重慶卷丹病毒檢測與脫毒方法研究

符勇耀,楊利平,高海洪,徐文姬,雷美艷,王安祥

(1.長江師范學院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學院，重慶 408100； 2重慶市藥物種植研究所，重慶 408435)

卷丹(LiliumlancifoliumThunb.，2n=3x=36)又名宜興百合、虎皮百合，是百合屬(LiliumL.)多年生球根類植物，在中國分布范圍極廣[1]。作為自然存在的三倍體，卷丹不僅食藥用價值高，還是重要的花卉之一，深受廣大消費者喜愛。湖南龍山、江蘇宜興和安徽霍山是中國卷丹的主產(chǎn)區(qū)[1-2]。在重慶地區(qū)海拔1000m左右山地生長廣泛，具有獨特的地理和氣候條件，近年來，在重慶南川、黔江和秀山等區(qū)縣大面積引種湖南卷丹，種植面積已達0.16萬hm2，年產(chǎn)量約3萬t，初步形成產(chǎn)業(yè)規(guī)模。然而，卷丹在栽培過程中多采用無性繁殖，造成病毒不斷累積，使植株發(fā)生病毒病，嚴重危害其產(chǎn)量和品質(zhì)。目前已報道侵染百合的病毒達19種以上，其中最主要的病毒為百合斑駁病毒(Lilymottlevirus, LMoV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)和百合無癥病毒(Lilysymptomlessvirus, LSV)[3-4]等。這3種病毒通常以其中2種或3種同時侵染百合植株，給百合生產(chǎn)造成嚴重問題[5-7]。利用化學藥劑或生物制劑難以對病毒病進行有效防治，直接利用百合脫毒苗已成為控制病毒病的重要措施[4, 8-9]。因此，建立一種針對卷丹的脫毒快繁技術，對其產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

目前百合脫毒技術主要以百合微莖尖培養(yǎng)為主，并結(jié)合其他處理方式。王超等[10]通過對5種百合脫毒研究發(fā)現(xiàn)，即使以0.3～0.5mm 最適脫毒長度的莖尖進行培養(yǎng)，CMV脫毒率不足65%，而LSV不足50%，且成活率為57.62%。高慧卿等[11]將百合組培苗65℃高溫預處理30min后，剝?nèi)?.2～0.5mm莖尖進行脫毒培養(yǎng)，CMV和LSV的脫毒率分別為46.88%和74.65%，但平均成活率不到60%。孫明偉等[12]研究發(fā)現(xiàn)剝?nèi)?.4～0.7mm莖尖進行培養(yǎng)，脫毒率為61%，存活率達76%。周曉波等[13]將卷丹珠芽置于38℃高溫條件處理20d后，剝?nèi)?.4～0.6mm莖尖，接種在添加5～10mg/L病毒唑的芽誘導培養(yǎng)基中，脫毒率可達90%，但成活率僅為60%左右。上述方法中剝離的莖尖均小于0.8mm，莖尖不易剝?nèi)?，需要借助解剖鏡等儀器設備，操作復雜，易污染且再生率低。

病毒易于通過維管系統(tǒng)移動，而莖尖維管系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，通常剝?nèi)∏o尖越小，其脫毒率越高，但成苗率越低；反之，其成活率雖然提高，但脫毒率較低。因此，克服兩者的矛盾，便可以打破百合脫毒生產(chǎn)的瓶頸，如此既提高莖尖再生率，又提高脫毒率。本研究以含病毒的湖南卷丹珠芽為材料，通過高低溫交替處理結(jié)合2次莖尖培養(yǎng) (1.0～1.5mm)，運用RT-PCR方法對脫毒效果進行檢測，構建一種操作簡便、高效的卷丹脫毒快繁方法。研究結(jié)果將促進百合脫毒育苗工作的推廣應用，為重慶地區(qū)卷丹產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為優(yōu)質(zhì)卷丹種球，引自湖南郴州。種植于重慶市南川區(qū)三泉鎮(zhèn)，采集種植2 a后的卷丹珠芽備用。

