支氣管肺泡灌洗液應(yīng)用TB-LAMP對(duì)菌陰肺結(jié)核的診斷價(jià)值

陳 霞，張建勇，趙建軍

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科呼吸二病區(qū)，貴州 遵義 563000)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的慢性傳染病，其中以肺結(jié)核最常見(jiàn)，最主要的傳播途徑是經(jīng)呼吸道傳播[1]。根據(jù)我國(guó)實(shí)行的結(jié)核病分類標(biāo)準(zhǔn)(WS196-2017)[2]將肺結(jié)核分為原發(fā)性肺結(jié)核，血行播散性肺結(jié)核，繼發(fā)性肺結(jié)核，氣管、支氣管結(jié)核，結(jié)核性胸膜炎。近年來(lái)，由于糖尿病和獲得性免疫缺陷綜合征發(fā)病率的增高，移民和流動(dòng)人口的數(shù)量增加，多種耐藥肺結(jié)核患者的增多以及許多地區(qū)和國(guó)家對(duì)結(jié)核病控制的無(wú)視等因素，導(dǎo)致全球結(jié)核病形勢(shì)非常嚴(yán)峻[3-4]。根據(jù)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年肺結(jié)核報(bào)告數(shù)位于國(guó)家法定甲、乙類傳染病的前列[5]。因此，肺結(jié)核的預(yù)防與控制成為我國(guó)首要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。目前，由于痰涂片抗酸染色檢測(cè)陽(yáng)性率低，以及痰培養(yǎng)法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度低等缺點(diǎn)，肺結(jié)核的診斷困難，其中約70%為菌陰肺結(jié)核(3次痰涂片均陰性且痰培養(yǎng)陰性)，因此，肺結(jié)核漏診、誤診等情況容易在臨床上出現(xiàn)，更使得結(jié)核病的控制成為難題[6]。而怎樣提高菌陰肺結(jié)核的陽(yáng)性診斷率，成為臨床醫(yī)生日益關(guān)注的問(wèn)題。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，結(jié)核分枝桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(tuberculosis loop-mediated isothermal amplification， TB-LAMP)在結(jié)核病的診斷方面取得了良好效果，使得TB-LAMP成為了目前結(jié)核分子檢測(cè)的有效工具之一[1,7]。故通過(guò)收集某院臨床確診菌陰肺結(jié)核患者的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，分別應(yīng)用TB-LAMP和GeneXpert MTB/RIF技術(shù)對(duì)BALF進(jìn)行MTB的檢測(cè)，評(píng)估不同方法LAMP在菌陰肺結(jié)核中的診斷價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集某院2017年12月—2018年11月臨床確診為菌陰肺結(jié)核的患者254例。菌陰肺結(jié)核最終診斷參照《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南(2008版)》涂陰肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)及中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《肺結(jié)核診斷》WS 288-2017。研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者年齡為13～80歲；(2)所有患者3次痰找抗酸桿菌(即時(shí)痰、夜間痰、晨痰)均為陰性且1次痰培養(yǎng)陰性。254例患者在行支氣管鏡檢查前均未行抗結(jié)核治療，均在簽署支氣管鏡檢查知情同意書(shū)后行支氣管鏡檢查，在病變部位進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，收集BALF標(biāo)本254份。BALF標(biāo)本隨機(jī)分為2組(LAMP組、GeneXpert組)，分別采用TB-LAMP、GeneXpert MTB/RIF技術(shù)進(jìn)行MTB核酸檢測(cè)，然后對(duì)所有患者進(jìn)行涂片抗酸染色和羅氏培養(yǎng)，收集資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本研究均在醫(yī)院倫理委員會(huì)監(jiān)管下完成。

1.2 儀器與試劑 由榮研生物科技有限公司提供TB-LAMP檢測(cè)試劑盒及恒溫?cái)U(kuò)增儀，由美國(guó)Cepheid 公司提供GeneXpert MTB/RIF 檢測(cè)試劑盒，由中國(guó)珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供抗酸染色液試劑盒，所有羅氏培養(yǎng)的培養(yǎng)基均按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》制備。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 研究方法

