響應(yīng)面法優(yōu)化毛蝦酶解工藝條件

侯小楨，張伊敏，林群超，章 斌

（韓山師范學(xué)院 食品工程與生物科技學(xué)院，廣東 潮州 521041）

水解蛋白由于富含氨基酸、氨基酸鈉鹽與多肽，已被廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑、功能性配料、鮮味料或通過與還原糖發(fā)生Maillard反應(yīng)制備熱加工味料［1-2］.蛋白質(zhì)水解方法主要有酸水解法、堿水解法及酶解法，酸水解法易產(chǎn)生氯丙醇，生成的香料仿真度低，且水解產(chǎn)物中色氨酸基本都會被破壞，目前該法基本被淘汰；堿水解法容易使氨基酸消旋，甚至?xí)捎卸竞Φ氖中詫τ丑w，一般食品加工中不能采用.蛋白質(zhì)酶解法是利用酶的催化分解作用，將大分子的肉類蛋白質(zhì)在一定程度上切割成小分子的肽類和氨基酸.用酶解技術(shù)獲得的水解動物蛋白含有大量的游離氨基酸，可以用于調(diào)味品的增香，增加風(fēng)味料的濃度，使制得的產(chǎn)品風(fēng)味明顯，滋味完美，可廣泛用于各種食品、保健食品及用作各類天然香精的基料，該法是目前較為理想的制備方法，也是今后咸味調(diào)味料生產(chǎn)的主流趨勢［3-5］.目前已有不少采用蛋白酶水解的牛肉、雞肉、豬肉的報(bào)道，制得的動物水解蛋白可用于制備肉類香料.

粵東地區(qū)的海洋低值蝦類資源極為豐富，但利用卻相對滯后；每年都有大量的低值蝦類因各種原因被廢棄或加工成附加值很低的產(chǎn)品，或成為飼料等，而更多的低值蝦由于未被及時(shí)利用而排入海洋，造成資源的浪費(fèi)和海洋環(huán)境的污染.研究表明［6-7］，毛蝦這一低值蝦中含多種礦物質(zhì)元素，蛋白質(zhì)含量豐富，其中含有人體必需的8種氨基酸，是非常優(yōu)良的食物蛋白資源.而目前對這一優(yōu)質(zhì)資源的研究應(yīng)用相對較少.因此，本文以盛產(chǎn)于粵東地區(qū)的低值毛蝦為試材，在篩選最佳蛋白酶種類基礎(chǔ)上，探討毛蝦的蛋白酶解影響因素，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化其酶解工藝條件，以期獲得風(fēng)味良好的蝦味香料的反應(yīng)前體物質(zhì)，為毛蝦的高值化綜合利用提供一定試驗(yàn)參考.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毛蝦：購于饒平海鮮綜合市場，-18 ℃冰柜儲存；Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶（500 LAPU/g）、Papain木瓜蛋白酶（5×105U/g）、Alcalase 堿性蛋白酶（2.4 AU/g）、Neutrase 中性蛋白酶（1.5 AU/g）、Protamex復(fù)合蛋白酶（1.5 AU/g）：諾維信生物技術(shù)有限公司.濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、蒽酮、三氯乙酸等：均為分析純.

DDY-1C 型自動定氮儀：北京興華真空儀表廠；UV755B 紫外可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；AUW120型電子分析天平：日本島津公司；HJ-6磁力攪拌器：常州國華電器有限公司；HHS11-4電熱恒溫水浴鍋：上海悅豐儀器儀表有限公司；L-8800氨基酸分析儀：日本日立公司.

1.2 方法

1.2.1 酶解工藝流程

毛蝦→曬干→去雜質(zhì)→粉碎→加水→預(yù)熱→酶解→升溫滅酶→離心→酶解液.

1.2.2 酶解單因素試驗(yàn)

按一定固液比（1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8 g/mL）配制毛蝦和水的混合物，加入不同量（500 U/g、600 U/g、700 U/g、800 U/g）的蛋白酶后，在不同pH（水的自然pH 6.8、pH 5.5、pH 7.0、pH 8.5）、不同酶解溫度（40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃）條件下，酶解不同時(shí)間（0、1、2、3、4、5、6 、7 h）；以酶解產(chǎn)物中的AAN含量和TCA可溶性氮含量為主要評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選酶解條件.

