高通量測(cè)序分析新生兒感染早產(chǎn)兒腸道菌群特點(diǎn)

孫倩，姜春明

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院新生兒重癥監(jiān)護(hù)二科，哈爾濱 150001)

腸道是新生兒出生后菌群定植的主要場(chǎng)所，微生物的種類、分屬、數(shù)量及相對(duì)豐度等的動(dòng)態(tài)平衡，在保證嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育、促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟、參與體內(nèi)物質(zhì)代謝等方面起重要作用。近年來(lái)有研究表明，嬰幼兒所患疾病(感染性疾病、呼吸道疾病等)與腸道微生態(tài)的失衡有密切聯(lián)系[1]。新生兒期是腸道微生物群落建立的關(guān)鍵階段，在某些特定條件下，如機(jī)體抵抗力下降、過(guò)度使用廣譜抗生素等，腸道內(nèi)的次要菌群在腸道內(nèi)大量繁殖，轉(zhuǎn)變?yōu)槟c道內(nèi)的新優(yōu)勢(shì)菌群，使得腸道穩(wěn)態(tài)失衡從而致病[2]。腸道微生態(tài)的生物學(xué)功能主要是保持腸道的正常生理結(jié)構(gòu)及相關(guān)功能，避免致病微生物的入侵及定植，調(diào)節(jié)人體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮功能[3]。而影響新生兒腸道菌群定植的因素主要包括胎齡、分娩方式、喂養(yǎng)方式等。當(dāng)腸道微生態(tài)失衡時(shí)，其表現(xiàn)的致病性包括：①導(dǎo)致自身感染或原定植細(xì)菌轉(zhuǎn)移到其他部位而誘發(fā)感染；②導(dǎo)致胃腸道功能紊亂，表現(xiàn)為排便困難、腹瀉等；③導(dǎo)致或參與某些腸道器質(zhì)性病變(如壞死性小腸結(jié)腸炎)的發(fā)病[4]。因此，深入研究新生兒腸道微生態(tài)的動(dòng)態(tài)變化，可針對(duì)性調(diào)整腸道內(nèi)的定植菌群，有效降低新生兒感染的發(fā)病率[2]。本研究通過(guò)高通量測(cè)序分析方法對(duì)早產(chǎn)兒糞便樣本中所有細(xì)菌進(jìn)行DNA測(cè)序，研究早產(chǎn)兒腸道微生態(tài)的分布特征，分析患有新生兒感染早產(chǎn)兒的腸道菌群特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年8月至2018年12月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科分娩且符合入組標(biāo)準(zhǔn)的26例早產(chǎn)兒作為研究對(duì)象，患兒出生后均在本院新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房住院治療。新生兒感染標(biāo)準(zhǔn)：①出生7 d出現(xiàn)氣促、發(fā)紺、三凹征等臨床表現(xiàn)。②出生7 d后血常規(guī)示白細(xì)胞計(jì)數(shù)<5×109/L，或>20×109/L；血小板計(jì)數(shù)<100×109/L；血清降鈣素原>2.0 μg/L等。③臨床癥狀為皮膚發(fā)花、四肢末梢涼、拒乳、發(fā)熱、腹脹、黃疸進(jìn)行性加重等，但血培養(yǎng)為陰性。④血培養(yǎng)為陽(yáng)性。按照是否感染將患兒分為新生兒感染組(12例)和未感染組(14例)。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①早產(chǎn)兒，胎齡為30～37周；②均為剖宮產(chǎn)；③出生體重為1 000～3 000 g；④住院時(shí)間超過(guò)7 d；⑤均為人工喂養(yǎng)；⑥收集標(biāo)本前均未給予抗生素及益生菌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①排除患嚴(yán)重消化道畸形、遺傳代謝病及重度窒息的早產(chǎn)兒；②排除母親孕期患有宮內(nèi)感染、給予抗生素治療的早產(chǎn)兒。

