A20蛋白水平影響狼瘡模型小鼠TLR2、4-p38MAPK/NF-kB信號(hào)通路的初步研究★

張 麗，李曉嵐

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，云南 昆明 650101）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus,SLE）是一種可累及多種器官組織并以淋巴細(xì)胞異?；罨?、大量自身抗體產(chǎn)生和免疫復(fù)合物形成為特征的自身免疫性疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制尚未闡明，微生物如細(xì)菌或病毒感染可通過(guò)模擬自身抗原機(jī)制誘發(fā)本病或致病情復(fù)燃。隨著SLE治療水平的不斷提高，患者因SLE疾病本身所致的死亡降低，而因治療藥物所導(dǎo)致的并發(fā)癥如感染等卻導(dǎo)致死亡增加。Toll樣 受 體2（Toll like receptor 2,TLR2） 和Toll樣受體 4（Toll like receptor 4,TLR4）是先天固有免疫的重要因子，在抗菌抗感染免疫中起著主要作用，可激活下游信號(hào)分子絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-actived protein kinase p38,p38MAPK）和核因子κB（Nuclear factor-kappa B,NF-κB）,從而誘導(dǎo)大量細(xì)胞因子及炎癥因子產(chǎn)生，加重SLE的炎癥反 應(yīng)[1、2]。A20（Tumor necrosis factor α-l induced protein 3,TNFAIP3）基因作為SLE的易感基因，其異常表達(dá)與SLE的發(fā)病密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)A20基因缺陷的小鼠對(duì)LPS及TNF的敏感性異常增強(qiáng)，此外還發(fā)現(xiàn)SLE患者異常低表達(dá)A20蛋白可致p38MAPK及NF-κB持續(xù)過(guò)度活化[3-5]。本研究利用瑞香素（Daphnetin）可刺激提高A20蛋白水平而發(fā)揮其抗炎作用的特性[5]，通過(guò)注射瑞香素提高SLE模型小鼠PBMC中A20蛋白的水平，觀察能否抑制TLR2、4-p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路以緩解SLE小鼠的炎癥反應(yīng)，為臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 （4～5）周齡MRL/lpr和BALB/c雌性小鼠，SPF級(jí)，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與主要試劑 瑞香素，小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液，BCA蛋白定量試劑盒，考馬斯亮藍(lán)G-250（大連美侖生物公司）；小鼠尿素氮試劑盒（Solarbio公司）；兔抗小鼠GAPDH多克隆抗體，兔抗小鼠β-actin多克隆抗體，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，小鼠IL-6 ELISA 試劑盒，小鼠TNF-α ELISA 試劑盒（Proteintech公司）；小鼠anti-dsDNA IgG ELISA試劑盒（Alpha Diagnostic公司）；兔抗小鼠NFκB-p65多克隆抗體，兔抗小鼠pNFκB-p65多克隆抗體，兔抗小鼠p38MAPK多克隆抗體，兔抗小鼠pp38MAPK多克隆抗體（CST公司）；兔抗小鼠A20多克隆抗體，兔抗小鼠TLR4多克隆抗體，兔抗小鼠TLR2多克隆抗體（萬(wàn)類生物公司）。

1.1.3 主要設(shè)備 分光光度計(jì)，酶標(biāo)儀（Thermo公司）；Western blot電泳儀（北京六一公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 36只MRL/lpr和18只BALB/c雌性小鼠均由中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所統(tǒng)一飼養(yǎng)（清潔級(jí)）。隨機(jī)將兩類小鼠分為BALB/c小鼠陰性對(duì)照組（Sham，n=18）、MRL/lpr小鼠未處理組（SLE，n=18）、MRL/lpr小鼠瑞香素處理組（Daphnetin，n=18）。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，治療組小鼠1次/d經(jīng)腹腔注射100μl瑞香素溶液（瑞香素，4mg/kg），連續(xù)6周；同時(shí)未治療組及陰性對(duì)照組1次/d經(jīng)腹腔注射100μl生理鹽水，連續(xù)6周。在此期間注重觀察各組小鼠毛發(fā)及體重的變化以及生存率。給藥結(jié)束后，取各組小鼠24h尿液并用分別盛有分離膠、促凝劑及肝素鈉的離心管經(jīng)內(nèi)眥靜脈收集全血，隨后將含有促凝劑的全血經(jīng)3 000 r·min-1離心10min，分離得到血清；向含有肝素鈉的全血中加入等體積的PBS進(jìn)行稀釋，并用小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)RIPA裂解液裂解后離心取上清為蛋白樣品，再用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。隨即將處理得到的樣本-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 指標(biāo)檢測(cè) ① 小鼠毛發(fā)及體重的變化和生存率：直至給藥結(jié)束期間，每周測(cè)量各組小鼠平均體重以及記錄各組小鼠死亡情況，并在此期間觀察各組小鼠毛發(fā)的變化，拍照記錄。② 腎臟功能評(píng)估：利用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)尿蛋白以及用小鼠血尿素氮檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血尿素氮，按試劑說(shuō)明書(shū)操作。 ③ ELISA法 檢 測(cè)anti-dsDNA IgG、TNF-α及IL-6：取保存?zhèn)溆玫难?，步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。④ Western Blot法檢測(cè)A20、NFκB-p65、pNFκB-p65、p38MAPK、pp38MAPK以及TLR2、TLR4蛋白表達(dá)情況：將待測(cè)蛋白進(jìn)行等量蛋白上樣，Marker上樣5μl，進(jìn)行SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)條件以100mA/200V/90min將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉3h后一抗封閉過(guò)夜，二抗孵育2h后洗膜滴顯影劑采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0版統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），采用單因素方差分析（One-way ANOVA）統(tǒng)計(jì)組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果和分析

