吳 杰，李京濤，魏海梁，閆曙光，范 妤，郭英君，常占杰

1 陜西中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 肝病科，陜西 咸陽 712046；3 寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院 肝病科，銀川 750001

肝細(xì)胞癌(HCC)是全世界第二大常見的癌癥死亡原因，占所有原發(fā)性肝惡性腫瘤的90%[1]。過去15年HCC的發(fā)病率呈逐年遞增趨勢(shì)，盡管治療方案不斷改進(jìn)，但患者預(yù)后仍然很差，其主要原因是由于多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已至晚期，失去最佳治療時(shí)機(jī)[2]。臨床上，依靠影像學(xué)、病理學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)，可以及早的發(fā)現(xiàn)肝癌癌前病變的存在[2]。研究[3]證實(shí)，在HCC的進(jìn)展中，會(huì)經(jīng)歷一個(gè)較長的肝癌癌前病變過程。HCC癌前病變表現(xiàn)為：肝細(xì)胞異型增生、異型增生灶、低度異型增生結(jié)節(jié)、高度異型增生結(jié)節(jié)、肝細(xì)胞腺瘤。如果能夠?qū)⒏伟┑闹委熽嚲€前移，在HCC癌前病變階段就及早干預(yù)，就有可能阻止或延緩癌前病變惡性轉(zhuǎn)變?yōu)镠CC。

HCC癌前病變惡性轉(zhuǎn)變的機(jī)制尚不明確。目前較公認(rèn)的機(jī)制包括肝癌癌前病變細(xì)胞的產(chǎn)生(種子破壞)、炎癥纖維化微環(huán)境的形成(環(huán)境污染)，以及兩者的相互作用[4]。而在上述機(jī)制中，肝星狀細(xì)胞(HSC)的活化和異常分泌始終處于核心地位，在HCC癌前病變細(xì)胞啟動(dòng)、產(chǎn)生以及發(fā)展各階段中，作為異常微環(huán)境的特殊組成部分，HSC亦起著關(guān)鍵的作用。本文就microRNA(miRNA)靶向調(diào)控HSC活化，干預(yù)肝癌癌前病變惡性轉(zhuǎn)變的機(jī)制研究新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 HSC活化與肝癌癌前病變的關(guān)系

1.1 HSC活化 當(dāng)肝臟受致病因子(病毒、酒精或內(nèi)毒素等危險(xiǎn)因子)損傷時(shí)，HSC的鄰近細(xì)胞(肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞等)分泌多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子作用于HSC，通過誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄使HSC基因表達(dá)發(fā)生改變，HSC會(huì)丟失細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)小滴，轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維性肌成纖維細(xì)胞表型，并表達(dá)大量的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(ECM)，使其具有自身增殖能力、分泌與調(diào)節(jié)功能，即活化的HSC[5-6]?；罨腍SC通過基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)一步累積，同時(shí)產(chǎn)生大量相關(guān)的趨化因子與細(xì)胞因子。ECM的過度沉積與細(xì)胞因子的大量分泌又進(jìn)一步刺激活化HSC，如此形成一個(gè)正反饋而維持HSC的活性[7]。

1.2 活化的HSC貫穿HCC癌前病變?nèi)^程 正常肝細(xì)胞的增殖和分化都由細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信號(hào)調(diào)控，活化的HSC異常分泌從而干擾正常基因表達(dá)、細(xì)胞間信號(hào)通路傳導(dǎo)，使機(jī)體細(xì)胞組織發(fā)生癌變。研究[8]表明，在含有HSC的條件培養(yǎng)基中能顯著地誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞在單層培養(yǎng)皿中的增殖和遷移，在三維球體共培養(yǎng)系統(tǒng)中，HSC促進(jìn)肝癌的生長，減少中心壞死程度，在裸鼠體內(nèi)同時(shí)植入HSC和HCC細(xì)胞可促進(jìn)肝癌的生長和侵襲，抑制腫瘤壞死。HCC癌前病變細(xì)胞的啟動(dòng)階段,在致病因子持續(xù)作用下使肝細(xì)胞破壞并向異型增生結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)化[9]。異型增生結(jié)節(jié)是指在慢性肝炎或肝硬化背景下形成的具有不典型特征的增生結(jié)節(jié)或團(tuán)塊，存在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的異常[10]。與HCC不同，異型增生結(jié)節(jié)是一種新生的類腫瘤樣病變而非單純的增生性病變[11]。研究[12]表明，高分化異型增生結(jié)節(jié)患者的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性強(qiáng)，推測(cè)是因?yàn)槎肆５拈L度和結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致染色體穩(wěn)定性的改變，進(jìn)而出現(xiàn)基因突變，而呈現(xiàn)出較高的惡變風(fēng)險(xiǎn)。