1.3試驗(yàn)方法 分別于出生后第1天(即24 h內(nèi))和出生后第7天收集患兒糞便。采集樣本時(shí)要留取早產(chǎn)兒糞便的中部，每份標(biāo)本重量≥200 mg，將樣本裝入無(wú)菌的EP管中，并立即放入液氮中進(jìn)行凍存。

利用美國(guó)丹諾爾Denovix超微量紫外可見分光光度計(jì)DS-11和適當(dāng)濃度凝膠電泳對(duì)早產(chǎn)兒糞便中的微生物DNA做總質(zhì)檢。選擇特定16S核糖體DNA為擴(kuò)增片段，合成具有特異性的引物。用稀釋后的DNA序列作為模板，使用Taq DNA多聚酶進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，選用適當(dāng)濃度的凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)聚合酶鏈反應(yīng)，其產(chǎn)物利用Denovix超微量紫外可見分光光度計(jì)DS-11和凝膠電泳進(jìn)行相應(yīng)文庫(kù)質(zhì)檢[5]。

檢驗(yàn)合格后，使用熒光定量系統(tǒng)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量，并依據(jù)每個(gè)樣本的數(shù)量要求，進(jìn)一步做對(duì)應(yīng)要求的混合。使用美國(guó)Illumina公司的HiSeq PE2500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序[6]。由上海銳翌基因科技有限公司完成相應(yīng)樣本提取、建庫(kù)、測(cè)序、分析。

1.4生物信息學(xué)分析

1.4.1測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾、鏈接和去嵌合體處理，得到的有效序列按照97%相似度進(jìn)行歸類，得到操作分類單元(operational taxonomical unit，OTU)，每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)一個(gè)不同的細(xì)菌(微生物)種群。然后對(duì)每個(gè)樣本的序列數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，進(jìn)一步提取相應(yīng)的OTU序列。對(duì)每個(gè)OTU序列進(jìn)行種群相應(yīng)的分類，依據(jù)每個(gè)分類單元中序列的數(shù)目，獲得相應(yīng)的豐度表，最終依據(jù)該豐度表進(jìn)行后續(xù)相應(yīng)數(shù)據(jù)分析[7]。

1.4.2物種分類和豐度分析 依據(jù)物種歸類的結(jié)果，分別在各分類等級(jí)(門、綱、目、科、屬)對(duì)各個(gè)樣本做種群相對(duì)豐度圖，可直接查看在每一等級(jí)上，物種的相對(duì)豐度及所占比例。

1.4.3物種多樣性分析 運(yùn)用Beta多樣性分析，利用各樣本序列間的豐度信息來(lái)計(jì)算樣本間距離，從而反映組間是否具有顯著的微生物群落差異。采用多響應(yīng)置換過(guò)程(multi-response permutation procedure，MRPP)分析組間菌群組成的差異性，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MRPP分析包括加權(quán)與非加權(quán)兩種：非加權(quán)時(shí)，不考慮物種的豐度進(jìn)行加權(quán)處理，會(huì)擴(kuò)大或縮小物種豐度的差異；而加權(quán)統(tǒng)計(jì)后，考慮了物種的豐度，保留了物種原始豐度特征，對(duì)低豐度菌群反映更好。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 26例早產(chǎn)兒共收集52份糞便樣本，成功提取DNA并完成測(cè)序25份，將標(biāo)本信息納入生物信息分析。進(jìn)入測(cè)序分析的兩組早產(chǎn)兒的胎齡、出生體重比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組早產(chǎn)兒的胎齡和出生體重比較

2.2測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果和OUT統(tǒng)計(jì) 本次測(cè)序得到的有效序列總數(shù)為828 388，總堿基數(shù)為351 852 086 bp，平均長(zhǎng)度為424.35 bp，其中長(zhǎng)度為420～440 bp的優(yōu)質(zhì)序列占總序列的92.68%。25個(gè)標(biāo)本共得到79個(gè)OTU，說(shuō)明本次測(cè)序的深度足夠，測(cè)序所得數(shù)據(jù)量合理。