1.2 脫毒試驗方法

1.2.1 病毒引物設計 百合常見病毒CMV、LMoV、LSV和百合X病毒(Lily virus X，LVX)檢測引物參照陳進等[14]的引物序列。引物由華大基因重慶分公司合成。

1.2.2 病毒PCR檢測 以引種2 a后發(fā)生分球的卷丹珠芽或經(jīng)過脫毒的組培苗為材料，利用植物RNA小量提取試劑盒(R4151, TIANGEN)提取總RNA，經(jīng)過電泳檢測，采用植物cDNA快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒(KR116, TIANGEN)合成第一鏈cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應包括總RNA 2 μg，5×g DNA Buffer 2 μL，RNase-Free ddH2O 補至10 μL，42 ℃孵育5 min，冰上放置；然后添加10×King RT Buffer 2 μL，F(xiàn)astKing RT Enzyme Mix 1 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O 5 μL，反應程序為42 ℃孵育30 min， 70 ℃滅活5 min。PCR反應選用大連寶生物公司產(chǎn)品(RR001, TAKARA)，PCR反應總體積為20 μL，包括：第一鏈cDNA 1 μL，10×Buffer(含20 mmol/L Mg2+)2 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L正反向引物各0.5 μL，5 U/μLTaqDNA聚合酶0.2 μL，13.8 μL ddH2O。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共38個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min；12 ℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物進行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，利用BioRad凝膠成像儀分析結(jié)果。

1.2.3 高低溫交替處理 以病毒檢測陽性的卷丹珠芽為材料，在自來水下沖洗珠芽表面污垢，用洗衣粉泡10 min，并沖洗1～2 h，晾干。將處理好的珠芽置于4 ℃低溫處理3～4 d，之后再置于38 ℃高溫處理3～4 d，如此交替處理持續(xù)24～ 32 d。期間光照度為6 000～ 7 000 lx，光照時間為12 h/d，噴灑38 ℃無菌水保持珠芽濕度。

1.2.4 第一次莖尖培養(yǎng) 將經(jīng)過高低溫交替處理的珠芽剝?nèi)プ钔鈱樱孟匆路叟?0 min，并在流水下沖洗1～2 h，置于無菌操作臺紫外照射15 min，用75%乙醇浸泡40 s，0.2%升汞溶液處理12 min，再用無菌水沖洗3～5遍。用滅菌濾紙吸干水分，利用解剖刀、鑷子和解剖針剝?nèi)? mm左右(<1.5 mm)的莖尖，以1瓶1顆的規(guī)格接種于MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+10 mg/L病毒唑的固體培養(yǎng)基(不含蔗糖)中暗培養(yǎng)7 d，然后轉(zhuǎn)入溫度為(25±2) ℃，光照度6 000～ 7 000 lx，12 h/d光照環(huán)境培養(yǎng)60 d，隨機選取50個樣本進行病毒檢測并統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.5 第二次莖尖培養(yǎng) 將經(jīng)過1次莖尖培養(yǎng)誘導的不定芽繼續(xù)剝?nèi)? mm左右(<1.5 mm)莖尖，以1瓶3顆的規(guī)格接種于固體MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+10 mg/L病毒 唑+30 g/L蔗糖的培養(yǎng)基暗培養(yǎng)7 d，然后轉(zhuǎn)入(25±2) ℃、光照度6 000～7 000 lx和12 h/d光照環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)60 d。隨機選取50個樣本進行脫毒檢測，并統(tǒng)計結(jié)果。

