一種基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時測定大米中10種真菌毒素和殺鼠劑的檢測方法

趙健，呂燕，許秀琴，吳銀良

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 寧波市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，浙江 寧波 315040)

殺鼠劑和真菌毒素是可能污染糧食的2類有毒有害物質(zhì)。殺鼠劑在稻谷種植和儲藏階段被廣泛應(yīng)用，誤用或處理不當都會造成糧食的污染[1-2]。真菌毒素在稻谷的生長過程中，尤其是在儲藏過程中，被真菌不斷地代謝出來，會造成糧食的污染。同時，部分真菌毒素還具有“三致”(致突變、致癌、致畸)作用[3-5]。因此，同時監(jiān)測稻谷是否被殺鼠劑和真菌毒素污染，對保證糧食安全具有非常積極的意義。

目前，關(guān)于殺鼠劑和真菌毒素的檢測方法在國內(nèi)外已有報道[6-7]。其中，對殺鼠劑的檢測多關(guān)注于血漿[8-9]、動物組織[10]、食品[11-13]等基質(zhì)，對真菌毒素的檢測多關(guān)注于糧食[14-15]、食品[16]、中藥[17]、食品添加劑[18]等基質(zhì)?？偟膩砜矗F(xiàn)有的檢測方法多局限于殺鼠劑或真菌毒素單類藥物，使用QuECHERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定殺鼠劑和真菌毒素的方法仍較少見。本研究基于現(xiàn)有研究基礎(chǔ)，通過篩選和優(yōu)化提取試劑、凈化材料和液相質(zhì)譜儀器條件，建立一套基于QuECHERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測大米中10種藥物(氯滅鼠、安妥、大隆、殺鼠靈、殺鼠醚、赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B、黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、玉米赤霉烯酮)的方法，旨在為糧食樣品快速檢測殺鼠劑和真菌毒素提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

XEVO TQ超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS)，配電噴霧離子源(ESI)，美國Waters；N-EVAP-24氮吹儀，美國Organomation；PL3002電子天平、XPE205天平，Mettler Toledo；KS4000ic控溫搖床，德國IKA；LM3310盤式實驗粉碎磨，瑞典Perten。

1.2 試驗試劑

甲醇、乙腈、甲酸，色譜純，德國Merck；硅膠、N-丙基乙二胺(PSA)，上海安譜科學(xué)儀器；多壁碳納米管，南京先豐納米材料科技有限公司。

氯滅鼠、安妥、大隆、殺鼠靈、殺鼠醚購于德國Dr. Ehrenstorfer，赭曲霉毒素A(OTA)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、赭曲霉毒素B(OTB)、黃曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮購于加拿大TRC，以上物質(zhì)的純度均大于95%。樣品粉碎，-20 ℃儲存。

1.3 溶液配制

儲備液：稱取適量固體標樣，用乙腈溶解，配成100 mg·L-1的儲備液，-20 ℃保存。

工作液：取儲備液用基質(zhì)空白依次稀釋至適當濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

提取溶液：乙腈-水-甲酸混合溶液，三者體積比為80∶19∶1。

1.4 樣品提取與凈化

稱取粉碎后的大米樣品2.50 g，置于50 mL塑料離心管中，加入10 mL提取溶液，放勻漿儀上12 000g勻漿2 min，振蕩15 min后超聲2 min，9 500g離心5 min。準確移取4.00 mL上清液至裝有80 mg PSA的10 mL塑料離心管中，渦旋1 min，9 500g離心3 min，準確移取2.50 mL凈化溶液于另一個10 mL試管中，在氮氣流下40 ℃水浴濃縮近干，殘液用1 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液(體積比1∶1)共1 mL溶解，12 500g離心3 min，待測。

1.5 液相條件

色譜柱，Acquity UPLC BEH Shield RP18 2.1 mm×100 mm，1.7 μm；進樣體積，10 μL；色譜柱溫度，40 ℃；樣品室溫度，20 ℃；流動相A，乙腈；流動相B，0.1%(體積分數(shù))甲酸水溶液。