2.3物種多樣性的分析

2.3.1單個(gè)樣品的菌群分類及相對(duì)豐度 共測(cè)得門水平6個(gè)、綱水平12個(gè)、目水平17個(gè)、科水平29個(gè)、屬水平40個(gè)，菌群種類共40個(gè)。豐度較高的菌群包括門水平為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門，綱水平為γ-變形菌綱、擬桿菌綱、桿菌綱、梭菌綱、放線菌，目水平為腸桿菌目、擬桿菌目、乳酸桿菌，科水平為腸桿菌科、擬桿菌科、紫單胞菌科、腸球菌科、消化鏈球菌科，屬水平為克雷伯桿菌屬、埃希桿菌屬/志賀桿菌屬、擬桿菌屬、副桿菌屬、腸球菌屬，見圖1～5。

2.3.2早產(chǎn)兒生后第7天腸道菌群對(duì)新生兒感染情況的影響 運(yùn)用物種MRPP分析提示，新生兒感染組與非感染組的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

A：感染組；B：非感染組

A：感染組；B：非感染組

A：感染組；B：非感染組

A：感染組；B：非感染組

A：感染組；B：非感染組

表2 兩組早產(chǎn)兒的MRPP差異比較

3 討 論

新生兒腸道微生態(tài)動(dòng)態(tài)平衡是維持新生兒正常生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素，影響新生兒腸道菌群分布的因素較多，主要包括胎齡、分娩方式、喂養(yǎng)方式、新生兒抗生素使用情況等。當(dāng)腸道微生物群失衡時(shí)，極易誘發(fā)新生兒感染性疾病，常見的有宮內(nèi)感染、敗血癥、壞死性小腸結(jié)腸炎等。

有研究表明，母乳喂養(yǎng)以雙歧桿菌、乳酸桿菌為優(yōu)勢(shì)菌群，且可以為有益菌群的定植提供合適的環(huán)境[8]；陰道分娩的胎兒腸道菌群多樣性較高，且無(wú)定植延遲，較少發(fā)生腸道菌群失調(diào)并引發(fā)感染性疾病[9]。因此，本研究選取剖宮產(chǎn)出生、人工喂養(yǎng)的早產(chǎn)兒作為研究對(duì)象，以減少分娩方式及喂養(yǎng)方式對(duì)腸道菌群的影響。本研究共收集了52份新生兒糞便樣本，DNA提取失敗共27份，其中22份出生后第1天及5份出生后第7天糞便標(biāo)本因濃度過(guò)低未提取成功。由于新生兒出生時(shí)腸道內(nèi)接近無(wú)菌狀態(tài)，出生后才逐漸獲得各種菌群定植，所以本研究中患兒生后第1天糞便樣本DNA提取成功率較低。既往研究表明，胎齡是新生兒腸道微生態(tài)形成的影響因素，早產(chǎn)兒身體各器官發(fā)育均不成熟，抵抗力與適應(yīng)性差，故出生體重越輕，胎齡越小，腸道成熟度越低，腸道菌群的豐富度及多樣性越差，各種感染的發(fā)生率越高[10]。本研究對(duì)象是胎齡為30+2～36+3周，平均胎齡為34 周的早產(chǎn)兒，因此糞便的微生物含量可能較低，影響DNA的提取。

本研究將提取成功的25份樣本的基因進(jìn)入測(cè)序程序，由Alpha稀釋曲線可知，每一份樣本的曲線均隨Reads數(shù)目的增加而趨于平坦，所以本試驗(yàn)測(cè)序深度足夠，且測(cè)序數(shù)據(jù)量比較合理。本研究測(cè)得的早產(chǎn)兒早期腸道菌群，按細(xì)菌分類表分類包括門水平6個(gè)、綱水平12個(gè)、目水平17個(gè)、科水平29個(gè)、屬水平40個(gè)。研究表明，由于早產(chǎn)兒胃腸道在宮內(nèi)發(fā)育不成熟、出生后腸道由宮內(nèi)的低氧環(huán)境轉(zhuǎn)為宮外富氧環(huán)境、腸道抗氧化系統(tǒng)未成熟等，早產(chǎn)兒的腸道微生態(tài)形成延遲，所以其豐度較足月新生兒明顯降低[11]。