1.3 脫毒苗快繁方法

1.3.1 鱗片不同部位的芽分化培養(yǎng)基篩選 將脫毒苗外層鱗片橫切為上下兩部分，將上部分、下部分和整塊鱗片分別接種于含不同質(zhì)量濃度 6-BA(0.5、1、1.5、2 mg/L)和NAA(0.05、0.2 mg/L)配比的MS基本培養(yǎng)基中，每瓶放3個，每個質(zhì)量濃度梯度接種10瓶。培養(yǎng)條件為溫度 (25±2) ℃，濕度60%～70%環(huán)境下暗培養(yǎng)7 d，轉(zhuǎn)至光照度6 000～7 000 lx，光照時間12～14 h/d的環(huán)境中培養(yǎng)45～60 d。統(tǒng)計鱗片不同部位的出芽總數(shù)、出芽率和出芽系數(shù)等。

1.3.2 增殖培養(yǎng)基篩選及生根培養(yǎng) 將誘導出的不定芽接種到含0.3 mg/L NAA和不同質(zhì)量濃度6-BA(0.5、1.5、2.5 mg/L)的MS或1/2MS培養(yǎng)基，每瓶培養(yǎng)基放5個，每個質(zhì)量濃度梯度接種10瓶。培養(yǎng)條件為溫度(25±2) ℃、濕度 60%～70%，光照度為6 000～7 000 lx、12～14 h/d。培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計不定芽總數(shù)和增殖系數(shù)。將不定芽接種于含不同蔗糖質(zhì)量濃度(0～100 g/L)的MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基培養(yǎng)，直至生根，統(tǒng)計生根情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Excel 2013和SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用Duncan’s法進行差異顯著性檢驗 (P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 珠芽獲取與含病毒檢測

從湖南郴州引種的卷丹在重慶南川區(qū)種植 2 a后種球發(fā)生明顯退化，表現(xiàn)為3～6個球的分球現(xiàn)象，同時地上部分植株表現(xiàn)出病毒癥狀，如花瓣扭曲，子房和花柱畸形等(圖1)。收集退化植株珠芽材料，以正常卷丹珠芽為對照，通過反轉(zhuǎn)錄RT-PCR對百合病毒CMV、LSV、LMoV和LVX進行檢測。結(jié)果(表1)表明，正常卷丹珠芽中未檢出百合病毒，而退化珠芽中主要含LSV和LMoV病毒，其中LSV檢出率為66.7%，LMoV檢出率為46.2%，混合帶毒率為46.2%，未檢出CMV和LVX病毒。說明重慶南川區(qū)引種卷丹主要感染病毒為LSV和LMoV病毒。

A.正常卷丹花部形態(tài);B.退化卷丹花部畸形

表1 卷丹珠芽病毒檢出率Table 1 Detection rate of virus in bulbils of L.lancifolium

2.2 一次莖尖培養(yǎng)脫毒效果

將卷丹珠芽通過紫外滅菌和表面消毒劑處理后，剝?nèi)? mm左右(<1.5 mm)莖尖生長點接種于含病毒唑的芽分化培養(yǎng)基，15 d后發(fā)現(xiàn)，莖尖開始膨大變綠，30 d后莖尖開始生成小苗。統(tǒng)計結(jié)果表明(表2)，1 mm左右(<1.5 mm)珠芽莖尖生長點成苗率平均為90.28%。隨機選取50個脫毒幼苗，通過RT-PCR分析表明(圖2-A和圖2-B)，LSV和LMoV病毒均被部分脫除，LSV脫毒率為52%，而LMoV脫毒率為44%(表3)。綜上所述，剝?nèi)? mm左右(<1.5 mm)莖尖培養(yǎng)，雖然成苗率較高但脫毒效果較差。1次莖尖培養(yǎng)脫毒苗需再次脫毒，以達到較為理想的脫毒效果。

表2 1.0～1.5 mm莖尖成苗率Table 2 Survival rate of 1.0-1.5 mm shoot tip

A.第一次莖尖培養(yǎng)后LSV脫毒驗證電泳圖。M.DNA 分子標記; 1～12.LSV驗證結(jié)果;B.第1次莖尖培養(yǎng)后LMoV脫毒驗證電泳圖。M.DNA 分子標記; 1～12.LMoV驗證結(jié)果；C.第二次莖尖培養(yǎng)后LSV脫毒驗證電泳圖。M.DNA 分子標記; 1～12.LSV驗證結(jié)果。D.第二次莖尖培養(yǎng)后LMoV脫毒驗證電泳圖。M.DNA 分子標記; 1～12.LMoV驗證結(jié)果