1.3.1 涂片抗酸染色 將支氣管鏡刷檢物進(jìn)行涂片，待其自然干燥后使用苯酚復(fù)紅染液染色，5 min后用流水沖洗染色液，瀝干水分后滴入脫色液，等待1 min后再滴加亞甲藍(lán)溶液染色30 s，最后水洗干燥后進(jìn)行鏡檢。

1.3.2 羅氏培養(yǎng) 將BALF樣本中加入等體積的4.0%NaOH溶液，振蕩搖勻后室溫靜置10 min，取沉淀1 mL接種到酸性羅氏斜面培養(yǎng)基上，使用37℃培養(yǎng)箱孵育，連續(xù)8周觀察MTB生長(zhǎng)情況，8周后未見(jiàn)MTB生長(zhǎng)則為陰性。若酸性羅氏斜面培養(yǎng)基上見(jiàn)菌落生長(zhǎng)，則需進(jìn)一步行抗酸染色檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，再采用對(duì)硝基苯甲酸 (PNB)鑒定菌落為非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacterium，NTM)還是MTB[8]。

1.3.3 TB-LAMP BALF樣本3 000 r/min離心15 min，棄上清液，取其沉淀30 μL用于TB-LAMP檢測(cè)，按照LAMP試劑盒操作流程進(jìn)行檢測(cè)，40 min后由儀器自動(dòng)判讀結(jié)果。

1.3.4 GeneXpert MTB/RIF BALF樣本3 000 r/min離心20 min，棄上清液，取其沉淀1 mL用于GeneXpert MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)，按照GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)操作流程進(jìn)行檢測(cè)，2 h后觀察結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用百分比描述，不同方法間配對(duì)計(jì)數(shù)資料的比較采用McNemar檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 共收集254例菌陰肺結(jié)核的患者，其中男性146例，女性108例，平均年齡為(49.04±17.18)(13～80)歲。LAMP組共96例，其中男性53例，女性43例，平均年齡為(50.23±16.57)(13～79)歲。GeneXpert組共158例，其中男性93例，女性65例，平均年齡(48.32±17.50)(13～80)歲。兩組患者性別及年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

2.2 LAMP組涂片抗酸染色、羅氏培養(yǎng)、TB-LAMP檢測(cè)結(jié)果 對(duì)LAMP組96例菌陰肺結(jié)核患者均進(jìn)行涂片抗酸染色、羅氏培養(yǎng)、TB-LAMP，陽(yáng)性率分別為4.17%(4/96)、18.75%(18/96)、52.08%(50/96)，其中4例涂片抗酸染色陽(yáng)性患者中羅氏培養(yǎng)均陽(yáng)性。TB-LAMP與涂片抗酸染色、羅氏培養(yǎng)MTB檢測(cè)陽(yáng)性率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 TB-LAMP與涂片抗酸染色、羅氏培養(yǎng)MTB檢測(cè)結(jié)果比較(例)

2.3 GeneXpert組涂片抗酸染色、羅氏培養(yǎng)、GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果 對(duì)GeneXpert組158例菌陰肺結(jié)核患者均進(jìn)行涂片抗酸染色、羅氏培養(yǎng)、GeneXpert MTB/RIF，MTB檢測(cè)陽(yáng)性率分別為3.80%(6/158)、12.66%(20/158)、54.43%(86/158)，其中6例涂片抗酸染色陽(yáng)性患者中羅氏培養(yǎng)均陽(yáng)性。GeneXpert MTB/RIF與涂片抗酸染色、羅氏培養(yǎng)MTB檢測(cè)陽(yáng)性率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 GeneXpert MTB/RIF與涂片抗酸染色、羅氏培養(yǎng)MTB檢測(cè)結(jié)果(例)

2.4 TB-LAMP與GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果比較 TB-LAMP與GeneXpert MTB/RIF對(duì)菌陰肺結(jié)核患者檢出MTB陽(yáng)性率分別為52.08%、54.43%，兩種方法陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.13，P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 TB-LAMP與 GeneXpert MTB/RIF MTB檢測(cè)結(jié)果比較(例)

