補腎健脾活血方對大鼠懸尾試驗性骨質(zhì)疏松和肌萎縮影響的實驗研究

楊先文 ，楊香紅 ，胡 海 ，黃宏興

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東廣州510360； 2.中國人民武裝警察部隊廣東省總隊醫(yī)院，廣東廣州510507；3.北京衛(wèi)戍區(qū)豐臺第三離職干部休養(yǎng)所，北京100000； 4.中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院，廣東廣州510000）

廢用性骨質(zhì)疏松癥又稱失用性骨質(zhì)疏松癥，是指由于骨骼的機械張力刺激減少所引起的全身或局部骨量丟失［1］。失重骨質(zhì)疏松癥屬于廢用性骨質(zhì)疏松癥的一種，是指由于重力消失所導(dǎo)致的骨量減少，肌肉退化而易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼肌肉系統(tǒng)性疾病，屬于中醫(yī)學(xué)“骨痿”的范疇［1］。報道發(fā)現(xiàn)航空員1 個月在太空上丟失的骨量相當(dāng)于地球表面絕經(jīng)后婦女 1 年的骨量丟失［2］。Vico L 等［3］發(fā)現(xiàn)30 d 的飛行可以導(dǎo)致脛骨松質(zhì)骨骨量減少1.7%；飛行6 個月后，脛骨皮質(zhì)骨骨量減少了1.8%，松質(zhì)骨骨量減少了5.4%。長期失重還導(dǎo)致肌肉流失，宇航員飛行22 d 后，比目魚肌的流失量可達到30%以上［4］。肌肉的流失導(dǎo)致了肌肉力量下降，飛行人員每次執(zhí)行任務(wù)肌肉最大收縮力可按6%～25%速度衰減。動物研究發(fā)現(xiàn)，大鼠4～7 d 的航天飛行，其比目魚肌就可發(fā)生約37%的萎縮，而盡管采取了一系列措施，但6 個月的航天飛行仍會使抗重力性骨骼肌發(fā)生大約20%的萎縮［5］。

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院在對骨質(zhì)疏松癥和肌萎縮的長期臨床治療和研究過程中，對其治療以補腎壯骨、健脾益氣配合活血化瘀為法，精心篩選提煉藥物組方補腎健脾活血方，用于骨質(zhì)疏松癥治療10 年余，已獲得國家發(fā)明專利［6］。前期研究表明，該方能把握治療骨質(zhì)疏松癥的根本環(huán)節(jié)，是目前防治骨質(zhì)疏松癥的理想中藥制劑，在改善骨密度和雌二醇水平方面明顯優(yōu)于阿侖磷酸鈉，有效地延緩骨質(zhì)疏松的進展［7］。細胞和動物實驗也表明該方可促進成骨細胞的形成，對成骨細胞增殖分化具有直接促進作用，利于成骨［8］。此外，補腎健脾活血方可在一定程度上調(diào)控骨質(zhì)疏松骨骼肌通透性轉(zhuǎn)化孔（Mitochondrial permeability transition pore，MPTP）的開放程度，具有防止骨質(zhì)疏松骨骼肌萎縮的潛在功效［9］，但補腎健脾活血方是否可以防治廢用性骨質(zhì)疏松暫無研究。本研究通對建立模擬失重雄性大鼠骨質(zhì)疏松模型，建模成功之后分別給予高、低劑量補腎健脾活血方干預(yù)，觀察對照組和干預(yù)組大鼠的血生化指標(biāo)、骨密度改變情況，為今后該方治療失重性骨質(zhì)疏松的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SD 大鼠由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供（合格證號0017012）。所有SD 大鼠均喂養(yǎng)在恒溫、恒濕的清潔環(huán)境中，環(huán)境溫度為（25±1）℃，濕度為 70%，每天 12 h 光照／黑暗，任意進食，飼養(yǎng)大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料和自來水。大鼠以標(biāo)準(zhǔn)化的飼料和水進行隨意飼養(yǎng)，在進行懸尾實驗前經(jīng)歷1 周的適應(yīng)期。大鼠置于大小為25 cm×45 cm×30 cm 飼養(yǎng)小籠，單籠喂養(yǎng)。動物實驗由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審批合格，編號20180134。

