5種復(fù)合植物精油體外抑菌效果的比較

余 淼，彭玉箏，黃明亞，呂繼蓉*，曾凡坤，王相科，宋曼玲

（1.成都大帝漢克生物科技有限公司，成都 611130；2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010）

抗生素為人類和畜牧業(yè)對(duì)抗細(xì)菌提供了一把利器，長(zhǎng)期使用除了耐藥問題、環(huán)境污染問題，還會(huì)打破腸道內(nèi)微生物的內(nèi)共生關(guān)系。因此，尋求并恰當(dāng)?shù)氖褂镁G色、高效、安全、環(huán)保的添加劑產(chǎn)品是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。植物精油是植物次生代謝產(chǎn)物，主要由醇、醛、酯、酮、酚、烯等不同化學(xué)元素組成，而每種化學(xué)元素都有其特定的功效，使植物精油散發(fā)出不同的香味，并使每種植物精油具有不同的功效，主要為單萜類、倍半萜烯以及其氧化衍生物等萜烯類化合物組成的混合物[1]。植物精油中的多種物質(zhì)已被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）認(rèn)定為GRAS 物質(zhì)，并應(yīng)用于食品添加[2]。近些年的報(bào)道表明，植物精油具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡、提高動(dòng)物機(jī)體抗氧化功能以及免疫能力[4-8]。在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)方面，植物精油可能通過提高消化吸收能力達(dá)到促生長(zhǎng)目的。機(jī)體的生長(zhǎng)與消化吸收能力緊密相關(guān)，而動(dòng)物體內(nèi)的消化酶活性能夠反映消化能力。而腸道菌群平衡有助于提高動(dòng)物的消化吸收能力[11]。Li 等和Jamyoz等分別在仔豬、雞飼糧中添加適宜水平的百里香酚、肉桂醛，提高了腸道乳酸桿菌的數(shù)量，降低了大腸桿菌數(shù)量[9,12]。Kirkpinar等發(fā)現(xiàn)，牛至能降低肉雞腸道中梭狀芽孢桿菌及鏈球菌數(shù)量[13]。結(jié)果表明，植物精油能通過促進(jìn)腸道有益菌生成，改善腸道微生態(tài)平衡，保證腸道的消化吸收能力。

Li等研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加植物精油可提高提高仔豬血清中IgA、IgG、C3、C4 含量[9]。Du 等和Gao 等研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加香芹酚等植物精油可以緩解肉雞、小鼠的腸道炎癥，并降低了斷奶仔豬腹瀉指數(shù)[14-15]。以上結(jié)果表明，植物精油能夠提高動(dòng)物機(jī)體免疫力，促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體健康。

目前市場(chǎng)精油產(chǎn)品較多，參差不齊。而Friedman 等早在2002 年通過96 種不同植物源的精油提取物，以及主要成分的抑菌活性對(duì)比，研究發(fā)現(xiàn)肉桂醛、香芹酚、百里香酚、丁香酚4種物質(zhì)具有較強(qiáng)的抑菌活性，且在植物中提取時(shí)含量較高[16]。隨著對(duì)精油不斷深入研究，現(xiàn)階段關(guān)于精油的功能、機(jī)理研究很多，但仍有諸多問題亟待解決，如精油的適口性、易揮發(fā)、易氧化問題，精油的劑量與效應(yīng)，精油與其他替抗產(chǎn)品的搭配，精油的評(píng)價(jià)體系等。

本試驗(yàn)以市售的5 種不同植物精油產(chǎn)品為對(duì)象，分別從主要精油活性物質(zhì)的含量、熱穩(wěn)定性以及體外抑菌效果3個(gè)方面進(jìn)行評(píng)估，比較不同產(chǎn)品的抑菌作用，以期為精油產(chǎn)品的應(yīng)用及開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)原料

飼料按照玉米55%+豆粕27%+麥麩15%+棉粕3%配制。

1.1.2 試驗(yàn)產(chǎn)品

不同廠家精油產(chǎn)品（EO1、EO2、EO3、EO4、EO5）和抗生素（硫酸粘桿菌素）。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