3 討論

眾所周知，我國(guó)是全世界結(jié)核病高發(fā)國(guó)家之一。根據(jù)2018年WHO估計(jì)，全世界約有1 000萬(wàn)新發(fā)結(jié)核病患者，我國(guó)新發(fā)結(jié)核病患者約88.9萬(wàn)，約占全世界病例數(shù)的9%，而各地區(qū)結(jié)核病發(fā)病率存在明顯差異，其中以農(nóng)村區(qū)域?yàn)橹?；另外，結(jié)核病在全球疾病死因中占第9位，也是單一病原體感染造成死亡的首要原因之一，造成死亡人數(shù)高于人類免疫缺陷病毒(HIV)感染/艾滋病[6]。因此，提高結(jié)核病快速診斷方式以及有效控制結(jié)核病的傳播是治療結(jié)核病的關(guān)鍵[9]。目前在基層結(jié)核病診療機(jī)構(gòu)中，以痰涂片抗酸染色以及痰MTB培養(yǎng)作為診斷肺結(jié)核的主要依據(jù)[10]，但涂片抗酸染色找MTB的陽(yáng)性率約20%，痰MTB培養(yǎng)陽(yáng)性率約30%[11]，且MTB培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，一般需要4～8周，無(wú)法滿足結(jié)核病快速診斷的要求。因此，對(duì)于我國(guó)這樣的發(fā)展中國(guó)家，簡(jiǎn)單快速、高效經(jīng)濟(jì)的結(jié)核病檢測(cè)方法在臨床中具有重要意義。

LAMP是由Gelaw等[12]發(fā)現(xiàn)的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)的引物組由兩個(gè)外部(F3和B3)引物、兩個(gè)內(nèi)部引物(前向內(nèi)部引物FIP和向后內(nèi)部引物BIP)和環(huán)狀引物(環(huán)向前和環(huán)向后)組成，四個(gè)不同特異性的引物結(jié)合到六個(gè)不同區(qū)域的靶基因使其具有很高的特異性。LAMP反應(yīng)可以簡(jiǎn)單地在等溫條件下進(jìn)行高效的鏈置換DNA聚合酶反應(yīng)，通過(guò)鏈置換DNA合成的自我循環(huán)使靶序列長(zhǎng)度在300 bp以內(nèi)，最后形成不同長(zhǎng)度的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA鏈，使其具有高靈敏度。LAMP技術(shù)具有高效性是由于雙鏈DNA的擴(kuò)增不需要預(yù)先熱變性，核酸反應(yīng)均可在1 h內(nèi)完成且產(chǎn)物可以擴(kuò)增至109倍[13-15]。最后，可以通過(guò)目測(cè)其熒光顏色和/或濁度的變化來(lái)判讀結(jié)果，而不需要凝膠電泳或其他檢測(cè)儀器標(biāo)記的探針，且TB-LAMP技術(shù)全程均使用封閉系統(tǒng)，從而最大限度地降低了污染的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究中254例菌陰肺結(jié)核患者行支氣管檢查取支氣管鏡刷檢物或BALF標(biāo)本進(jìn)行涂片抗酸染色、羅氏培養(yǎng)、TB-LAMP或GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)，結(jié)果顯示，在臨床診斷為菌陰肺結(jié)核的254例患者中，涂片抗酸染色陽(yáng)性10例(陽(yáng)性率為3.94%)，羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性38例(陽(yáng)性率為14.96%)，其中10例涂片抗酸染色陽(yáng)性患者的羅氏培養(yǎng)均為陽(yáng)性；由此可見(jiàn)，臨床上考慮可疑菌陰肺結(jié)核患者可以進(jìn)一步行支氣管檢查取支氣管鏡刷檢物或BALF標(biāo)本，進(jìn)行涂片抗酸染色及MTB羅氏培養(yǎng)，以提高菌陰肺結(jié)核的診斷率。254份BLAF標(biāo)本隨機(jī)分為兩組(LAMP組、GeneXpert組)，在LAMP組96例患者中，TB-LAMP MTB檢測(cè)陽(yáng)性率為52.08%，其中4例涂片抗酸染色陽(yáng)性患者中TB-LAMP均陽(yáng)性；18例羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性患者中有1例TB-LAMP陰性，導(dǎo)致羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性而TB-LAMP陰性的原因考慮與LAMP操作人員采集標(biāo)本部位以及標(biāo)本量相關(guān)[16]。

