耐高溫釀酒酵母菌的篩選及發(fā)酵性能研究

劉 輝 ，何太波，趙國(guó)淼，張永昌，王小艷，李 凡，佟 毅

（1.中糧生化能源（肇東）有限公司，黑龍江肇東 151100；2.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209；3.吉林中糧生化有限公司，吉林長(zhǎng)春 130033）

生物燃料乙醇是指未添加變性劑，以生物質(zhì)為原料生產(chǎn)的可作為燃料用的乙醇，純度99.5 %，屬于環(huán)保型可再生清潔能源。近年來(lái)，隨著全球環(huán)境的惡化及化石能源的日益枯竭，越來(lái)越多的國(guó)家開(kāi)始關(guān)注可再生清潔能源燃料乙醇的開(kāi)發(fā)和利用[1-4]]。燃料乙醇通常采用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）發(fā)酵，釀酒酵母最適生長(zhǎng)溫度為30～32 ℃[5]。然而，在工業(yè)生產(chǎn)中隨著菌株生產(chǎn)過(guò)程中的代謝、機(jī)械攪拌等常導(dǎo)致發(fā)酵體系溫度升高（時(shí)?？蛇_(dá)35～37 ℃）[6-8]。高溫通常會(huì)引起酵母細(xì)胞內(nèi)各種成分的理化性質(zhì)發(fā)生變化，影響細(xì)胞本身正常的生命活動(dòng)。高溫脅迫使得菌株的生產(chǎn)性能大幅下降，溫度越高越容易引起酵母早衰、死亡。然而目前工業(yè)生產(chǎn)中一般采用一次水及冷凍水循環(huán)對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行控溫，受季節(jié)環(huán)境溫度變化的影響，很難實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定控溫，不僅導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加，還增加了染菌的風(fēng)險(xiǎn)。而耐高溫釀酒酵母的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用可實(shí)現(xiàn)在較為寬泛的控溫前提下保證燃料乙醇生產(chǎn)的穩(wěn)定性，避免這部分經(jīng)濟(jì)損失[9]。

在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，微生物細(xì)胞的生化反應(yīng)和代謝途徑發(fā)生改變，形成了對(duì)發(fā)酵微環(huán)境的適應(yīng)性[10]。對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境條件變化的適應(yīng)能力，以及能夠隨著外界環(huán)境的變化迅速產(chǎn)生變異，為耐高溫酵母的選育提供了基礎(chǔ)。田沈等[11]對(duì)1株耐高溫麥芽糖假絲酵母（Candida maltosa）進(jìn)行高溫馴化，馴化后的菌株在46 ℃條件下同步糖化發(fā)酵，乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到13.93 g/L，使乙醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到理論值的88.2 %。徐大鵬等[12]篩選得到1 株在41 ℃可以良好生長(zhǎng)的耐高溫酵母菌，在41 ℃下發(fā)酵24 h，得到44.0 g/L 的乙醇，理論產(chǎn)率的93.0%。Kwon 等[13]在42 ℃條件下發(fā)酵甜高粱稈，乙醇得率為90.9 %。劉秀穎等[14]通過(guò)誘變和重組方法獲得的釀酒酵母突變株在40 ℃和43 ℃發(fā)酵時(shí)，乙醇產(chǎn)量分別達(dá)到91.2 g/L 和69.2 g/L。Dhaliwal 等[15]篩選到1 株耐高溫的東方伊薩酵母（Issatchenkio orientalis，Io），在40 ℃條件下以甘蔗汁作為培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到71.9 g/L。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)ARTP 誘變和溫度馴化，篩選出在高溫條件下具有較強(qiáng)發(fā)酵性能的釀酒酵母菌株，并對(duì)菌株的耐溫性和產(chǎn)乙醇能力進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：釀酒酵母為市售釀酒酵母，該酵母最適生長(zhǎng)溫度為32 ℃。

主要試劑：酵母粉，Oxoid 公司；蛋白胨，Oxoid公司；氯化鈉，北京化工廠；瓊脂，Amresco 公司；瓊脂糖，西班牙（上海分裝）；冰醋酸，北京化工廠；山梨醇，Amresco公司；Tris，Sigma公司。

YPD固體培養(yǎng)基：用于釀酒酵母和畢赤酵母的活化、培養(yǎng)及菌種保存，含有1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，2 %葡萄糖，15 %瓊脂，121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 ARTP誘變與篩選