1.1.2 實驗藥物 補腎健脾活血法擬方，藥物組成：補骨脂、白芍各10 g，制淫羊藿、肉蓯蓉、熟地黃、黃芪、菟絲子、丹參各12 g，當(dāng)歸 8 g，大棗 6 g。該方采用復(fù)方水提醇沉工藝提取藥物，使之含生藥量1.43 g/mL，供灌胃用，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院制劑室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠飼養(yǎng)和懸尾實驗

48 只SD 大鼠隨機分為補腎健脾活血方高劑量組、低劑量組、模型組和空白對照組，每組12只。除空白對照組外，其余各組均選用大鼠懸尾實驗制備廢用性骨質(zhì)疏松和肌萎縮模型［10］。尾吊前所有大鼠用溫肥皂水清洗鼠尾，去除油脂和皮屑，剃刀去除尾毛；實驗開始時用安息香配和松香涂于鼠尾，以防粘貼物對皮膚的激惹作用。噴涂松香還可使尾部皮膚表面變澀，增加膠帶的黏性。將適宜長度和寬度的純棉質(zhì)醫(yī)用透氣膠帶（透氣性好、刺激性小、黏性強）對折，粘貼于尾吊組鼠尾兩側(cè)距尾根部 1 cm 遠，鼠尾近2/3 長度范圍、皮膚較厚的部位，鼠尾上、下面留有2 mm 的間隙未粘貼膠帶以免壓迫皮下鼠尾動、靜脈，影響鼠尾部正常血循環(huán)。保持大鼠頭低位，身體縱軸傾斜與水平呈30°，使大鼠的后爪在伸直時剛好不能觸及籠的底層，即處于懸空不負重狀態(tài)，前肢著地可自由活動、覓食飲水。造模共計28 d，造模期間，補腎健脾活血方高劑量組給予補腎健脾活血方提取物2.50 g/（kg·d）灌胃，補腎健脾活血方低劑量組給予補腎健脾活血方提取物1.25 g/（kg·d）灌胃，造模組和空白對照組給予等劑量飲用水灌胃，每天1 次。28 d 后，全部大鼠腹腔采血后處死，取右側(cè)股骨以及L1～4椎骨和完整分離左右側(cè)比目魚肌。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測成骨標(biāo)記物在第28 天處死大鼠前，采用雙抗夾心ELISA 檢測大鼠成骨標(biāo)記物血清骨形成蛋白2（BMP-2）、骨鈣素（OCN）及破骨標(biāo)記物抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）水平（R&D system，MN，美國），分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣品孔。操作按大鼠趨化因子試劑盒說明進行，每孔各加入稀釋PBS 緩沖液稀釋 1000 倍的待測血清 10 μL，37 ℃ 溫育 30 min；洗液洗板 5 次，加入酶標(biāo)試劑 50 μL，混勻，37 ℃溫育30 min，洗板后加入顯色劑避光顯色10 min。在450 nm 波長下測量各孔的吸光度值（OD 值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD 值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD 值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。

1.3.2 Real-time PCR 檢測成骨相關(guān)基因的表達應(yīng)用 Real-time PCR 對 OCN、Runx-2 兩成骨相關(guān)基因進行定量分析并進行比較。股骨組織總RNA 的提取及逆轉(zhuǎn)錄從樣本保存液中取出，根據(jù)RNA 提取試劑盒上的操作步驟進行（TAKARA，日本）。RT-PCR 反應(yīng)GAPDH 作為內(nèi)標(biāo)基因，設(shè)計OCN、Runx-2 等引物的序列。反應(yīng)條件均為：95 ℃ 3 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，循環(huán) 40 次。每標(biāo)本檢測2 次。根據(jù)最終的優(yōu)化體系，比較目的基因與內(nèi)標(biāo)基因的擴增效率的斜率回歸有無統(tǒng)計學(xué)意義。如果無統(tǒng)計學(xué)意義，應(yīng)用比較閾值法即2-△△Ct，所得結(jié)果表示目的基因相對于空白對照組的倍數(shù)，如果有統(tǒng)計學(xué)意義，按Rasmussen 計算出相對表達差異，每次實驗均重復(fù)3 次。