1.3 試驗(yàn)指標(biāo)與測定方法

可溶性氮（TCA）含量的測定：參照遲海［8］所述方法進(jìn)行.水分含量的測定［9］：常壓干燥法；總氮含量測定［9］：微量凱氏定氮法；脂肪含量測定［9］：索氏提取法；還原糖測定：按《GB 5009.7-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)：食品中還原糖的測定》進(jìn)行；灰分測定［9］：高溫灼燒法；氨基酸態(tài)氮（AAN）含量測定［9］：甲醛電位滴定法；總糖測定［9］：蒽酮比色法；游離氨基酸測定：按《GB 5009.124-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)：食品中氨基酸的測定》進(jìn)行；總氨基酸測定［9］：甲醛滴定法.

2 結(jié)果與分析

2.1 毛蝦成分分析

試驗(yàn)所用原料毛蝦的主要成分、游離氨基酸和總氨基酸含量如表1、表2所示.由表1可看出，毛蝦蛋白質(zhì)含量豐富，高達(dá)66.48%；表2測定結(jié)果表明毛蝦蛋白質(zhì)中各類氨基酸的組成合理，富含人體健康所需的8種必須氨基酸，其中5種必須氨基酸含量超過2 000 mg/100 g，因此具有很好的開發(fā)前景.

2.2 蛋白酶篩選

表1 毛蝦主要成分的含量

依據(jù)所購酶的最適活力條件及前期預(yù)試驗(yàn)，在各酶的最適條件下；固液比為1∶5 g/mL，加酶量為E/S = 600 U/g，50 ℃下水解5 h，酶解效果如圖1、圖2 所示，可見Protamex 和Flavourzyme 的AAN和TCA可溶性氮含量都比較高，酶解效果較好，Papain次之，而Alcalase和Neutrase較弱；但結(jié)合表3的酶解液感官評定結(jié)果，可看出Protamex酶解效果雖然較好，但蝦香味較弱，且鮮味也不夠突出；Papain的酶解效果雖不及Protamex，但其酶解液口味較好，回味甘甜；Flavourzyme作用后的酶解液蝦香濃郁，后味較好；Alcalase和Neutrase無論從酶解效果和感官評定上都相對較差，且兩種酶的價(jià)格也相對昂貴.綜合酶解效果和酶本身的購買成本考慮，選用Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶為試驗(yàn)用酶.

表2 毛蝦的游離氨基酸和總氨基酸含量

圖1 各種蛋白酶對AAN含量的影響

圖2 各種蛋白酶對TCA可溶性氮含量的影響

2.3 風(fēng)味蛋白酶酶解毛蝦的單因素試驗(yàn)

2.3.1 酶用量對酶解效果的影響

一定條件下，酶解反應(yīng)速度與酶濃度成正比；但當(dāng)酶濃度達(dá)到一定值，所有酶分子已被底物所飽和，即酶分子與底物結(jié)合部位己被占據(jù)，速度則不再增加［3-4］.從圖3和圖4可看出：AAN值和TCA可溶性氮值均隨酶用量增加而增加，但增加幅度不明顯，可能是因?yàn)樵谠囼?yàn)條件下，底物的量是一定的，酶用量較大時(shí)，E/S 值越大，在水解的起始階段水解速度較快，底物迅速減少，且隨時(shí)間的延長，底物減少到一定量引起水解速度的增加減緩或不再增加.酶解5 h時(shí)，添加量為700 U/g的毛蝦液中的AAN 值僅比600 U/g 的增加0.0157 g/100 mL，TCA 可溶性氮含量也僅多了0.013 g/mL.因此，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，確定風(fēng)味蛋白酶用量為600 U/g.

2.3.2 固液比對酶解效果的影響

酶解反應(yīng)過程中，提高底物濃度一定程度上可加快反應(yīng)速度［5］.圖5和圖6表明：隨酶解時(shí)間的延長，AAN含量和TCA可溶性氮含量隨固液比增大呈先增大后降低的變化趨勢；且在固液比1∶4時(shí)達(dá)至最高.造成這一現(xiàn)象的可能原因是固液比過高，底物濃度和酶的有效濃度均降低，不利于底物在溶解狀態(tài)下與酶有效結(jié)合，酶解效果較差；固液比過低時(shí)，除酶解效果不理想外，還將導(dǎo)致后期濃縮工序的時(shí)間延長；因此，綜合考慮確定本試驗(yàn)的最佳固液比為1∶4.

