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      桃紅四物湯促進(jìn)自噬抑制氧糖剝奪誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的實驗研究

      2020-07-21 06:43:26
      關(guān)鍵詞:氯喹含藥桃紅

      鄭 祥 王 審

      心肌缺血損傷是冠心病主要病理表現(xiàn),臨床上常用硝酸酯類、β 受體阻滯劑及他汀類藥物治療冠心病,但長期使用會導(dǎo)致嚴(yán)重副作用[1]。桃紅四物湯(TST)廣泛應(yīng)用于高血壓、心絞痛等心血管疾病治療[2]。臨床研究表明,桃紅四物湯可減輕冠心病臨床癥狀,提高患者生活質(zhì)量[3]。減小腦缺血損傷梗死面積,發(fā)揮保護作用[4]。心肌缺血性損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡,抑制凋亡顯著改善心血管疾病癥狀[5]。自噬通過降解受損蛋白質(zhì)或冗余細(xì)胞器維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài),介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程,與心血管疾病病理過程有關(guān)[6-7]。缺血條件下激活心肌細(xì)胞自噬,可減輕缺血損傷[3]。研究發(fā)現(xiàn),桃紅四物湯成分當(dāng)歸可激活自噬[8]。本研究探討桃紅四物湯對心肌缺血的保護作用及其機制,報道如下。

      1 實驗材料

      1.1 細(xì) 胞 H9C2 心肌細(xì)胞(ATCC,#FS-0056),購自上海研生生化試劑有限公司。

      1.2 動 物 實驗清潔級健康雄性SD 大鼠12 只,體質(zhì)量(220±20)g,浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供,實驗動物許可證號∶SYXK(浙)2018-0012,動物倫理審批號2018111,動物飼養(yǎng)及實驗操作嚴(yán)格遵守實驗動物的使用和管理原則。

      1.3 試 劑 抗體∶微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ/3Ⅰ(LC3-Ⅱ/Ⅰ,批號12741)、核孔糖蛋白62(p62,批號16177)、B-細(xì)胞淋巴瘤因子2 相關(guān)X 蛋白(Bax,批號2772)、B-細(xì)胞淋巴瘤因子2(Bcl-2,批號15071)和甘油醛酸3-磷酸脫氫酶(GAPDH,批號5174)抗體,購自美國Cell Signaling Technology 公司;試劑∶四唑鹽(MTT)試劑盒(InvitrogenTM,批號V13154),Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒(InvitrogenTM,批號V13242),PVDF 膜(InvitrogenTM,批號IB401002),購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。

      2 實驗方法

      2.1 TST 制備 TST∶桃仁、紅花、熟地黃、當(dāng)歸、川芎、白芍(購自北京同仁堂浙江中藥材有限公司)各15g,加水450mL(按每克生藥加水5mL),浸泡2h,煮沸后文火慢煎40min,趁熱過濾濾液,自然滴盡,二煎加水270mL,按每克生藥加水3mL,煮沸后,文火慢煎40min,趁熱過濾濾液,自然滴盡,合并濾液,95℃水浴濃縮至90mL,濃度為1mg/mL。

      2.2 TST 含藥血清制備 12 只SD 大鼠按照隨機數(shù)字表法分為空白血清制備組和TST 含藥血清制備組,每組6 只。含藥血清制備組大鼠每日按體質(zhì)量給予TST 水煎液10mL/kg 灌胃,含生藥劑量為10g·kg-1·d-1,早晚各灌胃1 次,連續(xù)5 天,末次給藥前12h 禁食,不禁水,末次給藥60min 后,水合氯醛腹腔麻醉,從心臟無菌采血。采集的大鼠全血于4℃靜置30min后,低溫離心機1500rpm/min 離心5min,分離的血清用0.45μm 的微孔濾膜過濾除菌,經(jīng)56℃恒溫水浴、30min 滅活處理后,置于-20℃冰箱備用??瞻籽逯苽浣M大鼠每只灌胃蒸餾水2mL,其余方法同上。

      2.3 心肌細(xì)胞氧糖剝奪(OGD)模型制備及分組處理OGD 模型模擬心肌梗死的體內(nèi)條件,制備方法參照文獻(xiàn)[9],大致過程∶細(xì)胞融合達(dá)到80%~90%后將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)化為無血清、無糖的DMEM,在95%N2、5% CO2飽和的缺氧室中37℃孵育4h。對照組細(xì)胞用含10% FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)。將OGD 處理后的細(xì)胞采用隨機數(shù)字表法分為∶對照組、OGD 模型組、OGD+TST 含藥血清組、OGD+TST 含藥血清+雷帕霉素組、OGD+TST 含藥血清+氯喹組。OGD+TST含藥血清組∶用TST 含藥血清處理24h;TST 含藥血清+雷帕霉素組∶用TST 含藥血清和25nM 雷帕霉素處理24h;TST 含藥血清+氯喹組∶用TST 含藥血清和10μM 氯喹處理24h。

      2.4 MTT 法檢測心肌細(xì)胞活力 H9C2 心肌細(xì)胞按4×104密度接種于12 孔板中,分組處理后,每孔加入100μL MTT 原液(5mg/mL),37℃孵育30min。然后每孔加入300μL 二甲基亞砜,平板輕輕搖動10min,在550nm 分光光度計微平板閱讀器上讀取OD 值。用光密度作為細(xì)胞存活率的指標(biāo),以對照培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的光密度歸一化,統(tǒng)計各組細(xì)胞存活情況。