1.2.1 釀酒酵母生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將活化好的菌液以5 %的接種量接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，在28 ℃下培養(yǎng)，每間隔2 h 取1 次樣，測(cè)量OD600nm吸光值，根據(jù)吸光值繪制生長(zhǎng)曲線，確定酵母的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。

1.2.2 ARTP誘變實(shí)驗(yàn)

將釀酒酵母發(fā)酵液稀釋107倍，取100 μL 涂布YPD 固體平板，待長(zhǎng)出單菌落后，挑取單菌落接種至YPD 液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min 進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600值為1.0～1.5，10%轉(zhuǎn)接并培養(yǎng)5 h左右，以0.1 %的轉(zhuǎn)接量用無(wú)菌生理鹽水稀釋并制備懸液。

設(shè)置多功能等離子體誘變系統(tǒng)，以氮?dú)庾鳛榈入x子體的工作氣體，設(shè)置電源功率300 W，平臺(tái)高度14 mm，等離子體的溫度＜35 ℃，濕度＞10 %，氣體流量12 slpm，分別將制備的50 μL菌懸液滴于無(wú)菌金屬槽內(nèi)中心位置進(jìn)行等離子體照射，處理時(shí)間分別為20 s、70 s、120 s、170 s、220 s、270 s、320 s、370 s、420 s。誘變處理完成后以無(wú)菌生理鹽水對(duì)處理完的菌懸液進(jìn)行梯度稀釋，涂布于YPD 固體平板，將平板分別放置于不同溫度的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將誘變后生長(zhǎng)及發(fā)酵性能較好的菌株接種液化醪，37 ℃搖瓶發(fā)酵。

1.3 發(fā)酵驗(yàn)證

取生產(chǎn)系統(tǒng)液化醪，對(duì)ARTP 誘變篩選出的釀酒酵母進(jìn)一步調(diào)整溫度進(jìn)行工業(yè)物料小試驗(yàn)證。工藝條件：生產(chǎn)系統(tǒng)液化醪為底物，對(duì)照菌株（目前液體燃料乙醇工業(yè)生產(chǎn)菌株）干粉35 ℃活化后添加，ARTP 誘變篩選出的S.C HR 接種于種子培養(yǎng)基（YPD液體培養(yǎng)基）中，經(jīng)過(guò)二級(jí)培養(yǎng)達(dá)到一定的酵母數(shù)，按0.125 億/mL液化醪計(jì)算用量，離心、水洗1次，用生理鹽水懸浮至2 mL，在1 L 搖瓶中加入350 g 液化醪中。發(fā)酵過(guò)程測(cè)試菌株試驗(yàn)組均進(jìn)行溫度調(diào)整（0～16 h、32 ℃，17 h、33 ℃，18 h、34 ℃，19～72 h、35 ℃），并加入對(duì)照菌株的空白試驗(yàn)組（不調(diào)整溫度，一直控溫32 ℃）進(jìn)行對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

對(duì)菌株進(jìn)行ARTP 誘變時(shí)，一般選取對(duì)數(shù)中后期的菌株，此時(shí)菌株代謝活性高、繁殖旺盛，易發(fā)生突變且重復(fù)性好[16]。出發(fā)菌株在種子液培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線如圖1 所示，將酵母菌接入種子液培養(yǎng)基中，前4 h 酵母菌處于遲緩期，微生物的代謝系統(tǒng)需要適應(yīng)新環(huán)境，因此數(shù)目增長(zhǎng)緩慢[17]。在4～12 h 酵母菌數(shù)量增長(zhǎng)迅速，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在14 h 后酵母菌進(jìn)入穩(wěn)定期，因此本試驗(yàn)選擇在10 h 時(shí)對(duì)酵母菌進(jìn)行誘變?cè)囼?yàn)。

2.2 ARTP誘變結(jié)果

誘變處理劑量和時(shí)間影響致死率和突變效率，一般認(rèn)為出發(fā)菌株穩(wěn)定時(shí)，即當(dāng)致死率在80 %左右時(shí)，有較高的正突變率[15-16]，因此試驗(yàn)選擇處理時(shí)間為240 s，致死率為80 %的誘變菌株。對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行ARTP 誘變處理，并繪制致死率曲線（圖2）。第一輪誘變當(dāng)照射時(shí)間為240 s 時(shí)，致死率為80%左右，篩選到正向突變菌株的可能性最大，選擇240 s 為誘變時(shí)間。誘變處理完成后以無(wú)菌生理鹽水對(duì)處理完的菌懸液進(jìn)行梯度稀釋，涂布于YPD固體平板，將平板分別放置于40 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，篩選出誘變后生長(zhǎng)及發(fā)酵性能較好的7個(gè)突變菌株。