在HCC發(fā)生發(fā)展中，基因組改變是一個(gè)逐步累積的過程，持續(xù)的基因突變或缺失以及變異基因積累促進(jìn)異型增生結(jié)節(jié)的發(fā)展[13]。從而加快了啟動(dòng)進(jìn)程[14]。研究[15]顯示，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子的突變頻率與p16基因甲基化在肝癌的發(fā)生發(fā)展中呈明顯遞增的趨勢(shì)。在HCC癌前病變細(xì)胞的啟動(dòng)階段中，活化的HSC通過旁分泌產(chǎn)生大量TGFβ，激活TGFβ1-PI3K/AKT信號(hào)通路，通過抑制下游抑癌二聚體TSC1/TSC2 活性，調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄，改變肝細(xì)胞基因表型，同時(shí)活化的HSC可直接分泌免疫調(diào)節(jié)因子(包括IL-1、IL-6、MCP-1、CCL21等)促進(jìn)炎癥因子的聚集，導(dǎo)致肝細(xì)胞非典型增生性修復(fù)[16]，從而進(jìn)一步促進(jìn)異型增生結(jié)節(jié)的形成，為肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變或肝干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為HCC癌前病變細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

在HCC癌前病變細(xì)胞的產(chǎn)生階段，致病因子持續(xù)作用與基因變異不斷蓄積，逐漸使大量肝細(xì)胞與HSC鄰近細(xì)胞受損，HSC鄰近細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子進(jìn)一步促使更多的HSC活化[17]，大量活化的HSC通過調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)的降解與合成，降低間質(zhì)膠原酶活性，減少ECM降解，使大量胞外基質(zhì)蛋白沉積，ECM被新生的膠原蛋白所取代，加劇炎癥因子的浸潤，同時(shí)，HSC分泌的促炎因子又進(jìn)一步加重對(duì)已損傷肝細(xì)胞區(qū)域的浸潤，受損區(qū)域在正反饋調(diào)節(jié)下促進(jìn)局部炎性細(xì)胞的趨化性、黏附性和活性，進(jìn)而促使炎癥微環(huán)境的形成[18]。在炎癥微環(huán)境下，一方面,低分化異型增生結(jié)節(jié)更易向高分化異型增生結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)化而加重惡變風(fēng)險(xiǎn)[19]，另一方面，處于有絲分裂期的肝細(xì)胞更易發(fā)生基因突變，從而干擾了DNA正常復(fù)制，導(dǎo)致DNA突變傳給子代細(xì)胞，肝細(xì)胞惡變基因的不斷蓄積，最終使肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化為HCC癌前病變細(xì)胞，從而進(jìn)展為早期肝癌[20-21]。

多數(shù)研究者[22]認(rèn)為在HCC癌前病變細(xì)胞的發(fā)展階段，腫瘤細(xì)胞具有分化程度差、增殖迅速、易擴(kuò)散的特點(diǎn),同時(shí)呈浸潤性生長?；罨腍SC通過調(diào)節(jié)免疫逃逸，分泌促肝細(xì)胞生長因子、促血管生長因子從而使腫瘤細(xì)胞直接或間接蔓延侵犯周圍正常肝組織。研究[23]發(fā)現(xiàn)活化的HSC通過分泌IL-6，誘導(dǎo)發(fā)育髓源性抑制細(xì)胞的產(chǎn)生，在腫瘤環(huán)境中髓源性抑制細(xì)胞的高表達(dá)使T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制性，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸能力，有利于HCC的轉(zhuǎn)移和發(fā)展?；罨腍SC可通過連接 B7-H1/Pd-1信號(hào)通路顯著增強(qiáng)HSC的免疫調(diào)節(jié)活性，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡增強(qiáng)，從而為肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件[24]。HSC也可以通過觸發(fā)HCC細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化分泌層粘連蛋白5[25]，而有研究[26]證實(shí)這種層粘連蛋白同工型是具有較強(qiáng)的黏附性及遷移性，更具攻擊性和侵害性的癌癥表型。活化的HSC作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，其分泌的TGFβ參與肝內(nèi)結(jié)構(gòu)的重建，通過細(xì)胞收縮使肝竇內(nèi)壓升高，為癌變形態(tài)學(xué)的改變奠定了基礎(chǔ)。活化的HSC還通過分泌血管內(nèi)皮生長因子A與基質(zhì)金屬蛋白酶9增加肝癌細(xì)胞血管形成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、瘤體的增長。除此之外，HSC可直接促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖與發(fā)展，增強(qiáng)癌細(xì)胞的成瘤能力。