表3 蛋白酶作用后的酶解液感官評定

圖3 酶用量對AAN含量的影響

圖4 酶用量對TCA可溶性氮含量的影響

圖5 固液比對AAN含量的影響

圖6 固液比對TCA可溶性氮含量的影響

2.3.3 酶解溫度對酶解效果的影響

溫度主要從兩個(gè)方面直接影響蛋白質(zhì)酶解反應(yīng)的效率：一是對蛋白酶催化反應(yīng)速度的影響，即溫度過低，蛋白酶活性不足，酶解反應(yīng)速度相應(yīng)較低；溫度過高，則易使蛋白酶失去活性，同樣降低酶解反應(yīng)速率.二是對蛋白酶穩(wěn)定性的影響，即溫度升高使酶分子更活躍，蛋白質(zhì)與酶分子的碰撞更頻繁，從而提高蛋白酶的酶解速度.從圖7 和圖8 可看出：隨著溫度的升高，毛蝦液中的AAN 含量和TCA可溶性氮含量先升高后降低，于50 ℃時(shí)達(dá)到最高，因此，確定酶解溫度在50～55 ℃范圍較適宜.

圖7 酶解溫度對AAN含量的影響

圖8 酶解溫度對TCA可溶性氮含量的影響

2.3.4 pH值對酶解效果的影響

pH值對酶催化反應(yīng)的影響包括兩個(gè)方面：影響酶的穩(wěn)定性和影響酶與底物的結(jié)合以及酶催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物.酶只有處于游離狀態(tài)時(shí)，才能與底物結(jié)合，不同的pH 值會使酶處于不同的游離狀態(tài)，產(chǎn)生不同的空間構(gòu)象從而影響酶的活力和酶解效果.由圖9和圖10可知，pH 7.0的酶解液中AAN含量和TCA可溶性氮含量最低，pH 5.5、pH 8.5次之；但采用添加緩沖鹽的酶解液，其風(fēng)味均較差；而采用自來水的自然pH 6.8 為pH 的酶解液，其AAN 含量和TCA 可溶性氮含量最高，整體風(fēng)味也最好，這可能是因?yàn)樵谧詠硭淖匀籶H 6.8下，酶分子上的必需基團(tuán)處于最佳的解離狀態(tài)，最適合與底物結(jié)合并催化底物反應(yīng)，從而使得反應(yīng)速度加快，酶解效果更好.因此，確定采用自來水的自然pH 6.8為最佳pH值.

圖9 pH值對AAN含量的影響

圖10 pH值對TCA可溶性氮含量的影響

2.3.5 酶解時(shí)間對酶解效果的影響

從圖11和圖12可看出，毛蝦液中的AAN含量和TCA可溶性氮含量隨時(shí)間的延長而逐漸增加，酶解6 h后的增加速率變緩，可能是由于隨酶解時(shí)間的延長，底物逐漸減少，產(chǎn)物逐漸增加，導(dǎo)致反應(yīng)速度逐漸下降；且試驗(yàn)中觀察到酶解時(shí)間超過8 h后的酶解液，顏色加深并產(chǎn)生異味，對后期進(jìn)行美拉德反應(yīng)帶來不利的影響；同時(shí)，延長酶解時(shí)間會增加生產(chǎn)成本和微生物繁殖的機(jī)會.因此，試驗(yàn)選擇最佳酶解時(shí)間為6 h.

圖11 酶解時(shí)間對AAN含量的影響

圖12 酶解時(shí)間對TCA可溶性氮含量的影響

2.4 酶解工藝的優(yōu)化試驗(yàn)

2.4.1 Box-behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果

在上述單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，考慮到后續(xù)美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，以AAN 含量為指標(biāo)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝條件，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4.

2.4.2 回歸方程模型的建立

運(yùn)用SAS RSREG程序?qū)?5個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，確定試驗(yàn)回歸方程如下：

Y = 0.924333 + 0.0085X1+ 0.0615X2+ 0.01125X3- 0.048792X12+ 0.00175X1X2+ 0.00175X1X3-0.022792X22-0.00725X2X3-0.028292X32

對該模型方程及回歸系數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5.

由表5 可看出，方程的F 值=38.77369 ＞f0.01（9，5）=10.2，說明該方程是高度顯著的，從回歸方程各項(xiàng)方差的進(jìn)一步檢驗(yàn)也可看出，失擬檢驗(yàn)不顯著，說明模型是很理想的.X2（時(shí)間）、X3（加酶量）對Y（AAN含量）具有線性影響，X1（溫度）、X2和X3具有二次影響，而交互項(xiàng)的影響不顯著，說明試驗(yàn)因子與響應(yīng)值間不是簡單的線性關(guān)系.根據(jù)F值的大小，可判定各試驗(yàn)因子對響應(yīng)值Y的影響依次是：X2（時(shí)間）＞X12（溫度的二次項(xiàng)）＞X32（加酶量的二次項(xiàng)）＞X22（時(shí)間的二次項(xiàng)）＞X3（加酶量）.