1.3.3 雙能X 線骨密度測定 在第28 天試驗結(jié)束時取各組大鼠右側(cè)股骨以及L1～4椎骨，除凈附著其上的肌肉和軟組織，生理鹽水沖洗，用雙能X射線骨密度分析儀測定大鼠離體椎骨以及右側(cè)股骨的骨密度，骨密度值以單位面積的骨礦物質(zhì)含量（g/cm2）表示，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3.4 比目魚肌濕重比與橫截面積測量 取出比目魚肌稱量其濕重，所得數(shù)據(jù)以100 g 體質(zhì)量標(biāo)化，對各組動物的每一比目魚肌組織各隨機抽取2 張接近肌腹中部的切片，每張切片在200 倍光鏡隨機觀察3 個視野。肌纖維橫截面積的觀察則取不少于20 個肌細胞，將其總面積除以肌細胞個數(shù)，得出各種不同類型的肌纖維橫截面積的平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況觀察

實驗過程中各組大鼠一般情況變化，健脾活血方高劑量組因麻醉過量致死1 只；健脾活血方低劑量組死亡2 只，造模組死亡2 只，空白對照組死亡2 只。死亡原因均為灌胃不當(dāng)誤入肺部或腸胃脹氣致死。最后納入統(tǒng)計分析的各組大鼠的數(shù)量為：健脾活血方高劑量組11 只、健脾活血方低劑量組10 只、模型組10 只、空白對照組10 只。

2.2 補腎健牌活血方對股骨和椎體骨密度的影響

與空白對照組相比，模型組大鼠右側(cè)股骨和椎體 BMD 顯著降低（P＜0.05），說明我們建立廢用性骨質(zhì)疏松模型成功。與模型組相比，健脾活血方高劑量組大鼠右側(cè)股骨和椎體BMD 顯著增高（P＜0.05），健脾活血方低劑量組右側(cè)股骨和椎體BMD 雖然有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見圖 1、圖2。

圖1 補腎健脾活血方對懸尾大鼠股骨BMD 的影響

圖2 補腎健脾活血方對懸尾大鼠椎體BMD 的影響

2.3 補腎健牌活血方對血清成骨標(biāo)記物BMP-2和破骨標(biāo)記物TRAP 的影響

與空白對照組相比，模型組大鼠血清BMP-2顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，健脾活血方高劑量組BMP-2 呈顯著性增高，健脾活血方低劑量組血清 BMP-2 有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與空白對照組相比，模型組大鼠血清破骨標(biāo)記物TRAP 顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，健脾活血方高劑量和低劑量組血清TRAP 顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。結(jié)果見圖 3、圖 4。

圖3 補腎健脾活血方對懸尾大鼠血清成骨標(biāo)記物BMP-2 的影響

圖4 補腎健脾活血方對懸尾大鼠破骨標(biāo)記物TRAP 的影響

2.4 補腎健牌活血方對股骨組織成骨因子OCN和Runx-2 mRNA 的影響

與空白對照組相比，模型組大鼠股骨OCN 和Runx-2 mRNA 的表達顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，健脾活血方高劑量組和低劑量組大鼠股骨 OCN 和 Runx-2 mRNA 表達顯著增高（P＜0.05）。結(jié)果見圖5、圖6。