胃蛋白酶、胰蛋白酶；PBS 緩沖液；4 mol·L-1鹽酸；1 mol·L-1鹽酸；1 mol·L-1氫氧化鈉。

1.1.4 供試菌株

大腸桿菌K88（ATCC2881）、金色葡萄球菌（ATCC6538）和沙門氏桿菌（DY72）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 氣相分析

色譜柱升溫程序：三階程序升溫，初溫30 ℃保持10 min 后以10 ℃·min-1的速度升溫到200 ℃，保持10 min 后以5 ℃·min-1的速度升溫到230 ℃，保持10 min。將所有樣品上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.2 熱穩(wěn)定性分析

各精油產(chǎn)品等量分成兩組，對(duì)照組和熱處理組。熱處理組模仿熱飼料制粒條件：溫度85 ℃，時(shí)間40 s。熱處理后氣相分析精油活性成分變化。

1.2.3 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)分成7個(gè)組，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼料中添加精油樣品0.04%、硫酸粘桿菌素0.03%。每組稱取10 g飼料原料緩慢加入磷酸緩沖液（PBS）20 mL，添加0.2 mol·L-1鹽酸10 mL攪拌，胃蛋白酶溶液10 mL處理，調(diào)整pH至1.2（用1 mol·L-1鹽酸或1 mol·L-1氫氧化鈉），在37 ℃、轉(zhuǎn)速85 r·min-1恒溫?fù)u床下消化3.5 h。用1 mol·L-1的 氫 氧 化 鈉 溶 液 調(diào)pH 到6.5～7.0，加PBS 緩沖液20 mL。加入3 mg·mL-1胰蛋白酶溶液（超純水配置）10 mL，調(diào)整pH 到6.5～7.0，轉(zhuǎn)速85 r·min-1恒溫?fù)u床下消化3.5 h。取懸濁液9 mL，然后接種大腸桿菌、金色葡萄球菌和沙門氏菌1 mL，培養(yǎng)24 h，進(jìn)行OD 值檢測(cè)和平板涂布10-4倍。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種精油GC-MS定性分析

通過GC-MS定性分析分析發(fā)現(xiàn)，5種精油的成分以百里香酚、丁香酚、肉桂醛等為主，并且通過波峰發(fā)現(xiàn)EO1 和EO4 含有天然精油成分，見圖1a～圖1e。

2.2 5種精油GC定量分析

圖1 5種樣品GC-MS分析

各精油樣品有效成分分析見表1。

2.3 5種精油熱穩(wěn)定性分析

通過熱處理發(fā)現(xiàn)，不同精油在85 ℃、40 s條件下處理后，損失率范圍為3%～12%，見圖2。所以目前市場(chǎng)精油除考慮其成分、含量、配比外，還應(yīng)通過一些工藝手段保證其穩(wěn)定性，將精油的揮發(fā)性損失降低到最低。

2.4 5種精油體外抑菌效果比較

表1 各精油樣品有效成分分析

圖2 不同精油熱處理后損失率

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，抗生素和EO1 對(duì)大腸桿菌（圖3）、金黃色葡萄球菌（圖4）、沙門氏菌（圖5）均有明顯抑制效果（見表2）。

3 小 結(jié)

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同精油組分對(duì)不同病原菌抑菌效果不同，精油抑菌效果與總活性成分呈正相關(guān)。目前市面精油很多，良莠不齊，且精油成分很多，要熟知精油種類。在成分選擇上，盡可能拓寬抑菌圖譜，且要達(dá)到最低抑菌濃度。對(duì)于精油的選擇，建議綜合考慮產(chǎn)品的穩(wěn)定性、適口性、抑菌效果，還有能真正達(dá)到抑菌效果的添加量。

圖3 不同精油對(duì)大腸桿菌的抑菌效果

圖4 不同精油對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果

圖5 不同植物精油對(duì)沙門氏菌的抑菌效果

表2 不同產(chǎn)品綜合抑菌效果評(píng)估