2.3 搖瓶驗(yàn)證

對(duì)篩選出的7 個(gè)菌株進(jìn)行液化醪搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證。使用生產(chǎn)系統(tǒng)液化醪，37 ℃搖瓶發(fā)酵72 h 驗(yàn)證結(jié)果。7個(gè)菌株37 ℃搖瓶發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，其中HR-B19（命名為S.C HR）乙醇產(chǎn)量均顯著高于對(duì)照菌株，葡萄糖殘留、殘還原糖、殘總糖、乙醇/甘油均優(yōu)于對(duì)照菌株。

表1 37 ℃發(fā)酵成熟醪HPLC檢測(cè)結(jié)果 (g/L)

2.4 工業(yè)物料小試驗(yàn)證

取生產(chǎn)系統(tǒng)液化醪為發(fā)酵底物，對(duì)ARTP 誘變篩選出的耐高溫釀酒酵母S.C HR 進(jìn)行發(fā)酵小試驗(yàn)證。以市售釀酒酵母菌株，發(fā)酵過(guò)程不調(diào)整溫度為對(duì)照組，分為控溫（32 ℃）和溫度調(diào)整（溫度調(diào)整規(guī)律：0～16 h、32 ℃，17 h、33 ℃，18 h、34 ℃，19～72 h、35 ℃）；S.C HR（溫度調(diào)整）為ARTP 誘變篩選菌株，溫度調(diào)整規(guī)律：0～16 h、32 ℃，17 h、33 ℃，18 h、34 ℃，19～72 h。發(fā)酵成熟醪酒精度如圖3 所示，在不控溫的高溫情況下（35～37 ℃），工業(yè)物料小試驗(yàn)證其同步糖化發(fā)酵完成后，S.C HR 乙醇產(chǎn)量為15.03%vol，較出發(fā)菌株提升了0.21%vol，殘總糖2.38 g/100 mL，較出發(fā)菌株降低了0.05 g/100 mL。發(fā)酵產(chǎn)物HPLC 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，菌株S.C HR 在高溫下的發(fā)酵各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到對(duì)照菌株正?？販貤l件下的發(fā)酵性能。

3 結(jié)論

表2 S.C HR菌株與對(duì)照菌株發(fā)酵HPLC數(shù)據(jù)(g/100 mL)

與傳統(tǒng)的誘變方法相比，ARTP 誘變對(duì)生物的遺傳物質(zhì)的損傷機(jī)制豐富，突變率高，并易獲得遺傳穩(wěn)定性良好的突變株，是非常有效的真核生物誘變方法[18]。在本研究中，以市售釀酒酵母為出發(fā)菌株，通過(guò)ARTP 誘變、高溫篩選和搖瓶驗(yàn)證，最終篩選到1 株釀酒酵母S.C HR。工業(yè)物料小試驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高溫發(fā)酵條件下（35～37 ℃），S.C HR 乙醇產(chǎn)量為15.03%vol，較出發(fā)菌株提升0.21%vol，殘總糖2.38 g/100 mL，較出發(fā)菌株降低0.05 g/100 mL。殘總糖是酒精發(fā)酵后未被發(fā)酵而殘余的糖分，殘?zhí)歉叩褪呛饬烤凭l(fā)酵完全程度的重要指標(biāo)之一[19]。殘?zhí)瞧咭馕吨欠植荒苡行У剞D(zhuǎn)化為酒精，產(chǎn)酒率偏低，造成原料的損失，控制殘?zhí)撬绞蔷凭髽I(yè)提高出酒率和經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵。菌株S.C.HR 在高溫下的發(fā)酵各項(xiàng)指標(biāo)（殘總糖、殘還原糖、酒精度）均達(dá)到與對(duì)照菌株正常控溫條件下的發(fā)酵性能，葡萄糖殘留、殘總糖、乙醇/甘油均優(yōu)于對(duì)照菌株。該菌株可在高溫條件下（35～37 ℃）保證乙醇生產(chǎn)的穩(wěn)定性，提高乙醇生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，適合于工業(yè)乙醇的大規(guī)模生產(chǎn)。