2.1 小鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，各組小鼠毛發(fā)順滑有光澤，進(jìn)食正常，狀態(tài)良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，SLE組小鼠消瘦，毛發(fā)凌亂、脫落、干枯無(wú)光澤；Daphnetin組狀態(tài)較好，同Sham組小鼠毛發(fā)依然順滑、有光澤。SLE組小鼠6只死亡，Daphnetin組小鼠2只死亡，Sham組小鼠無(wú)一死亡（圖1）。

2.2 小鼠體質(zhì)量變化情況 在取樣前，SLE組小鼠第8周齡時(shí)平均體質(zhì)量增加幅度較Daphnetin組變緩，第9周齡時(shí)SLE組小鼠平均體質(zhì)量開(kāi)始持續(xù)下降，變得消瘦；相反，Daphnetin組小鼠平均體質(zhì)量持續(xù)增加，直至取樣；Sham組小鼠平均體質(zhì)量增至7周齡時(shí)不再變化（圖2）。

圖1 小鼠一般狀態(tài)

圖2 三組小鼠體質(zhì)量變化情況

2.3 小鼠生存率分析 三組小鼠的存活率分別為Sham組：100%；SLE組：66.7%；Daphnetin組：88.9%。Daphnetin組和Sham組小鼠存活率都高于SLE 組（圖 3）。

圖3 三組小鼠生存率示意圖

2.4 小鼠A20蛋白的表達(dá) Daphnetin組小鼠PBMC中A20蛋白表達(dá)顯著高于SLE組小鼠；Sham組小鼠和SLE組小鼠PBMC中A20蛋白表達(dá)沒(méi)有顯著差別（圖4）。

圖4 A20蛋白在小鼠中的高表達(dá)

圖5 A20高表達(dá)降低了小鼠尿蛋白和血尿素氮水平

2.5 小鼠尿蛋白和血尿素氮水平 SLE組小鼠尿蛋白及血尿素氮水平顯著高于Sham組小鼠，而Daphnetin組小鼠尿蛋白及血尿素氮水平低于SLE組小鼠（圖5）。2.6 小鼠血清anti-dsDNA IgG水平 SLE組小鼠血清anti-dsDNA IgG水平顯著高于Sham組小鼠，而Daphnetin組小鼠血清anti-dsDNA IgG水平低于SLE組小鼠（圖6）。

圖6 A20高表達(dá)降低了小鼠血清anti-dsDNA IgG水平

2.7 小鼠血清IL-6、TNF-α水平 SLE組小鼠血清IL-6、TNF-α水平顯著高于Sham組小鼠，而Daphnetin組小鼠血清IL-6、TNF-α水平低于SLE組小鼠（圖7）。

圖7 A20高表達(dá)降低了小鼠血清IL-6、TNF-α水平

2.8 小鼠TLR2、TLR4蛋白的表達(dá)及pNFκB-p65、pp38MAPK活性 SLE組小鼠PBMC的TLR2、TLR4、pNFκB-p65及pp38MAPK的表達(dá)顯著高于Sham組小鼠，而Daphnetin組小鼠PBMC的TLR2、TLR4、pNFκB-p65及pp38MAPK的表達(dá)低于SLE組小鼠（圖 8）。

