桃紅四物湯促進(jìn)自噬抑制氧糖剝奪誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的實驗研究

鄭 祥 王 審

心肌缺血損傷是冠心病主要病理表現(xiàn)，臨床上常用硝酸酯類、β 受體阻滯劑及他汀類藥物治療冠心病，但長期使用會導(dǎo)致嚴(yán)重副作用[1]。桃紅四物湯（TST）廣泛應(yīng)用于高血壓、心絞痛等心血管疾病治療[2]。臨床研究表明，桃紅四物湯可減輕冠心病臨床癥狀，提高患者生活質(zhì)量[3]。減小腦缺血損傷梗死面積，發(fā)揮保護作用[4]。心肌缺血性損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，抑制凋亡顯著改善心血管疾病癥狀[5]。自噬通過降解受損蛋白質(zhì)或冗余細(xì)胞器維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程，與心血管疾病病理過程有關(guān)[6-7]。缺血條件下激活心肌細(xì)胞自噬，可減輕缺血損傷[3]。研究發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯成分當(dāng)歸可激活自噬[8]。本研究探討桃紅四物湯對心肌缺血的保護作用及其機制，報道如下。

1 實驗材料

1.1 細(xì) 胞 H9C2 心肌細(xì)胞（ATCC，#FS-0056），購自上海研生生化試劑有限公司。

1.2 動 物 實驗清潔級健康雄性SD 大鼠12 只，體質(zhì)量（220±20）g，浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物許可證號∶SYXK（浙）2018-0012，動物倫理審批號2018111，動物飼養(yǎng)及實驗操作嚴(yán)格遵守實驗動物的使用和管理原則。

1.3 試 劑 抗體∶微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ/3Ⅰ（LC3-Ⅱ/Ⅰ，批號12741）、核孔糖蛋白62（p62，批號16177）、B-細(xì)胞淋巴瘤因子2 相關(guān)X 蛋白（Bax，批號2772）、B-細(xì)胞淋巴瘤因子2（Bcl-2，批號15071）和甘油醛酸3-磷酸脫氫酶（GAPDH，批號5174）抗體，購自美國Cell Signaling Technology 公司；試劑∶四唑鹽（MTT）試劑盒（InvitrogenTM，批號V13154），Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒（InvitrogenTM，批號V13242），PVDF 膜（InvitrogenTM，批號IB401002），購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。

2 實驗方法

2.1 TST 制備 TST∶桃仁、紅花、熟地黃、當(dāng)歸、川芎、白芍（購自北京同仁堂浙江中藥材有限公司）各15g，加水450mL（按每克生藥加水5mL），浸泡2h，煮沸后文火慢煎40min，趁熱過濾濾液，自然滴盡，二煎加水270mL，按每克生藥加水3mL，煮沸后，文火慢煎40min，趁熱過濾濾液，自然滴盡，合并濾液，95℃水浴濃縮至90mL，濃度為1mg/mL。

2.2 TST 含藥血清制備 12 只SD 大鼠按照隨機數(shù)字表法分為空白血清制備組和TST 含藥血清制備組，每組6 只。含藥血清制備組大鼠每日按體質(zhì)量給予TST 水煎液10mL/kg 灌胃，含生藥劑量為10g·kg-1·d-1，早晚各灌胃1 次，連續(xù)5 天，末次給藥前12h 禁食，不禁水，末次給藥60min 后，水合氯醛腹腔麻醉，從心臟無菌采血。采集的大鼠全血于4℃靜置30min后，低溫離心機1500rpm/min 離心5min，分離的血清用0.45μm 的微孔濾膜過濾除菌，經(jīng)56℃恒溫水浴、30min 滅活處理后，置于-20℃冰箱備用?？瞻籽逯苽浣M大鼠每只灌胃蒸餾水2mL，其余方法同上。

2.3 心肌細(xì)胞氧糖剝奪（OGD）模型制備及分組處理OGD 模型模擬心肌梗死的體內(nèi)條件，制備方法參照文獻(xiàn)[9]，大致過程∶細(xì)胞融合達(dá)到80%～90%后將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)化為無血清、無糖的DMEM，在95%N2、5% CO2飽和的缺氧室中37℃孵育4h。對照組細(xì)胞用含10% FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)。將OGD 處理后的細(xì)胞采用隨機數(shù)字表法分為∶對照組、OGD 模型組、OGD+TST 含藥血清組、OGD+TST 含藥血清+雷帕霉素組、OGD+TST 含藥血清+氯喹組。OGD+TST含藥血清組∶用TST 含藥血清處理24h；TST 含藥血清+雷帕霉素組∶用TST 含藥血清和25nM 雷帕霉素處理24h；TST 含藥血清+氯喹組∶用TST 含藥血清和10μM 氯喹處理24h。

2.4 MTT 法檢測心肌細(xì)胞活力 H9C2 心肌細(xì)胞按4×104密度接種于12 孔板中，分組處理后，每孔加入100μL MTT 原液（5mg/mL），37℃孵育30min。然后每孔加入300μL 二甲基亞砜，平板輕輕搖動10min，在550nm 分光光度計微平板閱讀器上讀取OD 值。用光密度作為細(xì)胞存活率的指標(biāo)，以對照培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的光密度歸一化，統(tǒng)計各組細(xì)胞存活情況。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 采用Annexin VFITC/PI 凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡率。105個細(xì)胞懸浮于緩沖液中，進(jìn)行Annexin V-FITC 和PI 染色，黑暗中室溫下孵育1h。使用FACS 流式細(xì)胞術(shù)和Cell-Quest 軟件分析凋亡細(xì)胞數(shù)。