2.4.3 響應(yīng)面分析

由圖13 可看出隨著溫度的升高，AAN含量先增加再降低；隨著時(shí)間的延長，AAN含量呈上升趨勢；隨著加酶量的增加，AAN含量先明顯增加，之后增長緩慢.由圖14可知，當(dāng)加酶量一定的時(shí)候（X3=0），隨著酶解時(shí)間的延長，AAN含量逐漸增大，而酶解時(shí)間沒有優(yōu)化值；隨著溫度的變化，AAN 含量也隨之增加，達(dá)到一個(gè)最高點(diǎn)后，又逐漸減??；在溫度0～0.3（55～56.6 ℃），時(shí)間在設(shè)定時(shí)間內(nèi)，響應(yīng)面有最大值.由圖15可知，當(dāng)時(shí)間一定的時(shí)候（X2～0），隨著溫度的升高和加酶量的增加，AAN含量都是先增加后逐漸減??；在溫度0～0.3（55～56.6 ℃），加酶量0～0.3（600～630 U/g）之間，響應(yīng)面有極大點(diǎn).由圖16 可知，當(dāng)溫度一定的時(shí)候（X1=0），隨著加酶量的增加，AAN含量先增加后逐漸減少；隨著時(shí)間的延長，AAN含量顯著增加，達(dá)到最大的時(shí)候已經(jīng)超過試驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間；在加酶量0～0.3（600～630 U/g）之間，在時(shí)間在設(shè)定時(shí)間內(nèi)，響應(yīng)面有最大值.

表5 回歸方程的方差分析

圖13 溫度（X1）、時(shí)間（X2）、加酶量（X3）對Y響應(yīng)的模型曲線圖

2.4.4 優(yōu)化結(jié)果

考慮到酶解時(shí)間、酶解液風(fēng)味與后期美拉德反應(yīng)液的風(fēng)味關(guān)系，在最大限度提高游離氨基酸含量的基礎(chǔ)上，對Y進(jìn)行優(yōu)化；得到的最佳組合為：固液比1∶4，pH為自來水的自然pH 6.8，酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間6 h，加酶量600 U/g，此條件下的理論值Y=0.963；得此優(yōu)化條件下的試驗(yàn)驗(yàn)證值為Y=0.958，且得到的酶解液風(fēng)味較好，蝦香濃郁，進(jìn)一步證明響應(yīng)面法得到的最佳工藝條件的可靠性.

圖14 溫度（X1）和時(shí)間（X2）對AAN含量的影響

圖15 溫度（X1）和加酶量（X3）對AAN含量的影響

圖16 時(shí)間（X2）和加酶量（X3）對AAN含量的影響

3 結(jié)論

對毛蝦的營養(yǎng)成分進(jìn)行分析，包括水分、粗蛋白、脂肪、灰分、總糖等成分，其中粗蛋白達(dá)到66.48%，是良好的蛋白質(zhì)資源；游離氨基酸為72.10 g/L，總氨基酸達(dá)到54 360 mg/100 g，其中人體必需氨基酸含量豐富，蘊(yùn)含巨大的開發(fā)價(jià)值.

經(jīng)不同蛋白酶的初步篩選，確定試驗(yàn)用酶為風(fēng)味蛋白酶.單因素試驗(yàn)確定風(fēng)味蛋白酶的酶解條件為：固液比1∶4，加酶量600 U/g，以自來水的自然pH為6.8，在50～55 ℃下酶解5～6 h，AAN含量達(dá)到0.88 g/100 mL.

通過Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，建立酶用量、酶解時(shí)間、酶解溫度三因素相互關(guān)系的模型：Y=0.924333 + 0.0085X1+ 0.0615X2+ 0.01125X3- 0.048792X12+ 0.00175X1X2+ 0.00175X1X3- 0.022792 X22-0.00725X2X3-0.028292X32.同時(shí)，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定酶解最佳條件為：固液比1∶4，pH為自來水的自然pH6.8，酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間6 h，加酶量600 U/g，此條件下的AAN 含量理論值Y=0.963 g/100 mL.

通過酶解所得的毛蝦酶解產(chǎn)物可作為香料的前體物質(zhì)或基香使用，也可將酶解產(chǎn)物直接作為原料或配料加工成調(diào)味醬等休閑食品，但具體工藝參數(shù)條件仍需依據(jù)其實(shí)際用途或目標(biāo)產(chǎn)品要求進(jìn)一步探討.