層厚度（μm）154.603±121.984 83.455±37.129 176.974±80.296 7.330 0.007

既往很多研究表明，VLS患者常出現(xiàn)表皮萎縮，但多通過HE 染色證實(shí)，僅一項(xiàng)研究測(cè)量了VLS 皮損表皮厚度［9］。我們將VLS 病例分為初期和后期兩組，測(cè)量表皮全層厚度與細(xì)胞層厚度，分析表皮細(xì)胞增殖與角質(zhì)層厚度的變化。本研究中所用的ZEN blue和Imaris成像分析軟件可直接精確測(cè)量皮膚組織切片的直接免疫熒光圖像，滿足實(shí)驗(yàn)對(duì)精確度的要求。由于表皮厚度與年齡關(guān)系尚不明確，外陰皮膚厚度可能受年齡的影響［10-11］，故我們比較3組受試者年齡，發(fā)現(xiàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示3組具有可比性。研究結(jié)果表明，VLS初期和后期皮損表皮全層厚度與正常皮膚均無明顯差異，但隨著病情進(jìn)展，VLS表皮細(xì)胞層厚度逐漸減少，提示角質(zhì)層厚度在逐漸增加。既往有研究顯示，VLS表皮的棘細(xì)胞層與真皮乳頭層厚度較健康人明顯變?。?］，本研究中LS 皮損表皮細(xì)胞層厚度減少與上述文獻(xiàn)一致。我們推測(cè)VLS表皮細(xì)胞層減少可能是由于發(fā)病過程中免疫細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)對(duì)基底層細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用，使基底細(xì)胞出現(xiàn)液化變性，從而影響角質(zhì)形成細(xì)胞的正常增殖；而角質(zhì)層的增厚則可能與搔抓、摩擦等外界因素有關(guān)。

本研究表明，初期和后期VLS 表皮黑素細(xì)胞密度均較對(duì)照組減少，初期VLS 皮損表皮全層厚度和細(xì)胞層厚度均與對(duì)照組無明顯差異，而后期病例表皮細(xì)胞層厚度明顯減少。但是，外陰結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不同部位黑素細(xì)胞數(shù)量及皮膚厚度存在差異，本研究納入樣本量較少，未能區(qū)分具體的取材部位，所得結(jié)果有一定的局限性，將來還有待開展更多大樣本量的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突