飲用酒和食用酒精暴露誘導(dǎo)小鼠肝臟組織的損傷效應(yīng)

魏夢嬌，姚高毅，郭 琳

（1.山西大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院環(huán)境與健康研究中心，山西太原 030006；2.山西杏花村汾酒廠股份有限公司技術(shù)中心，山西汾陽 032205）

隨著我國嗜酒人數(shù)的逐年增加，酒精性肝病也呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，成為僅次于甲肝乙肝等病毒性肝病的第二大肝臟疾病[1]。據(jù)估計(jì)，每年因?yàn)E用酒精死亡的人數(shù)大約有250 萬人，其中大部分人死于酒精性肝?。ˋLD）[2]。作為酒精的主要代謝器官，肝臟的毒性作用相較于其他臟器更為明顯。脂肪性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌，都是典型的酒精性肝病[3]。有文獻(xiàn)表明，幾乎所有長期暴露于酒精的個(gè)體都會發(fā)展為脂肪肝，約有25 %會發(fā)展成為肝硬化[4-5]。

已有的實(shí)驗(yàn)研究表明，食用酒精會引起嚙齒類動物肝臟損傷[6-8]。如劉暢等[9]實(shí)驗(yàn)證明,食用酒精可以誘導(dǎo)小鼠肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)上升以及炎性細(xì)胞浸潤等肝臟損傷；董金材等[10]證明，食用酒精也會引起小鼠肝細(xì)胞氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化；管文婕等[11]證明，食用酒精可誘導(dǎo)肝臟脂肪變性及肝纖維化。然而關(guān)于比較飲用酒和食用酒精誘導(dǎo)小鼠肝臟組織損傷的分子機(jī)制研究卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)借助小鼠灌胃模型，在氧化應(yīng)激、自噬效應(yīng)和細(xì)胞凋亡等方面來比較飲用酒和食用酒精暴露對小鼠肝臟組織的毒性效應(yīng)，探究可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

試驗(yàn)樣：市售42%vol 飲用酒。42.0%vol 食用酒精。

實(shí)驗(yàn)動物：SPF 級雄性的C57BL/6J 小鼠30 只，體重（20±2）g，從北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司購入。

試劑及耗材：SDS-PAGE 電泳及相關(guān)蛋白裂解液試劑均購自Amresco 公司；牛血清蛋白（BSA）購自Invitrogen 公司；考馬斯亮藍(lán)（G-250）購自Sigma 公司；一抗β-actin 購自Cell Signaling Technology 公司，二抗Bcl-2，Bax，P53，Beclin-1，LC3B 均購自北京博奧森公司；ROS 檢測試劑盒（Item Number S0033）購自碧云天公司；MDA、SOD 檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

儀器設(shè)備：高速低溫離心機(jī)、低溫冰箱及多功能酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司；凝膠成像系統(tǒng)和垂直電泳槽，美國BIO-RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理

30 只雄性的C57BL/6J 小鼠隨機(jī)分為3 組：對照組、飲用酒處理組和食用酒精處理組，每組10只。將小鼠飼養(yǎng)在溫度為（24±2）℃、相對濕度50%～55%的房間中，光照、黑暗周期為12 h，動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨意飲用自來水。通過灌胃[12]分別一次性灌服0.5 mL 的蒸餾水，飲用酒樣以及42.0%vol 的食用酒精。每周一次，連續(xù)灌服5 周后處死小鼠，迅速解剖取小鼠的肝臟組織，放于液氮中快速冰凍，隨后轉(zhuǎn)至-80 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Western Blot分析

取30 mg 肝臟組織樣品，加入500 μL 裂解液，在勻漿機(jī)上進(jìn)行充分勻漿。勻漿完成后冰上孵育20 min。然后在13000 r/min，4 ℃的條件下對樣品離心15 min，離心完成后取上清液，用考馬斯亮藍(lán)法測定其蛋白濃度。將其進(jìn)行等量分裝，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μg 蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的牛血清蛋白（BSA）封閉1 h后，加入一定比例一抗（β-actin：1∶1000，Bax、Bcl-2、P53、LC3B、Beclin-1：1∶500），在4 ℃條件下?lián)u床孵育過夜。用PBS 洗膜3 次，每次10 min，結(jié)束后用熒光標(biāo)記的第二抗體（1∶5000）孵育2 h，孵育完成后，清洗二抗。用LI-COR Odyssey 近紅外雙色激光成像系統(tǒng)掃膜分析，并用IPwin32 軟件處理分析目標(biāo)條帶的光密度值。最終結(jié)果用目的蛋白與βactin的光密度比值來表示。

