腎茶多糖纖維素酶法提取工藝及抗氧化活性研究

（昭通學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，云南昭通657000）

腎茶[Clerodendranthus spicatus（Thunb.）C.Y.Wu]為唇形科腎茶屬植物，全世界有5種，我國(guó)僅有1種，主要分布于福建、廣東、廣西、海南和云南等省，其中云南西雙版納和思茅腎茶栽培最多[1-2]。腎茶味苦，性涼，主要用于治療急慢性腎炎、膀胱炎、尿路結(jié)石和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)等癥[3]。腎茶中含有黃酮類、酚酸類、萜類及糖苷類等化學(xué)成分[4-8]，具有抗菌[9-10]、抗氧化[11-12]、降血糖[13]、抑制腫瘤[14]等生物活性。目前，對(duì)腎茶的研究多集中于酚酸類和黃酮類，對(duì)其多糖研究較少。研究表明，從植物中提取的水溶性多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗輻射、降血脂、抗病毒、抗腫瘤等功效，且細(xì)胞毒性低、安全性強(qiáng)，植物多糖已成為人們研究的熱點(diǎn)[15]。

腎茶多糖存在于腎茶的組織細(xì)胞內(nèi)，難以溶出。采用纖維素酶能降解植物細(xì)胞中的纖維素，可有效破除細(xì)胞壁，使多糖成分溶出。酶法提取植物多糖，提取條件溫和，既能提高多糖得率，又能較好地保持多糖的生物活性[16]。文中對(duì)纖維素酶法提取腎茶多糖的工藝進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，建立腎茶多糖提取方法，并對(duì)所得多糖體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)估，以促進(jìn)腎茶資源的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腎茶：來(lái)源于藥用植物研究所云南分所唇形科植物 Clerodendranthus spicatus（Thunb.）C.Y.Wu 的干燥嫩枝葉；纖維素酶（食品級(jí)3 000 U/g）：和氏璧生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：分析純，美國(guó)Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BPG-9156A型精密鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-S26s型恒溫水浴鍋：金壇市大地自動(dòng)化儀器廠；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮儀器有限公司；UV-1800PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)文獻(xiàn)[17]，用苯酚-硫酸法繪制多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=11.27x-0.020 5，r=0.999 3，線性范圍0～0.008 3 mg/mL。

1.3.2 腎茶多糖的測(cè)定

準(zhǔn)確移取一定體積多糖提取液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測(cè)定，計(jì)算出腎茶多糖的提取率。

式中：T為多糖提取率，%；C為多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V為體系總體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 纖維素酶提取法單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以纖維素酶為酶制劑，提取腎茶多糖：腎茶→烘干→粉碎過(guò)80目篩→加提取液酶解浸提→沸水浴滅活5 min→過(guò)濾→濾液濃縮→醇沉→多糖→溶解測(cè)定[18]。

1.3.3.1 料液比的選擇

固定酶解時(shí)間2 h，酶用量2%（以干樣質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)），酶解溫度55℃，酶解pH 4，考察料液比分別為1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）時(shí)，對(duì)多糖提取率的影響。

1.3.3.2 酶用量的選擇

固定料液比 1 ∶30（g/mL），酶解 pH 4，酶解溫度55℃，酶解時(shí)間2 h，考察酶用量分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%時(shí)，對(duì)多糖提取率的影響。

1.3.3.3 酶解pH值的選擇

固定料液比 1∶30（g/mL），酶解溫度 55℃，酶解時(shí)間2 h，酶用量2%，考察酶解pH值分別為3、4、5、6、7時(shí)，對(duì)多糖提取率的影響。

1.3.3.4 酶解溫度的選擇

固定料液比 1 ∶30（g/mL），酶解時(shí)間 2 h，酶用量2%，酶解 pH 4，考察酶解溫度分別為 25、35、45、55、65℃時(shí)，對(duì)多糖提取率的影響。

1.3.3.5 酶解時(shí)間的選擇

固定料液比 1∶30（g/mL），酶解溫度 55℃，酶用量 2%，酶解 pH 4，考察酶解時(shí)間分別為 0.5、1、1.5、2、2.5 h時(shí)，對(duì)多糖提取率的影響。

1.3.4 纖維素酶響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)腎茶多糖提取率影響較大的酶用量、酶解pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，分析優(yōu)化腎茶多糖的纖維素酶法提取工藝。

1.3.5 水提取法

前期試驗(yàn)研究表明以去離子水為溶劑，料液比1∶30（g/mL），90℃水浴浸提 2 h，提取液濃縮醇沉所得腎茶多糖含量較高，以此條件提取腎茶多糖。

1.3.6 腎茶多糖抗氧化活性測(cè)定

采用文獻(xiàn)[19]的方法，通過(guò)DPPH自由基（DPPH·）、羥基自由基（·OH）清除法以及普魯士藍(lán)法測(cè)定腎茶多糖的抗氧化能力，并以維生素C做陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行比較。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3次，采用origin75和Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶法提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)腎茶多糖提取率的影響