表3 莖尖培養(yǎng)脫毒率Table 3 Detoxification rate of shoot tip culture

2.3 2次莖尖培養(yǎng)脫毒效果

以1次莖尖培養(yǎng)60 d幼苗為材料，繼續(xù)剝?nèi)? mm左右(<1.5 mm)莖尖生長點接種于含病毒唑的芽分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)直至獲得脫毒幼苗。結(jié)果表明(表2)，1 mm左右(<1.5 mm)小鱗莖莖尖繼代的成苗率平均為90.68%，且污染幼苗數(shù)明顯低于第一次珠芽莖尖污染幼苗數(shù)。隨機選取50個脫毒幼苗，通過RT-PCR分析表明(圖2-C和圖2-D)，LSV病毒和LMoV病毒絕大部分已被脫除。統(tǒng)計結(jié)果顯示(表3)，LSV脫毒率為88%，而LMoV脫毒率為86%，相比第一次莖尖脫毒培養(yǎng)，脫毒效果提高了將近1倍。

2.4 脫毒苗的組培快繁

2.4.1 不定芽誘導培養(yǎng) 將經(jīng)過2次莖尖脫毒培養(yǎng)的外層小鱗片，用刀片從1/2處將其分為上、下兩部分，轉(zhuǎn)接到含不同激素濃度配比的芽分化培養(yǎng)基中，45 d時統(tǒng)計各處理叢生芽生長情況(圖3)。結(jié)果表明(表4)，不同激素含量對外層鱗片上部的誘導有顯著差異，其中A2、A5的誘導率為24.45%和23.33%，而A4、A6均超過40%，A6誘導率最高，達47.78%。A4誘導的不定芽最多，誘導系數(shù)為2.88。激素對下部外層鱗片的誘導結(jié)果顯示(表5)，A6的芽誘導率最高，達到91.11%，而A1芽誘導率最低，為64.45%。誘導效果最好為A4，不僅誘導率達85.56%，且誘導系數(shù)為最高，為6.35。與上部分鱗片誘導結(jié)果相比，下部分鱗片誘導效果明顯更優(yōu)。激素對整瓣鱗片不定芽誘導結(jié)果如表6，誘導效果最佳的仍是A4，不定芽誘導率為87.78%，誘導系數(shù)為 3.70；較差為A2和A6配比，A2的芽誘導率最低，為57.78%，而A6的芽誘導系數(shù)最低，為 1.95。因此，下部鱗片受激素誘導不定芽效果最佳，其次是整瓣鱗片，最差為上部鱗片。

2.4.2 增殖繼代培養(yǎng)及生根誘導 將外層鱗片誘導的叢生芽，切分成單個芽體，轉(zhuǎn)接到不同培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)15 d后開始出現(xiàn)分化小芽，30 d分化的小芽鱗片逐漸增多、增大，分化芽的數(shù)量也增多(圖3-g)，其中B4、B5、B6在培養(yǎng)30 d

a-d: 一次莖尖脫毒培養(yǎng).a.高低溫交替處理后的珠芽; b.1.0～1.5 mm莖尖培養(yǎng); c.培養(yǎng)30 d莖尖; d.培養(yǎng)60 d莖尖.e-f: 鱗片的快繁體系.e.下部鱗片誘導培養(yǎng); f.45～60 d叢生不定芽; g.不定芽增值繼代30 d; h.生根培養(yǎng)45 d

表4 激素對上部鱗片不定芽的誘導Table 4 Induction of adventitious buds in upper part of scales by phytohormones

表5 激素對下部鱗片不定芽的誘導Table 5 Induction of adventitious buds in lower part of scales by phytohormones

