間充質(zhì)干細(xì)胞治療視網(wǎng)膜疾病作用機(jī)制的研究進(jìn)展*

連曉倩 徐國(guó)興

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院;2.福建省眼科研究所,福建 福州 350005)

0 引言

間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell ，MSCs)是中胚層來(lái)源的具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，最初由Fridenstein等在骨髓中發(fā)現(xiàn)，此后，又發(fā)現(xiàn)了不同來(lái)源的MSCs，如脂肪組織(ADSC)、牙髓、臍帶華通氏膠(huc-MSCs)、胎盤羊膜(hAD-MSCs)等[1]。MSCs是目前再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域最熱門的干細(xì)胞之一，具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用、血管生成調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗凋亡等多種功能。許多研究已經(jīng)表明，MSCs在多種視網(wǎng)膜疾病的治療中發(fā)揮重要作用，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜退行性疾病、脈絡(luò)膜新生血管、視網(wǎng)膜缺血-再灌注等疾病。

1 MSCs治療視網(wǎng)膜疾病作用機(jī)制的研究進(jìn)展

MSCs發(fā)揮視網(wǎng)膜保護(hù)作用的機(jī)制多種多樣，可能的主要機(jī)制是神經(jīng)保護(hù)作用、免疫調(diào)節(jié)作用和血管生成調(diào)節(jié)作用，通過(guò)組合的方式修復(fù)或再生受損的視網(wǎng)膜組織，恢復(fù)視網(wǎng)膜功能。

1.1 神經(jīng)保護(hù)作用

目前，較為大眾所知的MSCs介導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)功能，一方面是MSCs通過(guò)特定微環(huán)境的誘導(dǎo)生成視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細(xì)胞，替代凋亡細(xì)胞；另一方面是MSCs通過(guò)旁分泌作用產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)因子，如睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)和軸突生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(GAP-43)等[2-4]。此外，越來(lái)越多的證據(jù)表明，MSCs釋放的細(xì)胞外囊泡具有治療潛力[5-6]。根據(jù)其獨(dú)特的生物學(xué)組成，細(xì)胞外囊泡可分為微囊泡、微顆?；蛲饷隗w，它們?cè)谝耘苑置诜绞秸{(diào)節(jié)細(xì)胞間通信中發(fā)揮著重要作用[7]。MSCs來(lái)源的外泌體富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸。有研究發(fā)現(xiàn)，MSCs來(lái)源的外泌體在視網(wǎng)膜激光損傷的小鼠模型中具有修復(fù)和保護(hù)視網(wǎng)膜的作用。

近年來(lái)，出現(xiàn)另一種假說(shuō)，即干細(xì)胞可將其自身的正常線粒體轉(zhuǎn)移到周圍線粒體受損的靶細(xì)胞，從而影響受損細(xì)胞的增殖、分化和衰老等過(guò)程。MSCs的線粒體轉(zhuǎn)移已在角膜細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[8-10]。當(dāng)線粒體損傷時(shí)，ATP合成不足，導(dǎo)致RGCs軸突萎縮，視覺(jué)功能受損，如Leber遺傳性視神經(jīng)病變[11]。Jiang D等利用線粒體復(fù)合物I缺陷小鼠模型，即NDUFS4基因敲除小鼠模型，將誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞源性間充質(zhì)干細(xì)胞(iPSC-MSCs，用LV-mito-GFP標(biāo)記線粒體)注射到小鼠玻璃體腔中，免疫熒光(IF)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)小鼠視網(wǎng)膜的RGCs中表達(dá)LV-mito-GFP陽(yáng)性線粒體，并且RGC的存活率較對(duì)照組明顯升高。說(shuō)明iPSC-MSCs的線粒體能夠轉(zhuǎn)移到RGC中，并且對(duì)RGC具有保護(hù)作用[12]。

1.2 免疫調(diào)節(jié)作用

MSCs介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明，可能的機(jī)制包括細(xì)胞-細(xì)胞間直接接觸，以及分泌生物活性物質(zhì)，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和趨化因子等。MSCs可以抑制多種細(xì)胞的功能，包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)、B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。例如，在體內(nèi)和體外，MSCs都能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化，并通過(guò)分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10和/或TGF-β等下調(diào)免疫應(yīng)答[13]。MSCs通過(guò)限制MHCII、CD1-α、CD40、CD80和CD86的表達(dá)來(lái)抑制單核細(xì)胞向樹(shù)突狀細(xì)胞的分化，并限制DC細(xì)胞的成熟[14]。MSCs對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用也已被證實(shí)。特別是，MSCs被證明可以抑制CD4+T細(xì)胞分化為促炎性Th1和Th17細(xì)胞系，并促進(jìn)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的生成，從而改善破壞性炎癥反應(yīng)[15-16]。此外，MSCs還能調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞等，但目前這些方面的研究報(bào)道較少。