料液比對(duì)腎茶多糖提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)腎茶多糖提取率的影響Fig.1 Effect of material-liquid ratio on extraction yield of polysaccharides from C.spicatus

由圖1可知，腎茶多糖提取率隨著料液比的增大而增大，當(dāng)料液比高于1∶30（g/mL）時(shí)，多糖提取率開(kāi)始下降。這是由于增大溶劑量，使得腎茶顆粒與溶劑充分接解，促進(jìn)了多糖的溶出，但當(dāng)溶劑量過(guò)大時(shí)，腎茶顆粒中的其他雜質(zhì)成分也會(huì)參與溶出，使得多糖提取率下降，因此，確定料液比為1∶30（g/mL）。

2.1.2 酶用量對(duì)腎茶多糖提取率的影響

酶用量對(duì)腎茶多糖提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 酶用量對(duì)腎茶多糖提取率的影響Fig.2 Effect of cellulase amount on extraction yield of polysaccharides from C.spicatus

由圖2可知，腎茶多糖的提取率隨著酶用量的增加而增大，當(dāng)酶用量達(dá)2.0%時(shí)，酶與底物充分接觸，酶能有效分解細(xì)胞壁，使得多糖更易溶出，提取率達(dá)到最高。當(dāng)繼續(xù)增加酶用量，過(guò)量的酶會(huì)包裹腎茶顆粒表面，阻礙多糖進(jìn)一步溶出，多糖提取率下降[20]。因此，適宜的酶用量為2.0%。

2.1.3 酶解pH值對(duì)腎茶多糖提取率的影響

酶活力顯著受pH值影響，每種酶都有其作用的最適pH值。酶解pH值對(duì)腎茶多糖提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 酶解pH值對(duì)腎茶多糖提取率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis pH on extraction yield of polysaccharides from C.spicatus

由圖3可知，當(dāng)提取液pH值為4時(shí)，腎茶酶解效率最佳，多糖提取率最高，表明纖維素酶在偏酸性條件下酶活力較強(qiáng)，之后隨著提取液pH值增大，酶活力減弱，酶解效率降低[21]，多糖提取率下降，故選酶解pH值為4。

2.1.4 酶解溫度對(duì)腎茶多糖提取率的影響

酶解溫度對(duì)腎茶多糖提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 酶解溫度對(duì)腎茶多糖提取率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on extraction yield of polysaccharides from C.spicatus

結(jié)果顯示，多糖提取率隨著酶解溫度的升高而逐漸增大，酶解溫度在55℃時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大，之后隨著酶解溫度的升高，多糖提取率迅速下降。酶是一類具有適宜溫度范圍的蛋白質(zhì)，酶解溫度過(guò)低，酶的催化活性被抑制，酶解溫度過(guò)高，酶蛋白質(zhì)變性而失活[21]。所以，確定酶解溫度為55℃。

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)腎茶多糖提取率的影響

酶解時(shí)間對(duì)腎茶多糖提取率的影響見(jiàn)圖5。

結(jié)果顯示，腎茶多糖的提取率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，酶解2 h時(shí)，多糖提取率最大，超過(guò)2 h，多糖提取率急速下降。酶解2 h，酶解充分，多糖能最大限度溶出，酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酶開(kāi)始失活，并且部分多糖會(huì)被水解，多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生降解，導(dǎo)致多糖提取率減小。因此，酶解時(shí)間確定為2 h。

2.2 纖維素酶響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果分析

以酶用量、酶解pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間為自變量，腎茶多糖提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experlmental design and results for response surface methodology

表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Desing-Expert.V8.0.6軟件分析擬合，得到腎茶多糖提取率的多元回歸方程：Y=12.41+0.16A-0.36B-0.62C+0.16D+0.72AB+0.17AC+0.060AD-0.18BC+0.18BD-0.31CD-0.56A2-1.04B2-1.06C2-0.41D2。

對(duì)上述模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

結(jié)果表明，此模型的P值小于0.000 1，響應(yīng)面回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)P值為0.515 5大于0.05，不顯著，表明所建模型擬合程度良好?；貧w模型相關(guān)系數(shù)R2為0.904 5，反映該線性回歸模型能在90.45%程度上解釋反應(yīng)變量Y的變異性。由顯著性水平檢驗(yàn)可知，B、C、AB、A2、B2、C2項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值影響極顯著 （P＜0.01）；D2對(duì)響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05）；A、D、AC、AD、BC、BD、CD項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值影響不顯著，表明試驗(yàn)因素對(duì)多糖提取率的影響不是簡(jiǎn)單線性關(guān)系。從F值可知，影響腎茶多糖提取率的因素強(qiáng)弱順序?yàn)镃（酶解溫度）>B（酶解pH值）>A（酶用量）>D（酶解時(shí)間）。