表6 激素對整瓣鱗片不定芽的誘導Table 6 Induction of adventitious buds in whole scales by phytohormones

時已出根。結(jié)果顯示(表7)，B1、B2、B3增殖效果明顯優(yōu)于B4、B5、B6，說明1/2MS培養(yǎng)基不利于芽增殖分化，但能促進根提前形成。在NAA濃度一致時，高質(zhì)量濃度6-BA促進不定芽增殖，其中B3(MS+NAA 0.3 mg/L+6-BA 2.5 mg/L+蔗糖30 g/L)增值倍數(shù)最大，增殖系數(shù)為3.39。將增殖無菌苗鱗片接種到含不同蔗糖濃度的生根培養(yǎng)基，結(jié)果表明(表8)，在C3(含50 g/L蔗糖)中效果最優(yōu)，培養(yǎng)20 d開始出現(xiàn)生根，45 d后生根率達到98.72%(圖3-h)。

3 討 論

卷丹是重慶地區(qū)百合主栽品種，種植卷丹已成為不少區(qū)縣脫貧致富的重要經(jīng)濟手段。由于卷丹栽培方式多為無性自繁且技術含量不高，使引種的優(yōu)良種球在種植2～3 a后發(fā)生明顯退化現(xiàn)象。研究表明，病毒病是影響卷丹生產(chǎn)的瓶頸問題[13,15-17]。為促進重慶地區(qū)扶貧和卷丹產(chǎn)業(yè)發(fā)展，課題組于2015年和2016年先后從湖南引進優(yōu)良的卷丹種球進行栽培。通過RT-PCR分析表明，在重慶南川區(qū)引種的卷丹主要感染LSV和LMoV，導致其鱗莖和花部品質(zhì)下降。前人研究發(fā)現(xiàn)CMV、LMoV和LSV 3種病毒往往以其中2種或2種以上同時侵染百合，并且以CMV和LSV或者LMoV和LSV為常見[18-20]，本研究發(fā)現(xiàn)與后者相似。對退化卷丹的病毒檢測分析表明，LSV病毒的檢出率(66.7%)明顯高于LMoV病毒(46.2%)，并且所有檢出LMoV病毒的卷丹中均能檢測到LSV病毒，因此推測正常卷丹在被LSV感染后，被其他病毒(如LMoV)感染的機率會顯著增加。在實際生產(chǎn)中，非專業(yè)技術人員很難掌握傳統(tǒng)剝?nèi)?.3～0.5 mm最適莖尖技術。因此，基于應用為主要目的，構建一套操作簡便且脫毒效果優(yōu)良的百合脫毒技術顯得非常緊迫。

表7 激素和培養(yǎng)基對不定芽的增殖效果Table 7 Proliferation respone of phytohormone and media to adventitious bud

表8 蔗糖對生根的誘導Table 8 Response of sucrose content to rooting induction

在第一次莖尖脫毒培養(yǎng)中，盡管選擇最優(yōu)消毒方案[1]，但莖尖污染率仍然偏高，平均為 23.33%，推測可能珠芽中含有部分內(nèi)生真菌。在2次莖尖脫毒培養(yǎng)中，以無菌組培苗為材料，污染率顯著降低，平均為10.83%。從脫毒效果來看，1次珠芽莖尖脫毒培養(yǎng)，LSV脫毒率(52%)高于LMoV脫毒率(44%)。而經(jīng)過2次莖尖脫毒培養(yǎng)后，兩者的脫毒效果相當，均高于85%。經(jīng)過2次莖尖脫毒培養(yǎng)后，脫毒效果均大幅度提升，與鄭麗娜等[21]發(fā)現(xiàn)單純通過莖尖培養(yǎng)，2次莖尖培養(yǎng)比1次莖尖培養(yǎng)脫毒效果更好的結(jié)論一致。與利用小于0.8 mm的莖尖脫毒相比[14, 22]，本研究利用高低溫交叉處理結(jié)合2次剝?nèi)? mm左右 (<1.5 mm)莖尖脫毒培養(yǎng)，獲得了理想的脫毒效果(脫毒率> 85%)。該方法打破了一般認為莖尖大于1.0 mm達不到脫毒效果的認識，為百合脫毒方法的改進提供了新的思路。經(jīng)過2次莖尖脫毒處理，雖然耗時長，但剝?nèi)∏o尖可在肉眼下直接操作，降低設備需求及操作技能，降低污染率；同時選擇較大莖尖，明顯提高莖尖存活率(未污染的莖尖存活率達90%)。該方法有利于卷丹脫毒苗的工廠化生產(chǎn)，由于試驗只針對LSV、LMoV 2種病毒進行測試，其他病毒是否也能達到相同效果有待研究。