本研究菌陰肺結(jié)核患者進(jìn)一步行涂片抗酸染色、羅氏培養(yǎng)、TB-LAMP及GeneXpert MTB/RIF MTB檢測(cè)陽(yáng)性率分別為3.94%(10/254)、14.96%(38/254)、52.08%(50/96)、54.43%(86/158)。因此，菌陰肺結(jié)核患者行支氣管鏡肺泡灌洗采集BALF標(biāo)本，做涂片抗酸染色、羅氏培養(yǎng)、TB-LAMP及GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)均可以提高結(jié)核病的診斷率。相關(guān)研究[17]指出，通過(guò)支氣管鏡獲得的支氣管鏡刷檢物標(biāo)本或BALF標(biāo)本對(duì)其進(jìn)行涂片抗酸染色或MTB羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性率高于痰標(biāo)本陽(yáng)性率，且對(duì)結(jié)核病診斷的靈敏度有所提高，本研究結(jié)果與此一致。由WHO推薦的新型結(jié)核分枝桿菌快速檢測(cè)方法GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)熒光定量核酸擴(kuò)增方法檢測(cè)MTB利福平耐藥基因rpoB的81 bp耐藥核心區(qū)是否發(fā)生突變，可以在快速檢測(cè)MTB同時(shí)還可以檢測(cè)利福平耐藥[18]。本研究通過(guò)對(duì)TB-LAMP與GeneXpert MTB/RIF技術(shù)進(jìn)行比較，評(píng)估TB-LAMP的效能，研究結(jié)果顯示TB-LAMP及GeneXpert MTB/RIF MTB檢出陽(yáng)性率分別為52.08%、54.43%，兩者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與陳伊等[19]研究結(jié)果相同。

與涂片抗酸染色相比，首先TB-LAMP不需要通過(guò)專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行鏡檢，其次靈敏度及特異度均高于涂片抗酸染色，最重要的是還可以區(qū)分MTB與NTM[20]；與羅氏培養(yǎng)相比較，TB-LAMP陽(yáng)性率高于羅氏培養(yǎng)，而且TB-LAMP具有檢測(cè)過(guò)程操作簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)；與GeneXpert MTB/RIF相比，TB-LAMP是一種等溫DNA擴(kuò)增技術(shù)，不需要提供專門的核酸擴(kuò)增設(shè)備，同時(shí)也不需要高難度的技術(shù)支撐，并且在檢測(cè)設(shè)備費(fèi)用及設(shè)備環(huán)境要求方面均較低，從而給發(fā)展中國(guó)家或地區(qū)的結(jié)核病防治減輕壓力[21]。因此， TB-LAMP為結(jié)核病的快速高效診斷提供了替代方法，對(duì)于臨床診斷肺結(jié)核有重要意義。但TB-LAMP在檢測(cè)MTB利福平耐藥方面欠缺，因而僅能用于對(duì)低風(fēng)險(xiǎn)耐藥結(jié)核患者進(jìn)行檢測(cè)[22]，在臨床工作應(yīng)用中有一定的不足。

另外，近年來(lái)越來(lái)越多的研究報(bào)道TB-LAMP與GeneXpert MTB/RIF技術(shù)在痰標(biāo)本檢測(cè)中的應(yīng)用，也取得了良好的效果[20,23]，但通過(guò)BLAF標(biāo)本行TB-LAMP檢測(cè)MTB目前仍缺乏進(jìn)一步探究。本研究發(fā)現(xiàn)在臨床診斷的菌陰肺結(jié)核患者中，TB-LAMP陽(yáng)性率明顯高于涂片抗酸染色以及羅氏培養(yǎng)，且與GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)具有一致性，可為臨床上結(jié)核病的診斷提供新方法，值得在臨床中進(jìn)一步推廣應(yīng)用。