有趣的是，MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用并不是天然固有的，研究發(fā)現(xiàn)，不同程度的炎癥介質(zhì)會(huì)誘導(dǎo)MSCs極化分型并表現(xiàn)出截然相反的免疫調(diào)節(jié)作用，即免疫抑制或促進(jìn)，這一特性稱為MSCs免疫調(diào)節(jié)的可塑性[17-18]。例如，在強(qiáng)炎癥狀態(tài)下，MSCs可以有效治療移植物抗宿主病(GVHD)，但是若將MSCs在骨髓移植同一天輸注，即炎癥反應(yīng)尚未開(kāi)始時(shí)，則治療效果不顯著。Ren等[19]發(fā)現(xiàn)MSCs發(fā)揮免疫抑制作用需要高濃度促炎因子的“授權(quán)”，主要包括IFN-γ、IL-1α、IL-1β和TNFα等促炎細(xì)胞因子。當(dāng)高濃度的促炎因子存在時(shí)，能顯著提高M(jìn)SCs分泌腫瘤壞死因子誘導(dǎo)基因6蛋白(TSG-6)、白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(IL-1Ra)、TGF-β、一氧化氮(NO)和吲哚胺2,3-氧合酶(IDO)等免疫調(diào)節(jié)因子的水平，從而發(fā)揮免疫抑制作用。而多種促炎因子同時(shí)存在可以產(chǎn)生協(xié)同增效作用[19]。究其原因，主要是低水平的炎癥因子不足以誘導(dǎo)MSCs高表達(dá)NO和IDO等免疫抑制因子，反而會(huì)刺激MSCs分泌大量趨化因子，從而招募淋巴細(xì)胞至其周圍，加劇炎癥反應(yīng)[20]。

1.3 血管調(diào)節(jié)作用

通過(guò)血管修復(fù)性細(xì)胞治療，以取代或恢復(fù)受損的血管，正在成為干細(xì)胞治療缺血性視網(wǎng)膜病變的新策略。已有研究表明，MSCs能夠分化成內(nèi)皮樣細(xì)胞，對(duì)視網(wǎng)膜血管病變起保護(hù)作用[21-23]。除此之外，MSCs還可以分泌血管生成相關(guān)因子調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜疾病的血管生成，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-b(TGF-b1)[24,25]。在氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變小鼠模型中，研究者發(fā)現(xiàn)通過(guò)腹膜內(nèi)移植的人胎盤羊膜來(lái)源的MSCs能有效歸巢并移植到受損部位，并且釋放血管生成相關(guān)因子，如TGF-β1[26]，TGF-β1水平的上調(diào)可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖顯著減少新生血管形成[26]。2016年，Ezquer等人報(bào)道了在糖尿病小鼠模型中，MSCs通過(guò)分泌血小板來(lái)源的抗血管生成因子——血小板反應(yīng)蛋白-1(Thrombospondin Type-1,TSP-1)發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[27]。TSP-1是一種糖蛋白，在健康的眼部微環(huán)境中調(diào)節(jié)MSC功能，包括抗血管生成、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和免疫赦免活動(dòng)，主要是由眼表上皮細(xì)胞(包括RPE、脈絡(luò)膜細(xì)胞和Muller膠質(zhì)細(xì)胞)產(chǎn)生[27-29]。

然而，也有研究發(fā)現(xiàn)MSCs移植后眼中的病理性新血管反而加重。2010年的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，骨髓來(lái)源的MSCs能選擇性地遷移并移植到脈絡(luò)膜新生血管旁，并進(jìn)一步加重病理狀況[30]，其可能與MSCs分泌VEGF有關(guān)，眾所周知，VEGF可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖和管狀結(jié)構(gòu)形成，是促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管形成的關(guān)鍵因子。有研究發(fā)現(xiàn)，MSCs表達(dá)VEGF的多少與微環(huán)境中炎癥蛋白的濃度有關(guān)，Ribot J等將大鼠骨髓來(lái)源的MSCs與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)上清液中TNF-α和FGF濃度下降時(shí)，VEGF的表達(dá)也下降[31]。此外，BMSCs可分泌血小板反應(yīng)蛋白-1(TSP-1)，TSP-1是一種功能強(qiáng)大的血管生成抑制劑，可通過(guò)Fyn和p38MAPK介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[29]，此外TSP-1還可以通過(guò)招募特異性磷酸酶SHP-1到CD36-VEGFR2復(fù)合物中，從而抑制VEGF誘導(dǎo)的VEGFR2磷酸化和下游Akt信號(hào)通路[30]或下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達(dá)[31]來(lái)減少血管生成。MSCs是良好的基因載體，因此，可以通過(guò)基因修飾增強(qiáng)血管抑制因子的表達(dá)來(lái)抑制視網(wǎng)膜新生血管的生成[32,33]。

2 問(wèn)題與展望

間充質(zhì)干細(xì)胞由于沒(méi)有倫理問(wèn)題、易于分離和擴(kuò)增以及低免疫原性的優(yōu)勢(shì)，已成為細(xì)胞替代治療的一種有價(jià)值的工具。多項(xiàng)研究表明，MSCs對(duì)視網(wǎng)膜疾病的治療有益，但其具體的作用機(jī)制尚不完全明確，目前研究較多的是MSCs分化為視網(wǎng)膜細(xì)胞的能力，旁分泌恢復(fù)性營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用和血管調(diào)節(jié)作用。但如何準(zhǔn)確調(diào)控MSCs的分化時(shí)相、選擇性分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和抗血管生長(zhǎng)因子，仍是治療的難點(diǎn)。除此之外，由于視網(wǎng)膜疾病的復(fù)雜性，加上動(dòng)物模型的局限性，以及尚未證實(shí)的人體臨床試驗(yàn)安全性，也為MSCs治療視網(wǎng)膜疾病的研究帶來(lái)了不確定性。因此，對(duì)MSCs的研究任重而道遠(yuǎn)。