1.2.3 活性氧及其相關(guān)酶的測定

取小鼠肝臟組織樣品25 mg，加入500 μL 0.1 M PBS 緩沖液，充分勻漿。在4 ℃，1000 G 的條件下離心10 min，取上清液。照試劑盒說明測定不同組小鼠肝臟組織ROS活性及MDA、SOD的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean 值法組）的形式表示。采用origin2017對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析作圖。用單因素方差分析法（One-way ANOVA法）檢驗(yàn)飲用酒組、食用酒精組與對照組及飲用酒組與食用酒精組差異顯著性（與對照組相比：* p＜0.05，** p＜0.01，*** p＜0.001；與飲用酒組相比：#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001）。

2 結(jié)果與分析

2.1 飲用酒和食用酒精暴露對小鼠肝組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響（圖1）

由圖1 可以看出，飲用酒和食用酒精暴露后，小鼠肝臟組織中的ROS 活性顯著增加，分別為對照組的3.76 倍、5.15 倍（p＜0.001，p＜0.001）；與此同時(shí)，小鼠肝臟組織中促氧化因子和抗氧化因子的表達(dá)發(fā)生相應(yīng)的變化，其中過氧化氫酶MDA 的水平上升，分別為對照組的2.21 倍、2.73 倍（p＜0.01，p＜0.01），超氧化物歧化酶SOD 水平明顯降低，分別為對照組的0.82 倍、0.42 倍（p＜0.05，p＜0.01）。除此之外，與飲用酒處理組相比，食用酒精處理組肝臟氧化應(yīng)激效應(yīng)更為明顯，呈現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05）。

2.2 飲用酒和食用酒精暴露對小鼠肝組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（圖2）

由圖2 可以看出，與對照組相比，飲用酒組和食用酒精組的自噬相關(guān)因子的表達(dá)呈上升趨勢。其中自噬標(biāo)志因子LC3B 的表達(dá)分別增加為對照組的1.42 倍、1.79 倍，Beclin-1 的表達(dá)增加分別為對照組的1.43 倍、1.78 倍，說明乙醇能夠誘導(dǎo)小鼠肝臟體內(nèi)細(xì)胞自噬水平上升；食用酒精組的LC3B和Beclin-1 表達(dá)增加更為明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），表明其誘導(dǎo)的肝細(xì)胞自噬程度較飲用酒組大。

2.3 飲用酒和食用酒精暴露對小鼠肝組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（圖3）

由圖3A、圖3B、圖3C 可知，飲用酒和食用酒精灌胃處理小鼠后，Bax 的表達(dá)分別上調(diào)為對照組的1.28 倍、1.31 倍，Bcl-2 的表達(dá)分別下降為對照組的0.58 倍、0.43 倍（p＜0.05，p＜0.01），Bax/Bcl-2 的比值具有顯著性差異，分別為對照組的2.24 倍、3.03倍（p＜0.05，p＜0.01）；由圖3D 可以看出，飲用酒組和食用酒精組的P53 表達(dá)分別升高為對照組的1.51 倍、1.88 倍（p＜0.05，p＜0.01）；食用酒精組與飲用酒組相比，Bax/Bcl-2 的比值以及P53 的表達(dá)增加更為明顯，具有顯著性差異（p＜0.05）。