本研究對(duì)感染與非感染狀態(tài)下早產(chǎn)兒生后第7天的腸道菌群分布進(jìn)行比較，其中新生兒感染組共測(cè)得門水平4個(gè)、綱水平6個(gè)、目水平10個(gè)、科水平13個(gè)、屬水平35個(gè)，未感染組共測(cè)得門水平5個(gè)、綱水平10個(gè)、目水平14個(gè)、科水平28個(gè)、屬水平40個(gè)，未感染組腸道菌群的豐富度明顯高于新生兒感染組。經(jīng)MRPP組間差異分析，兩組細(xì)菌物種的組成差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)主坐標(biāo)分析對(duì)各樣品菌種的相對(duì)豐度進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與新生兒感染組相比，未感染組的新生兒腸道菌群相對(duì)豐度更高，腸道微生態(tài)多樣性更加豐富。

本研究結(jié)果顯示，新生兒感染組的腸道菌群主要分布如下：門水平為變形菌門，綱水平為γ-變形菌綱、桿菌綱，目水平為腸桿菌目、梭菌目，科水平為腸桿菌科、腸球菌科，屬水平為克雷伯桿菌屬、大腸埃希菌屬/志賀菌屬及擬桿菌屬；未感染組的腸道菌群主要分布如下：門水平為擬桿菌門、變形菌門，綱水平為γ-變形菌綱、擬桿菌綱、桿菌綱，目水平為腸桿菌目、擬桿菌目、乳酸桿菌目，科水平為腸桿菌科、擬桿菌科、紫單胞菌科，屬水平為克雷伯桿菌屬、大腸埃希菌屬/志賀菌屬、擬桿菌屬、副桿菌屬。可見，新生兒感染組菌群分布范圍較小、菌種含量較少、變形桿菌豐度較高；而未感染組的菌群分布更為廣泛、多樣性較高、更有均一性。但是菌群多樣性過(guò)高同樣也會(huì)增加條件致病菌的致病機(jī)會(huì)，所以恰當(dāng)?shù)木憾鄻有圆趴梢詫?duì)宿主起保護(hù)作用[12]。

新生兒感染可發(fā)生在三個(gè)階段：①出生前感染，可發(fā)生于妊娠期各階段，最常見的途徑為病原菌經(jīng)母親血流通過(guò)胎盤感染胎兒，又稱宮內(nèi)感染；②出生時(shí)感染，剖宮產(chǎn)、胎膜早破、產(chǎn)程延長(zhǎng)等均可導(dǎo)致胎兒感染；③出生后感染，較上述兩種感染更為常見。病原體通過(guò)呼吸道、消化道等途徑傳播，導(dǎo)致新生兒敗血癥、新生兒感染性肺炎等。而新生兒腸道微生態(tài)的建立是一個(gè)緩慢發(fā)展的動(dòng)態(tài)演變過(guò)程，直至2周歲時(shí)才逐漸趨于穩(wěn)定，且與正常成人的腸道微生態(tài)相似[13]。針對(duì)早產(chǎn)兒細(xì)菌培養(yǎng)的研究已發(fā)現(xiàn)，早產(chǎn)兒腸道細(xì)菌定植延遲，其潛在條件致病菌的優(yōu)勢(shì)菌群包括腸桿菌、擬桿菌及已知病原體(梭菌、葡萄球菌、假單胞菌和克雷伯菌)[14]。早產(chǎn)兒腸黏膜屏障功能并不成熟，造成腸壁通透性增加，故可能導(dǎo)致腸道微生態(tài)中的病毒、細(xì)菌和內(nèi)毒素進(jìn)入腸黏膜上皮細(xì)胞，造成腸道感染，甚至可以穿過(guò)腸壁進(jìn)入血液、器官或組織，造成全身感染[15]。