卷丹的組培快繁主要以種球鱗片、珠芽鱗片或小鱗莖為材料[1,15,23-24]。本研究嘗試以無菌小鱗莖外層鱗片為材料，通過比較不同部位不定芽誘導效果發(fā)現(xiàn)：下部鱗片>整瓣鱗片>上部鱗片，其中，下部鱗片不定芽誘導系數(shù)可達6.35，與付娜等[25]發(fā)現(xiàn)百合單瓣珠芽基部在組培時不定芽誘導數(shù)最多的結(jié)果一致。本試驗發(fā)現(xiàn)，上部鱗片誘導產(chǎn)生不定芽主要位于橫切傷口處，其余位置并未有不定芽產(chǎn)生，表明影響鱗片誘導的因素除激素配比外，還包含切口位置及大小。下部鱗片誘導出的不定芽除了在切口處，其周邊都有不定芽產(chǎn)生。這可能是下部鱗片產(chǎn)生更多不定芽的原因。在以整瓣鱗片為外植體的誘導過程中，不定芽的發(fā)生位點也主要位于基部。另外，本研究獲得不定芽的增殖隨著6-BA質(zhì)量濃度升高而隨之增加，最優(yōu)增殖培養(yǎng)基為MS+2.5 mg/L 6-BA+ 0.3 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，增殖倍數(shù)達 3.39，與周曉波等[15]的研究結(jié)果相似，高質(zhì)量濃度6-BA有利于不定芽發(fā)生。在生根培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，卷丹在常規(guī)繼代培養(yǎng)基只要添加一定量的(30～100 g/L)蔗糖便可以生根，但是在50 g/L時生根效果最佳。如果低于30 g/L或者不添加蔗糖，生根率就很低，這與前人的研究有所不同[15,26]，前期結(jié)果主要強調(diào)NAA和活性炭對百合生根的影響，而本試驗首次發(fā)現(xiàn)C源對卷丹生根具有重要作用。另外，減少大量元素(如利用1/2MS代替MS培養(yǎng)基)促進根的提前形成。

4 結(jié) 論

在重慶南川區(qū)引種的湖南卷丹主要感染病毒為百合斑駁病毒(LMoV)和百合無癥病毒(LSV)。以卷丹珠芽為材料，通過高溫(38 ℃)和低溫(4 ℃)的交替處理，結(jié)合2次莖尖脫毒培養(yǎng)能有效去除百合LSV和LMoV病毒，脫毒率超過85%以上；剝?nèi)〉那o尖長度為1.0～1.5 mm，對儀器要求不高、容易操作，且莖尖更容易存活，存活率達90%。進一步利用無毒幼苗的外層鱗片下部進行組培快繁，提高了不定芽誘導系數(shù)和增殖系數(shù)，最佳芽誘導培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，芽誘導系數(shù)為6.35，最佳芽增殖培養(yǎng)基為MS+ 2.5 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L NAA + 30 g/L蔗糖，增殖系數(shù)為3.39。鱗片在含50 g/L蔗糖的生根培養(yǎng)基中誘導效果最優(yōu)，生根率為98.72%。本研究獲取大量優(yōu)質(zhì)脫毒幼苗，方法簡便、高效，為重慶地區(qū)卷丹產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定基礎。