      2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 采用Annexin VFITC/PI 凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡率。105個細(xì)胞懸浮于緩沖液中,進(jìn)行Annexin V-FITC 和PI 染色,黑暗中室溫下孵育1h。使用FACS 流式細(xì)胞術(shù)和Cell-Quest 軟件分析凋亡細(xì)胞數(shù)。

      2.6 Western blot 檢測細(xì)胞蛋白表達(dá) 操作方法大致如下∶20μg/mL 的蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE 處理后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。將膜在4℃分別與Bcl-2(1:1000)、Bax (1:1000)、LC3-Ⅰ/Ⅱ(1:1000)、p62(1:5000)或GAPDH(1:5000)抗體孵育過夜,然后用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠IgG 抗體(1:5000)室溫下孵育2h,使用化學(xué)發(fā)光試劑顯色檢測蛋白表達(dá),ImageJ 軟件統(tǒng)計分析蛋白灰度。

      2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差() 表示,組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及t 檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      3 結(jié)果

      3.1 TST 含藥血清提高OGD 心肌細(xì)胞活力 不同濃度TST 含藥血清處理OGD 心肌細(xì)胞24h,MTT 檢測結(jié)果顯示,隨著TST 含藥血清濃度的增加,細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05),見表1。

      表1 各組心肌細(xì)胞活力比較(%,)

      表1 各組心肌細(xì)胞活力比較(%,)

      注∶OGD 為氧糖剝奪;TST 為桃紅四物湯;與對照組比較,aP<0.05;與OGD 模型組比較,bP<0.05;與OGD+5%TST 含藥血清組比較,cP<0.05;與OGD+10%TST 含藥血清組比較,dP<0.05

      3.2 TST 含藥血清聯(lián)合自噬提高OGD 心肌細(xì)胞活力 雷帕霉素誘導(dǎo)OGD 心肌細(xì)胞自噬,聯(lián)合TST 含藥血清處理OGD 心肌細(xì)胞,細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05),氯喹抑制OGD 心肌細(xì)胞自噬,聯(lián)合TST 含藥血清處理OGD 心肌細(xì)胞,細(xì)胞活力下降(P<0.05)。見表2。

      3.3 TST 含藥血清聯(lián)合自噬抑制OGD 心肌細(xì)胞凋亡 與對照組比較,OGD 模型組心肌細(xì)胞凋亡比例顯著升高(P<0.05);TST 含藥血清處理OGD 心肌細(xì)胞,細(xì)胞凋亡比例降低(P<0.05),雷帕霉素誘導(dǎo)OGD心肌細(xì)胞自噬,細(xì)胞凋亡比例進(jìn)一步降低(P<0.05),氯喹改變?nèi)苊阁wpH,溶酶體功能受損,細(xì)胞自噬被抑制,細(xì)胞凋亡比例升高(P<0.05)。見表3、插頁圖1。

      表2 各組心肌細(xì)胞活力比較(%,)

      表2 各組心肌細(xì)胞活力比較(%,)

      注∶OGD 為氧糖剝奪;TST 為桃紅四物湯;與對照組比較,aP<0.05;與OGD 模型組比較,bP<0.05;與OGD+TST 含藥血清組比較,cP<0.05

      表3 各組心肌細(xì)胞凋亡比例比較(%,)

      表3 各組心肌細(xì)胞凋亡比例比較(%,)

      注∶OGD 為氧糖剝奪;TST 為桃紅四物湯;與對照組比較,aP<0.05;與OGD 模型組比較,bP<0.05;與OGD+TST 含藥血清組比較,cP<0.05

      3.4 TST 含藥血清促進(jìn)OGD 心肌細(xì)胞自噬抑制凋亡蛋白表達(dá) 與對照組比較,OGD 模型組p62 和Bax 蛋白表達(dá)增多、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Bcl-2 蛋白表達(dá)減少;與OGD 模型組比較,TST 含藥血清處理OGD 心肌細(xì)胞,Bcl-2 和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值明顯增多,Bax 和p62 表達(dá)明顯減少;與OGD+TST 含藥血清組比較,OGD+TST 含藥血清+雷帕霉素組Bcl-2和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增多,Bax 和p62 表達(dá)顯著減少;OGD+TST 含藥血清+氯喹組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Bcl-2 表達(dá)減少,p62、Bax 蛋白表達(dá)增多。見插頁圖2。

      3 討論

      心肌細(xì)胞凋亡是冠心病等心血管疾病的重要病理表現(xiàn),抑制心肌細(xì)胞凋亡可有效改善心血管疾病心功能[10]。本研究通過體外OGD 處理心肌細(xì)胞構(gòu)建心血管疾病體外模型,通過不同濃度TST 含藥血清處理OGD 心肌細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力升高,細(xì)胞凋亡比例下降,表明TST 對心肌缺血損傷具有保護作用,但具體機制尚不明確。

      自噬在心肌缺血損傷中發(fā)揮復(fù)雜作用,自噬抑制加重缺血損傷,腺苷和白藜蘆醇等心臟保護劑抑制自噬減輕心肌損傷[11-12]。目前普遍認(rèn)為適度的自噬通過降解和清除受損的細(xì)胞器提高細(xì)胞存活率,抑制細(xì)胞凋亡[7,13]。本研究發(fā)現(xiàn),TST 促進(jìn)細(xì)胞自噬,抑制OGD 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡,氯喹抑制自噬導(dǎo)致TST 的心肌保護作用喪失,細(xì)胞存活率降低,細(xì)胞凋亡增多。上述結(jié)果表明TST 通過增強自噬抑制細(xì)胞凋亡,在心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護作用。

      綜上所述,桃紅四物湯促進(jìn)細(xì)胞自噬,抑制OGD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡,發(fā)揮保護作用。

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