2.6 Western blot 檢測細(xì)胞蛋白表達(dá) 操作方法大致如下∶20μg/mL 的蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE 處理后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。將膜在4℃分別與Bcl-2（1:1000）、Bax （1:1000）、LC3-Ⅰ/Ⅱ（1:1000）、p62（1:5000）或GAPDH（1:5000）抗體孵育過夜，然后用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠IgG 抗體（1:5000）室溫下孵育2h，使用化學(xué)發(fā)光試劑顯色檢測蛋白表達(dá)，ImageJ 軟件統(tǒng)計分析蛋白灰度。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）及t 檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 TST 含藥血清提高OGD 心肌細(xì)胞活力 不同濃度TST 含藥血清處理OGD 心肌細(xì)胞24h，MTT 檢測結(jié)果顯示，隨著TST 含藥血清濃度的增加，細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05），見表1。

表1 各組心肌細(xì)胞活力比較（%，）

表1 各組心肌細(xì)胞活力比較（%，）

注∶OGD 為氧糖剝奪；TST 為桃紅四物湯；與對照組比較，aP＜0.05；與OGD 模型組比較，bP＜0.05；與OGD+5%TST 含藥血清組比較，cP＜0.05；與OGD+10%TST 含藥血清組比較，dP＜0.05

3.2 TST 含藥血清聯(lián)合自噬提高OGD 心肌細(xì)胞活力 雷帕霉素誘導(dǎo)OGD 心肌細(xì)胞自噬，聯(lián)合TST 含藥血清處理OGD 心肌細(xì)胞，細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05），氯喹抑制OGD 心肌細(xì)胞自噬，聯(lián)合TST 含藥血清處理OGD 心肌細(xì)胞，細(xì)胞活力下降（P＜0.05）。見表2。

3.3 TST 含藥血清聯(lián)合自噬抑制OGD 心肌細(xì)胞凋亡 與對照組比較，OGD 模型組心肌細(xì)胞凋亡比例顯著升高（P＜0.05）；TST 含藥血清處理OGD 心肌細(xì)胞，細(xì)胞凋亡比例降低（P＜0.05），雷帕霉素誘導(dǎo)OGD心肌細(xì)胞自噬，細(xì)胞凋亡比例進(jìn)一步降低（P＜0.05），氯喹改變?nèi)苊阁wpH，溶酶體功能受損，細(xì)胞自噬被抑制，細(xì)胞凋亡比例升高（P＜0.05）。見表3、插頁圖1。

表2 各組心肌細(xì)胞活力比較（%，）

表2 各組心肌細(xì)胞活力比較（%，）

注∶OGD 為氧糖剝奪；TST 為桃紅四物湯；與對照組比較，aP＜0.05；與OGD 模型組比較，bP＜0.05；與OGD+TST 含藥血清組比較，cP＜0.05

表3 各組心肌細(xì)胞凋亡比例比較（%，）

表3 各組心肌細(xì)胞凋亡比例比較（%，）

注∶OGD 為氧糖剝奪；TST 為桃紅四物湯；與對照組比較，aP＜0.05；與OGD 模型組比較，bP＜0.05；與OGD+TST 含藥血清組比較，cP＜0.05

3.4 TST 含藥血清促進(jìn)OGD 心肌細(xì)胞自噬抑制凋亡蛋白表達(dá) 與對照組比較，OGD 模型組p62 和Bax 蛋白表達(dá)增多、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Bcl-2 蛋白表達(dá)減少；與OGD 模型組比較，TST 含藥血清處理OGD 心肌細(xì)胞，Bcl-2 和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值明顯增多，Bax 和p62 表達(dá)明顯減少；與OGD+TST 含藥血清組比較，OGD+TST 含藥血清+雷帕霉素組Bcl-2和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增多，Bax 和p62 表達(dá)顯著減少；OGD+TST 含藥血清+氯喹組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Bcl-2 表達(dá)減少，p62、Bax 蛋白表達(dá)增多。見插頁圖2。

3 討論

心肌細(xì)胞凋亡是冠心病等心血管疾病的重要病理表現(xiàn)，抑制心肌細(xì)胞凋亡可有效改善心血管疾病心功能[10]。本研究通過體外OGD 處理心肌細(xì)胞構(gòu)建心血管疾病體外模型，通過不同濃度TST 含藥血清處理OGD 心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力升高，細(xì)胞凋亡比例下降，表明TST 對心肌缺血損傷具有保護作用，但具體機制尚不明確。

自噬在心肌缺血損傷中發(fā)揮復(fù)雜作用，自噬抑制加重缺血損傷，腺苷和白藜蘆醇等心臟保護劑抑制自噬減輕心肌損傷[11-12]。目前普遍認(rèn)為適度的自噬通過降解和清除受損的細(xì)胞器提高細(xì)胞存活率，抑制細(xì)胞凋亡[7，13]。本研究發(fā)現(xiàn)，TST 促進(jìn)細(xì)胞自噬，抑制OGD 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，氯喹抑制自噬導(dǎo)致TST 的心肌保護作用喪失，細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞凋亡增多。上述結(jié)果表明TST 通過增強自噬抑制細(xì)胞凋亡，在心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護作用。

綜上所述，桃紅四物湯促進(jìn)細(xì)胞自噬，抑制OGD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護作用。