感染發(fā)生及其嚴(yán)重程度與致病微生物的毒性有極大關(guān)系。感染是否發(fā)生，一方面依據(jù)細(xì)菌的數(shù)量、感染方式、毒力等，另一方面與機(jī)體當(dāng)時(shí)的免疫狀態(tài)也有極大關(guān)系。有研究表明，腸道內(nèi)腸桿菌科的大腸埃希菌可以在極低水平時(shí)造成感染，當(dāng)其內(nèi)部的Rcs系統(tǒng)啟動(dòng)時(shí)，細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲力增強(qiáng)，致使感染加重；同屬腸桿菌科的克雷伯桿菌亦是如此，菌內(nèi)的Rcs系統(tǒng)啟動(dòng)使得莢膜多糖合成，進(jìn)而產(chǎn)生高毒力，易導(dǎo)致敗血癥、傳染病鼠疫、肺炎等感染性疾病的發(fā)生[16]。所以，當(dāng)腸道內(nèi)定植大量變形桿菌(腸桿菌)時(shí)，條件致病菌群的相對(duì)豐度增加，可造成腸道微生態(tài)失衡，易誘發(fā)新生兒感染。當(dāng)腸道內(nèi)微生物多樣性增加時(shí)，致病菌的相對(duì)豐度就會(huì)降低，且與其他菌群形成相對(duì)穩(wěn)態(tài)，降低了感染性疾病的發(fā)生率。此外，包含敗血癥和全身炎癥反應(yīng)綜合征在內(nèi)的嚴(yán)重新生兒感染均與微生物定植-宿主相互作用有關(guān)。有研究表明，新生兒敗血癥可能是由腸黏膜防御功能低下，通透性高，腸道細(xì)菌移位侵入血液循環(huán)引起[17-19]。由于早產(chǎn)兒開奶延遲或不能母乳喂養(yǎng)，雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌等益生菌無(wú)法在腸道內(nèi)正常定植，進(jìn)而導(dǎo)致病原菌在腸道內(nèi)定植或作為優(yōu)勢(shì)菌群在腸道內(nèi)進(jìn)行大量繁殖，侵襲腸道，引起腸黏膜損傷，最終導(dǎo)致壞死性小腸結(jié)腸炎[20]。

本研究結(jié)果顯示，腸道內(nèi)定植大量變形桿菌(腸桿菌)，增加了菌群的相對(duì)豐度，由次要菌群變?yōu)閮?yōu)勢(shì)菌群，同時(shí)降低了有益菌群的相對(duì)豐度，造成腸道生理穩(wěn)態(tài)的失調(diào)，極易誘發(fā)新生兒感染。當(dāng)腸道定植菌群的多樣性增加時(shí)，可以維持腸道菌群的動(dòng)態(tài)平衡，促進(jìn)了免疫系統(tǒng)的建立和成熟，降低新生兒尤其是早產(chǎn)兒感染性疾病的發(fā)生率。

綜上所述，關(guān)于新生兒感染時(shí)早產(chǎn)兒腸道菌群的分布仍需大量試驗(yàn)驗(yàn)證，目前腸道微生態(tài)與新生兒疾病的關(guān)系已成為研究熱點(diǎn)。隨著試驗(yàn)技術(shù)及設(shè)備的不斷進(jìn)步，基因庫(kù)的不斷完善，新生兒腸道微生物群落的變化在新生兒感染性疾病發(fā)生中所起的作用將得到充分證實(shí)，同時(shí)腸道微生態(tài)也會(huì)對(duì)新生兒相關(guān)疾病的早期診斷和治療起到一定作用，極大改善新生兒，尤其是早產(chǎn)兒感染性疾病的預(yù)后并對(duì)遠(yuǎn)期生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響。