2.5 補腎健牌活血方對比目魚肌濕重比與橫截面積的影響

圖5 補腎健脾活血方對懸尾大鼠股骨OCN mRNA 的影響

圖6 補腎健脾活血方對懸尾大鼠股骨Runx-2 mRNA 的影響

與空白對照組相比，模型組大鼠左側(cè)和右側(cè)比目魚肌平均濕重顯著降低（P＜0.01），說明廢用性骨質(zhì)疏松模型可以引起肌萎縮。與模型組相比，健脾活血方高劑量和低劑量組左側(cè)和右側(cè)比目魚肌平均濕重顯著增高（P＜0.05）。與空白對照組相比，模型組大鼠左側(cè)和右側(cè)比目魚肌I 型和II 型纖維橫截面積顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），健脾活血方高劑量組左側(cè)和右側(cè)比目魚肌平均濕重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組相比，健脾活血方高劑量組左側(cè)和右側(cè)比目魚肌I 型和II 型纖維橫截面積顯著增高（P＜0.05），健脾活血方低劑量組左側(cè)和右側(cè)比目魚肌I 型纖維橫截面積現(xiàn)模型組比較顯著增高（P＜0.05），但II 型纖維橫截面積與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見圖 7、圖 8。

圖7 補腎健脾活血方對懸尾大鼠比目魚肌平均濕重比的影響

3 討 論

本研究探討了補腎健脾活血方對懸尾大鼠失重致骨質(zhì)疏松和肌萎縮的影響，發(fā)現(xiàn)高低劑量補腎健脾活血方均可在一定程度上改善懸尾引起的骨質(zhì)疏松和肌萎縮，表明補腎健脾活血方對于廢用性骨質(zhì)疏松和肌萎縮均有防治作用，臨床上可用于輔助治療。

圖8 補腎健脾活血方對懸尾大鼠比目魚肌I 型和II 型纖維平均橫截面積的影響

本研究選用大鼠懸尾實驗建立廢用性骨質(zhì)疏松和肌萎縮模型。由于空間飛行機會寶貴，實驗條件和研究的系統(tǒng)性都受到限制，因此地面模擬實驗已成為研究空間骨丟失的主要方式。懸尾實驗是將嚙齒類動物尾巴固定，然后倒懸動物的身體，來觀察動物的行為活動，其最初常應(yīng)用于絕望情緒實驗研究中［10］。在懸尾實驗中，實驗鼠非常厭惡被拉著尾巴倒吊在空中，因此處于懸尾狀態(tài)的實驗鼠會努力掙扎。但是當(dāng)其因無法尋找到脫離困境的方法而絕望后，將會放棄掙扎而靜止于懸持狀態(tài)，此時實驗鼠身體核心處于失重狀態(tài)。

近年來發(fā)現(xiàn)采用大鼠懸尾試驗可在地面上模擬太空的失重狀態(tài)，且一直被研究者采用至今［11-12］。在航天器所能提供的資源極其有限的前提下，這種失重的模擬方法被認為是一種行之有效的方法。研究表明尾懸吊大鼠后股骨遠端和脛骨近端骨密度均明顯下降，且股骨力量明顯降低［13-14］。不僅如此，模擬失重狀態(tài)下比目魚肌的萎縮，尾懸吊14、30 d 后比目魚肌的相對濕重分別下降了11%和19%［15］。此外研究人員用放射性微球標(biāo)記后肢卸載大鼠，其股骨和脛骨的血流量明顯減少，這種血流的減少與減負后肢的骨質(zhì)減少量高度相關(guān)，提示骨血流灌注的改變可能會干擾骨吸收和骨形成的平衡［16］。說明大鼠尾懸吊模型可以成功誘導(dǎo)承重骨骨質(zhì)疏松、相應(yīng)的肌萎縮以及微循環(huán)障礙。

本研究發(fā)現(xiàn)補腎健脾活血方可以顯著提高尾懸吊大鼠股骨和椎體骨密度以及股骨成骨標(biāo)記物OCN 和Runx-2 的表達，提高血清成骨標(biāo)記物BMP-2 表達，降低血清破骨因子TRAP 的表達。此外補腎健脾活血方還可以提高比目魚肌濕重比與I 型和II 型纖維橫截面積，表明補腎健脾活血方可用于廢用性骨質(zhì)疏松。