2.2.2 交互作用分析

由回歸方程繪制響應(yīng)面和等高線圖，如圖6所示。

從圖6中可以看出，酶用量、酶解pH值、酶解溫度和酶解時(shí)間4個(gè)因素中任意2個(gè)因素之間的交互作用，除酶用量和酶解pH值交互作用顯著外，其余交互作用不顯著。在酶用量和酶解pH值等高線圖中可以看出，酶用量在1.5～2.5%，酶解pH值在3～5范圍內(nèi)，腎茶多糖提取容易達(dá)到最大值，最大值在其圓心處。酶解pH值的變化要比酶用量的變化對(duì)多糖提取率的影響更明顯。

圖6 各因素交互作用對(duì)腎茶多糖提取率的影響Fig.6 Effects of factors interactive on extraction yield of polysaccharides from C.spicatus

2.2.3 最佳工藝驗(yàn)證

由Desing-Expert.V8.0.6軟件優(yōu)化分析，得到腎茶多糖最優(yōu)提取條件為酶用量2.02%，酶解pH3.90，酶解溫度51.76℃，酶解時(shí)間2.15 h，此時(shí)腎茶多糖的提取率為12.55%?？紤]到實(shí)際操作的簡(jiǎn)便性，將工藝條件修正為酶用量2%，酶解pH3.90，酶解溫度52℃，酶解時(shí)間2h，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)得腎茶多糖平均提取率為12.51%，與理論預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差為0.32%，表明該模型具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

按料液比1∶30（g/mL），在腎茶粉末中加入去離子水，于90℃水浴浸提2 h，多糖提取率為8.29%，較纖維素酶法多糖提取率低，酶提多糖約是水提多糖的1.5倍，表明酶提法優(yōu)于水提法。纖維素酶能有效降解植物細(xì)胞中的纖維素，提高多糖溶出率。

2.3 腎茶多糖抗氧化活性分析

2.3.1 清除DPPH·活性

腎茶多糖及維生素C對(duì)DPPH·的清除活性如圖7所示。

圖7 腎茶多糖對(duì)DPPH·的清除作用Fig.7 Scavenging effect of polysaccharides from C.spicatus on DPPH·

從圖7可知，隨著多糖質(zhì)量濃度的增大，酶提多糖和水提多糖清除DPPH·能力增強(qiáng)。酶提多糖與水提多糖清除DPPH·的IC50值分別為33.14 μg/mL和40.59 μg/mL，酶提多糖清除DPPH·能力強(qiáng)于水提多糖，表明酶法提取條件溫和，避免高溫浸提導(dǎo)致多糖水解，較好地保持了多糖的生物活性。但兩種提取方法所得多糖對(duì)DPPH·的清除能力均弱于維生素C（IC50值為5.77 μg/mL），這可能與試驗(yàn)所得多糖的純度、清除機(jī)制等因素有關(guān)。

2.3.2 清除·OH的活性

腎茶多糖及維生素C對(duì)·OH的清除活性如圖8所示。

圖8 腎茶多糖對(duì)·OH的清除作用Fig.8 Scavenging effect of polysaccharides from C.spicatus on·OH

結(jié)果顯示，在設(shè)置的試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，酶提多糖和水提多糖都能劑量依賴性地清除·OH，其IC50值分別為0.64、0.82 mg/mL，酶提多糖對(duì)·OH的清除能力相對(duì)較強(qiáng)，但均弱于維生素C（IC50值為0.16mg/mL）。

2.3.3 還原活性

腎茶多糖及維生素C的還原活性如圖9所示。

圖9 腎茶多糖的還原能力Fig.9 Reducing ability of polysaccharides from C.spicatus

結(jié)果顯示，隨著多糖質(zhì)量濃度增加，吸光度增大，還原能力增強(qiáng)，說(shuō)明多糖質(zhì)量濃度與多糖還原能力呈正相關(guān)。不同提取方法所得多糖的還原能力不同，相較于水提多糖，酶提多糖的還原能力較強(qiáng)，但酶提和水提多糖的還原能力均低于維生素C。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化腎茶多糖的纖維素酶法提取工藝，并與水提法相比較。結(jié)果表明，料液比1 ∶30（g/mL），酶用量 2%，酶解 pH3.90，酶解溫度52℃，酶解時(shí)間2 h，腎茶多糖提取率為12.51%，優(yōu)于水提法（8.29%）。通過(guò)清除DPPH·、·OH和普魯士藍(lán)法測(cè)定腎茶多糖的抗氧化活性，結(jié)果顯示腎茶多糖對(duì)自由基的清除作用及還原能力隨其濃度的增大而增強(qiáng)。說(shuō)明腎茶多糖具有較好的抗氧化活性，且酶提多糖的抗氧化活性強(qiáng)于水提法。此試驗(yàn)所得多糖未經(jīng)純化，為粗多糖，其雜質(zhì)成分如蛋白質(zhì)、色素等會(huì)干擾多糖的抗氧化作用。下步試驗(yàn)將進(jìn)一步對(duì)所提多糖純化，并研究其與抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系，為腎茶在天然抗氧化功能產(chǎn)品領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。