梯度洗脫程序：0 min，流速0.4 mL·min-1，流動相A，20%(體積分數(shù)，下同)，流動相B，80%；1 min，流速0.4 mL·min-1，流動相A，20%，流動相B，80%；3 min，流速0.4 mL·min-1，流動相A，50%，流動相B，50%；5 min，流速0.4 mL·min-1，流動相A，90%，流動相B，10%；9 min，流速0.4 mL·min-1，流動相A，90%，流動相B，10%；9.1 min，流速0.4 mL·min-1，流動相A，20%，流動相B，80%；12 min，流速0.4 mL·min-1，流動相A，20%，流動相B，80%。

1.6 質(zhì)譜條件

離子源，電噴霧離子源(ESI+和ESI-同時掃描)；檢測方式，多反應(yīng)監(jiān)測；電離電壓，2.50 kV；霧化氣流速，1 000 L·h-1；錐孔氣流速，30 L·h-1；離子源溫度，150 ℃；霧化溫度，500 ℃。各化合物的質(zhì)譜條件如下：氯滅鼠，定性離子對343.0/120.9(m/z，下同)，定量離子對343.0/284.9，錐孔電壓24 V，碰撞能量40、20 V；安妥，定性離子對203.1/127.3，定量離子對203.1/144.0，錐孔電壓26 V，碰撞能量30、16 V；大隆，定性離子對521.3/78.9，定量離子對521.3/135.1，錐孔電壓-68 V，碰撞能量-34、-38 V；殺鼠靈，定性離子對307.3/250.1，定量離子對307.3/161.0，錐孔電壓-36 V，碰撞能量-18、-22 V；殺鼠醚，定性離子對291.2/106.0，定量離子對291.1/141.0，錐孔電壓-42 V，碰撞能量-26、-28 V；OTA，定性離子對404.5/358.1，定量離子對404.5/239.1，錐孔電壓25 V，碰撞能量25、14 V；OTB，定性離子對370.2/187.1，定量離子對370.2/205.1，錐孔電壓22 V，碰撞能量36、18 V；AFB1，定性離子對313.2/241.1，定量離子對313.2/213.1，錐孔電壓46 V，碰撞能量46、38 V；AFB2，定性離子對315.3/287.1，定量離子對315.3/259.1，錐孔電壓46 V，碰撞能量28、24 V；玉米赤霉烯酮，定性離子對317.3/149.0，定量離子對317.3/175.0，錐孔電壓-44 V，碰撞能量-20、-26 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑選擇

大米樣品含水量較少，提取溶液需加入水相以提高回收率。此外，10種藥物均可溶解于乙腈和甲醇中，但它們結(jié)構(gòu)差異較大，部分藥物還含有酸堿性基團。為保證所有藥物的回收率，采用在乙腈和甲醇中加入少量水或者甲酸水溶液作為提取液的思路。這樣做也有利于濃縮，提高定量限。為此，通過試驗考查了乙腈-水(體積比80∶20)、甲醇-水(體積比80∶20)、乙腈-水-甲酸(體積比80∶19∶1)、甲醇-水-甲酸(體積比80∶19∶1)4種提取溶液對10種藥物的回收率和提取效果，并通過基質(zhì)匹配的外標法進行計算。結(jié)果表明：當使用沒有甲酸的提取溶液進行提取時，OTA和OTB等藥物的回收率在50%以下；當使用含有甲酸的提取溶液進行提取時，所有藥物的回收率均在70～120%。鑒于乙腈比甲醇能更好地去除大米中的蛋白質(zhì)，最終選擇乙腈-水-甲酸(體積比80∶19∶1)作為提取溶劑。