因此，活化的HSC在HCC癌前病變惡性轉(zhuǎn)變的全過程中均起到重要作用，是肝癌癌前病變惡性轉(zhuǎn)變防治研究的重要靶點(diǎn)。

2 miRNA與肝癌癌前病變的關(guān)系

2.1 miRNA miRNA是指在轉(zhuǎn)錄后水平通過負(fù)調(diào)節(jié)基因維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的非編碼RNA，長度約為21 bp，其具有組織特異性小、保守性高、靶基因廣的特點(diǎn)。在轉(zhuǎn)錄水平下，miRNA通過其自身序列與靶基因之間的特定mRNA堿基配對(duì)而下調(diào)其靶基因的表達(dá)，引起miRNA靶基因的降解或?qū)е碌鞍踪|(zhì)翻譯的變化，從而參與細(xì)胞的代謝、增殖、分化以及調(diào)亡等生理過程，在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[27-28]。因miRNA與靶基因具有“一對(duì)多”“多對(duì)一”的特點(diǎn)，從而使miRNA與靶基因形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這種獨(dú)特之處使得miRNA能通過信號(hào)調(diào)節(jié)對(duì)多種細(xì)胞分化過程產(chǎn)生協(xié)同作用[29]?；诖?，在肝癌癌前病變的發(fā)生發(fā)展中，相關(guān)的miRNA能夠通過調(diào)控HSC活化而影響這一過程。

2.2 miRNA對(duì)HSC活化的調(diào)控作用

miRNA在HSC的活化以及癌變進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要的作用。miRNA主要通過調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響HSC狀態(tài)轉(zhuǎn)化，從而調(diào)控HSC增殖與凋亡。

2.2.1 促進(jìn)HSC活化的miRNA 在HSC活化的進(jìn)程中，許多miRNA對(duì)HSC的活化具有促進(jìn)作用。Ma等[30]用CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型，發(fā)現(xiàn)肝組織中miRNA-214 水平穩(wěn)定表達(dá),上調(diào)miRNA-214水平可顯著降低負(fù)調(diào)節(jié)因子融合同源基因(Sufu)的表達(dá)，從而促進(jìn)Hedgehog信號(hào)通路傳導(dǎo)，促使HSC增殖、纖維細(xì)胞外基質(zhì)的積累和原纖維基因的表達(dá)。TGFβ是肝臟疾病中主要的促纖維化細(xì)胞因子。TGFβ與TβRⅡ受體結(jié)合導(dǎo)致TβRI受體形成異源四聚體，然后通過Smad2/3的R-Smad磷酸化啟動(dòng)信號(hào)通路[31]，磷酸化以后與Smad4結(jié)合，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)多個(gè)目標(biāo)基因表達(dá)[32]，促進(jìn)HSC的活化。在此過程中，Smad7和R-Smad競(jìng)爭(zhēng)性與TβRI受體結(jié)合，負(fù)調(diào)節(jié)TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)，抑制HSC活化。有研究[33]發(fā)現(xiàn)，miRNA-17-5p可通過下調(diào)Smad7表達(dá)，減少其與R-Smad競(jìng)爭(zhēng)TβRⅠ受體的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)而增強(qiáng)HSC的活化。同時(shí)，miRNA-212-3p過表達(dá)也可靶向下調(diào)抑制性因子Smad7，進(jìn)而促進(jìn)TGFβ信號(hào)通路，誘導(dǎo)HSC的活化[34]，促進(jìn)肝纖維化細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡。研究[35]表明PI3K/AKT通路在促進(jìn)HSC活化、抑制HSC凋亡充當(dāng)著重要的角色。TGFβ通過TGFβⅠ型受體直接激活PI3K/AKT通路，miRNA-216a/217簇作為Smad7的抑制劑，通過促進(jìn)TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)而激活PI3K/AKT通路，從而促使纖維細(xì)胞外基質(zhì)的積累和癌前基因的表達(dá)[36]。研究[37]發(fā)現(xiàn)，GNMT是甲基轉(zhuǎn)移的主要調(diào)節(jié)劑，可抑制甲基化的異常啟動(dòng)子，從而阻止原發(fā)性腫瘤的發(fā)生，miRNA-873-5p作為GNMT的轉(zhuǎn)錄后抑制劑，介導(dǎo)整體表觀基因組學(xué)改變并促進(jìn)肝纖維化，同時(shí)抗miRNA-873-5p降低STAT3的激活，從而抑制HSC的活化，因此在阻斷HCC癌前病變進(jìn)程中具有重要作用(圖1)。

2.2.2 抑制HSC活化的miRNA HSC活化和肝臟炎癥反應(yīng)主要依賴于NF-κB/Bambi信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活，IL-1受體相關(guān)激酶(IL-1 receptor associated kinase，IRAK)和TNF受體相關(guān)因子6(TNF receptor-associated factor 6，TRAF6)是NF-κB/Bambi信號(hào)傳導(dǎo)通路的激動(dòng)劑。研究[38]發(fā)現(xiàn)miRNA-146a-5p過表達(dá)可特異性抑制HSC活化通路相關(guān)的受體激酶與受體因子的激活，從而抑制HSC活化和增殖，減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，降低肝纖維化的發(fā)生與細(xì)胞因子的異常分泌，進(jìn)而延緩癌前病變的進(jìn)展。