3 討論

圖8 A20抑制了小鼠TLR2、TLR4、pNFκB-p65和pp38MAPK蛋白的表達(dá)

近年來(lái)，通過(guò)研究抑制信號(hào)傳導(dǎo)通路減少細(xì)胞炎癥因子的釋放，從而控制 SLE的進(jìn)展，已經(jīng)成為治療SLE的新思路。多項(xiàng)研究表明，SLE患者出現(xiàn) p38MAPK 及 NF-κB 過(guò)度活化的現(xiàn)象[6、7]，而這兩條信號(hào)通路受多分子調(diào)控，其中就包括Toll樣受體（Toll-like receptors,TLRs）。作為天然免疫與獲得性免疫的橋梁，有研究報(bào)道SLE患者體內(nèi)存在TLRs表達(dá)水平的異常，不同的TLRs發(fā)揮著協(xié)同或不同的作用，TLR2和TLR4作為細(xì)菌感染的主要受體，可通過(guò)識(shí)別病原體病原相關(guān)分子模式與相應(yīng)配體結(jié)合而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，通過(guò)激活p38MAPK及NF-κB最終引起大量促炎因子IL-6、IL-1β及TNF-α等的分泌，導(dǎo)致SLE患者腎臟、肝臟等多臟器的損傷[8]。有報(bào)道稱SLE患者穩(wěn)定組、活動(dòng)組和合并感染組外周血PBMC中TLR2和TLR4表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，說(shuō)明TLR2和TLR4在SLE的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。本研究通過(guò)MRL/lpr狼瘡小鼠模型，將MRL/lpr未治療組與陰性對(duì)照組比較，其結(jié)果表明，MRL/lpr未處理組小鼠較陰性對(duì)照組小鼠尿蛋白及血清中血尿素氮明顯增多，血清anti-dsDNA IgG產(chǎn)生增加和血清IL-6、TNF-α 分 泌 增 多 以 及PBMC中TLR2、TLR4、pNFκB-p65及pp38MAPK表達(dá)水平增加，提示TLR2、4-p38MAPK/NF-κB該信號(hào)通路積極參與了MRL/lpr狼瘡小鼠的發(fā)病機(jī)制。

A20作為一種具有強(qiáng)大抗炎功能的蛋白，利用自身N端的去泛素化功能和C端的泛素化活性，可以負(fù)調(diào)控作用于p38MAPK/NF-κB兩條信號(hào)通路上的多種信號(hào)分子，減少細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生，這主要通過(guò)TNF途徑和TLR途徑來(lái)完成[9、10]。其中TLR主要由髓樣分化因子（MyD88）依賴及非依賴途徑激活，A20蛋白通過(guò)去除TRAF6泛素化從而抑制TLR途徑。有研究證實(shí)，當(dāng)IL-1β和LPS刺激后，可招募MyD88和TRAF6聚積至細(xì)胞內(nèi)的TLR/IL-1R區(qū)。A20通過(guò)去除TRAF6的K63多聚泛素鏈以及干擾TRAF6與Ubc13/H5的結(jié)合，使Ubc5和Ubc13被蛋白酶體降解來(lái)抑制TRAF6的泛素化作用和活化，進(jìn)而抑制TAK1與下游信號(hào)分子的相互作用，從而達(dá)到抑制p38MAPK/NF-κB活化的目的[11]。在本研究中，與MRL/lpr未處理組小鼠比較，Daphnetin處理組小鼠PBMC中A20蛋白表達(dá)水平顯著提高。結(jié)果 顯示高表達(dá)的A20能改善狼瘡模型小鼠營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)狀況；高表達(dá)的A20能降低狼瘡模型小鼠促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α和自身抗體anti-dsDNA IgG水平；高表達(dá)的A20能抑制TLR2、TLR4的表達(dá)及p38MAPK、NF-κB的活化；高表達(dá)的A20能減輕狼瘡相關(guān)的腎臟損傷使得小鼠尿蛋白及血清中血尿素氮減少。因此，A20的高表達(dá)可抑制TLR2、4-p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路，從而明顯改善對(duì)MRL/lpr狼瘡模型小鼠的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，提高M(jìn)RL/lpr狼瘡模型小鼠體內(nèi)的A20蛋白表達(dá)能顯著抑制TLR2、4-p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路，對(duì)MRL/lpr狼瘡模型小鼠的相關(guān)癥狀起著緩解和治療作用。由此可見(jiàn)，誘導(dǎo)提高抗炎分子A20的表達(dá)將有望成為治療SLE疾病的新策略。