2.1.2 凈化材料選擇

凈化過程，既要兼顧藥物的回收率，又要考慮除去提取液中更多的雜質(zhì)，減少基質(zhì)效應(yīng)和樣液中雜質(zhì)對儀器的污染。因大米含有豐富的糖和蛋白質(zhì)，為取得較好的回收率，分別選用硅膠、PSA和多壁碳納米管作為填料，以期使用簡便的方式，取得較佳的凈化效果。結(jié)果表明：以硅膠作為凈化材料時，安妥、大隆等藥物的回收率低于60%；以多壁碳納米管作為凈化材料時，AFB1、AFB2等藥物的回收率低于50%，其他8種藥物回收率均在70%以上；以PSA作為凈化材料時，當4.00 mL乙腈-水-甲酸(體積比80∶19∶1)提取溶液中使用80 mg填料時凈化效果最好，10種藥物的回收率在70%～120%。

2.1.3 色譜條件優(yōu)化

流動相的選擇，關(guān)系到樣品的分離度和離子化效果。10種藥物的結(jié)構(gòu)差異較大，需正、負離子同時掃描。為提高藥物的電離度，得到更好的靈敏度，試驗對比了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液4套體系，通過調(diào)整有機相和水相的梯度，使液相條件最佳。結(jié)果表明，甲醇、乙腈加水作為流動相時，OTA等幾種藥物的峰形較寬；而加入甲酸的流動相，10種藥物均能得到較好的峰形。有機相為乙腈時，10種藥物的靈敏度和峰形均優(yōu)于以甲醇為有機相時，所以選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液體系。

2.1.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)10種藥物的理化性質(zhì)，大隆、殺鼠醚、殺鼠靈和玉米赤霉烯酮的電離化模式為ESI-，其他藥物的電離化模式為ESI+。應(yīng)用儀器自帶的工作站自動優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，最終建立10種藥物的多反應(yīng)檢測掃描(MRM)方法。

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 基質(zhì)效應(yīng)

大米營養(yǎng)組分豐富，雖然提取溶液經(jīng)過凈化，但是樣液中未凈化雜質(zhì)，仍有可能對藥物產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，從而影響最終的檢測結(jié)果。為驗證上述方法最終上機溶液的基質(zhì)效應(yīng)，對用溶劑和基質(zhì)空白分別配制的系列混合標準工作溶液進行比較，配制的系列濃度范圍為2～100 μg·L-1。表1列出了10種藥物的基質(zhì)標液與溶劑標液線性回歸方程的斜率比，結(jié)果顯示，氯滅鼠、玉米赤霉烯酮等幾種農(nóng)藥的斜率比超出0.8～1.2的閾值，說明大米樣液中仍有較強的基質(zhì)效應(yīng)。為此，最終選擇基質(zhì)標液定量。

表1 溶劑標液和基質(zhì)標液的線性回歸方程和斜率比

2.2.2 定量限和線性關(guān)系

用大米基質(zhì)空白配制10種真菌毒素和殺鼠劑的混合標液，質(zhì)量濃度依次為2、5、10、20、100 μg·L-1。結(jié)果表明，當質(zhì)量濃度為2～100 μg·L-1，10種藥物的回歸曲線的決定系數(shù)(R2)在0.991 0～0.999 8，線性關(guān)系良好。開展大米空白樣品添加試驗，以10倍信噪比時的添加濃度為方法定量限，結(jié)果如表2所示，10種藥物的定量限在0.5～2.5 μg·kg-1。

2.2.3 回收率與精密度

稱取不含10種真菌毒素和殺鼠劑的大米樣品，添加混合標樣，添加濃度(質(zhì)量分數(shù))分別為8、20、100 μg·kg-1，每個水平做5次平行。結(jié)果顯示，10種藥物的平均回收率為75.2%～110.0%，相對標準偏差為1.4%～10.7%(表2)。

表2 10種藥物的添加回收率、相對標準偏差和定量限

3 小結(jié)

建立起一套可實現(xiàn)10種殺鼠劑和真菌毒素藥物同時提取、QuECHERS方法同時凈化、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀同時檢測的方法，經(jīng)驗證，所建立的方法簡單，快速，重現(xiàn)性好，適用于大米中氯滅鼠、安妥、大隆、殺鼠靈、殺鼠醚、赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B、黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、玉米赤霉烯酮等10種藥物的定性定量快速檢測。