TGFβ通路也可參與抗纖維化調(diào)節(jié)。Wang等[39]發(fā)現(xiàn)miRNA-130a-3p靶向作用于tGfBr1、tGfBr2，從而抑制Smad2 和Smad3磷酸化，阻斷TGFβ信號(hào)通路從而抑制HSC活化，使HSC活化數(shù)量與增殖的標(biāo)志物α-SMA表達(dá)水平下調(diào)。鋅指蛋白3是肝癌癌前病變中重要的促纖維化基因，miRNA-378a-3p[40]可靶向抑制NF-κB信號(hào)通路的Smo下游鋅指蛋白3基因的表達(dá)，從而抑制HSC的活化。同時(shí)，研究[41]證實(shí)wnt10a是wnt/β-catenin通路的靶點(diǎn)之一，miRNA-378a-3p過表達(dá)可使Wnt/β-catenin途徑失活，從而抑制HSC的活化與增殖、α-SMA及膠原的表達(dá)。

HSC的活化過程中與TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。TLR4通過其胞內(nèi)區(qū)的TIRAP結(jié)構(gòu)，與MyD88的C端結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合，然后依次募集并活化MyD88下游的接頭蛋白，包括IRAK4、IRAK1、TRAF6和轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1(transforming growth factor β-activated kinase-1，TAK1)蛋白，其中，TAK1蛋白既可以激活I(lǐng)KK-NF-κB信號(hào)途徑，也可以激活p38-NF-κB信號(hào)途徑，均能促使NF-κB磷酸化并激活，進(jìn)而活化HSC，增加肝纖維化和炎癥反應(yīng)。研究[42]證實(shí)，miRNA-326過表達(dá)可抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路，從而抑制HSC活化，降低癌前相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，增加細(xì)胞凋亡。

Kupffer細(xì)胞是位于肝竇中的特殊巨噬細(xì)胞，活化的M2型Kupffer細(xì)胞分泌TGFβ，有效的激活HSC并維持其活性[43]。研究[44]表明，miRNA-155可通過靶向抑制IL-13受體α1來抑制Kupffer細(xì)胞向M2型極化，從而減少TGFβ的分泌，除此之外，miRNA-19a-3p通過靶向抑制Far-1而抑制其下游原癌基因Fos，進(jìn)而抑制M2型Kupffer細(xì)胞的極化，減少細(xì)胞因子的分泌進(jìn)而抑制HSC活化[45]。

雙熒光素酶報(bào)告分析表明[46]，miRNA-185通過直接靶向RHEB和RICTOR的3′UTR降解其mRNA，進(jìn)而阻斷Smad信號(hào)與TGFβ的轉(zhuǎn)換，下調(diào)α-SMA、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原等纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制HSC的激活。

研究[47]發(fā)現(xiàn),miRNA-340可以通過抑制SPP1基因進(jìn)而抑制LX-2細(xì)胞活化、降低細(xì)胞外基質(zhì)沉積和增殖,抑制TGFβ1/Smad信號(hào)通路激活從而抑制HSC活化,進(jìn)而影響肝癌癌前病變發(fā)生和發(fā)展的進(jìn)程(圖2)。

3 小結(jié)

肝癌癌前病變的發(fā)生與HSC活化密切相關(guān)。在肝細(xì)胞受損的基礎(chǔ)上，HSC活化并釋放大量異常信號(hào)因子，一方面干擾損傷肝細(xì)胞再生修復(fù)而發(fā)生基因變異，從而促進(jìn)HCC癌前病變的啟動(dòng)進(jìn)程，在變異基因不斷蓄積之下遺傳給子代細(xì)胞，并穩(wěn)定表達(dá)，促使肝癌癌前病變細(xì)胞的形成；另一方面，大量異常信號(hào)因子調(diào)控信號(hào)通路傳導(dǎo)，加劇炎癥微環(huán)境的形成，促進(jìn)肝癌癌前病變細(xì)胞惡變?yōu)槟[瘤細(xì)胞，并發(fā)生擴(kuò)散，遷移與增長。而miRNA通過與mRNA的3′UTR區(qū)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因，干預(yù)HSC相關(guān)細(xì)胞因子的分泌或蛋白基因的表達(dá)，影響炎性微環(huán)境成分，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)HSC活化，影響肝癌癌前病變惡性轉(zhuǎn)變的作用?；趍iRNA調(diào)控HSC活化干預(yù)肝癌癌前病變惡變，將成為肝癌防治工作的新思路和新靶點(diǎn)。