3 討論與結(jié)論

乙醇誘導(dǎo)機(jī)體損傷的機(jī)制復(fù)雜多樣，主要有代謝產(chǎn)物乙醛的毒性效應(yīng)、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡、自噬及內(nèi)毒素等。有相關(guān)研究表明，氧化應(yīng)激在酒精性肝損傷的發(fā)展中起著重要作用[13-14]。乙醇進(jìn)入小鼠體內(nèi)，誘導(dǎo)肝臟中代謝乙醇的主要酶——CYP2E1 的活性增加，從而導(dǎo)致大量的ROS 產(chǎn)生[15]，細(xì)胞呈現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)?；钚匝酰≧OS）的產(chǎn)生和積累，不斷耗竭SOD 等抗氧化因子，對抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生抑制效果，促使氧化因子（如MDA）的大量積累，導(dǎo)致促氧化物與抗氧化物之間的動態(tài)平衡失調(diào)，產(chǎn)生了大量受損的線粒體致使肝細(xì)胞凋亡或死亡[16-17]，導(dǎo)致肝功能受損。

自噬發(fā)生過程中有由兩個(gè)類泛素共軛系統(tǒng)介導(dǎo)，分別是Atg5-Atg12-Atg16連接系統(tǒng)和Atg8/LC3連接系統(tǒng)，作用于自噬囊泡膜的進(jìn)一步延長。自噬發(fā)生時(shí)，Atg16和Atg12-Atg5結(jié)合，使LC3轉(zhuǎn)化為脂共軛膜結(jié)合型LC3B，直到自噬溶酶體形成[18-19]。迄今為止，在完整的自噬小體上只發(fā)現(xiàn)了LC3，故而被廣泛地作為研究自噬的標(biāo)志分子，因此LC3B 水平升高通常表明自噬小體的聚集[20-21]。Beclin-1 是酵母自噬基因6 在哺乳動物的同源物，它可與抗凋亡因子Bcl-2 相互作用，參與自噬和調(diào)亡的啟動過程，對細(xì)胞生存和死亡具有重要意義[22-23]。自噬被認(rèn)為是眾多細(xì)胞的生存調(diào)節(jié)因素，適度的自噬作為保護(hù)可以清除多余的代謝蛋白，但自噬不足或過強(qiáng)時(shí)，則會導(dǎo)致組織細(xì)胞死亡。本研究表明，乙醇暴露促使肝細(xì)胞體內(nèi)的LC3B 及Beclin-1 的表達(dá)增加，說明在乙醇的誘導(dǎo)下，大量受損的線粒體和ROS自由基產(chǎn)生，自噬反應(yīng)被激活，產(chǎn)生大量自噬小體和溶酶體，消化降解體內(nèi)細(xì)胞，引起肝細(xì)胞死亡。

Bcl-2 家族相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素之一[24]，Bcl-2 和Bax 分別作為Bcl-2 家族中抗凋亡和促凋亡的代表基因，在肝細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控中起著中心作用[25]。P53 基因作為細(xì)胞周期G1 期DNA 損傷的檢查點(diǎn)，在正常情況下具有阻斷細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[26]。研究結(jié)果表明，飲用酒和食用酒精處理小鼠后，抑癌基因P53 的表達(dá)增加，同時(shí)上調(diào)促凋亡基因Bax的轉(zhuǎn)錄，抑制抗凋亡基因Bcl-2 的表達(dá)，Bax/Bcl-2的比值具有顯著性差異。乙醇暴露情況誘導(dǎo)下細(xì)胞凋亡增多，雖然其在一定程度上利于調(diào)節(jié)肝功能，但當(dāng)細(xì)胞凋亡增加所致肝臟損傷超過其代償能力時(shí)，會導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)和功能的異常，甚至導(dǎo)致各種肝臟疾病。

研究結(jié)果表明，由于親肝性毒物乙醇的暴露，誘導(dǎo)小鼠肝臟組織氧化應(yīng)激的發(fā)生，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生自噬，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致飲用酒組和食用酒精組都表現(xiàn)出明顯的肝損傷；值得注意的是，在相同酒精度數(shù)情況下，食用酒精暴露誘導(dǎo)的肝臟損傷程度更大，且具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示飲用酒在釀制過程中產(chǎn)生的某些組分可能對酒精性肝損傷起到一定的保護(hù)作用，其機(jī)理還需要進(jìn)一步研究確定[27-29]。