Apelin-13在改善自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺血管狹窄中的機(jī)制

白桂林，劉 思

陜西省榆林市第二醫(yī)院血液凈化室，陜西榆林 719000

自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺是用于終末期腎病患者血液透析治療的一種血管通路，在臨床中應(yīng)用廣泛[1]。其在血液透析患者的治療中具有較好的安全性及實(shí)用性，但隨著使用時(shí)間延長(zhǎng)，患者可能發(fā)生自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺相關(guān)的并發(fā)癥，故防止自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺血管狹窄在終末期腎病治療中具有重要意義[2-3]。血管緊張素Ⅱ (AngⅡ)與血管緊張素Ⅱ1型受體(AGTR1)可以調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)際凋亡情況，也會(huì)進(jìn)一步增加血管的損傷，最后因血管內(nèi)膜增生導(dǎo)致血管狹窄形成[4-5]。內(nèi)源性配體13(Apelin-13)對(duì)高血壓及動(dòng)脈粥樣硬化有較好的治療效果，與此同時(shí)，能夠有效舒張腸系膜小動(dòng)脈且加速血流量恢復(fù)[6]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Apelin-13對(duì)AngⅡ可能具有拮抗作用，共同維持血壓平穩(wěn)[7-9]。本研究選擇60例自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺患者為研究對(duì)象，分析Apelin-13水平在自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺血管狹窄患者中的臨床意義及其介導(dǎo)血管舒張的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年1月至2018年1月于本院接受血液透析治療的60例患者為研究對(duì)象，將自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺血管狹窄的30例患者納入觀察組，其中男16例、女14例，平均(42.6±3.5)歲；將自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺非血管狹窄患者30例納入對(duì)照組，其中男17例、女13例，平均(42.4±3.7)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)終末期腎病，且采取規(guī)律血液透析治療患者；(2)意識(shí)清楚，能夠正常交流；(3)采取橈動(dòng)脈-頭靜脈方式進(jìn)行端側(cè)吻合；(4)中度內(nèi)瘺狹窄，即血液透析流量<150 mL/min，狹窄血管與鄰近血管直徑比值為0.5～0.7。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)惡性腫瘤；(2)嚴(yán)重感染；(3)未檢出原因的發(fā)熱；(4)既往激素治療或采取免疫抑制劑治療時(shí)間≥12個(gè)月。本研究經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施。兩組患者年齡、性別構(gòu)成等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1生化指標(biāo)檢測(cè) 采集患者的外周靜脈血約2 mL于抗凝管內(nèi)，分離血清，檢測(cè)血清中一氧化氮(NO)水平，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)血清中Apelin-13、AngⅡ水平。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECS)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，以濃度10%的胎牛血清+1640培養(yǎng)液在37 ℃及5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。AngⅡ刺激方案：在孔板上接種細(xì)胞，處于上述環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)約1 d，加入濃度為1 nmol/L的AngⅡ進(jìn)行刺激，保證在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d。AngⅡ及Apelin-13共同刺激的方案：同樣在孔板上接種細(xì)胞，和單獨(dú)刺激的環(huán)境相同進(jìn)行為期1 d的培養(yǎng)，加入濃度為1 nmol/L的AngⅡ及1 nmol/L的Apelin-13共同刺激，并置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 d。

1.2.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 參照Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中Apelin相關(guān)序列，設(shè)計(jì)出合成的干擾序列shApelin和無(wú)義序列Scramb兩個(gè)序列，見(jiàn)表1，且在pLKO.1的質(zhì)粒之上進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染的前1 d，接種約5×105個(gè)細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上接受培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)染的0.5 h前需換用沒(méi)有血清的DMEM培養(yǎng)液再予以培養(yǎng)。將200 μL無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液、3 μg質(zhì)粒、9 μL ViaFectTM轉(zhuǎn)染試劑充分混合制作成轉(zhuǎn)染液，放在室溫環(huán)境下靜置10 min左右。再將這些轉(zhuǎn)染液加入6孔板內(nèi)，注意輕搖混勻再放置到細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)持續(xù)培養(yǎng)約9 h，待轉(zhuǎn)染完畢之后再換用濃度10%的胎牛血清所制的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，時(shí)間為1 d，最后測(cè)得兩組序列，即Scramb組與shApelin組。

1.2.4免疫印跡試驗(yàn) 使用免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)所培養(yǎng)細(xì)胞中的磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(peNOS)、非磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)表達(dá)情況。選擇二喹啉甲酸(BCA)蛋白水平測(cè)定試劑盒對(duì)總蛋白水平進(jìn)行測(cè)定。首先選擇40 μg蛋白完成聚丙烯酰胺凝膠電泳試驗(yàn)。注意每4 μL蛋白質(zhì)加入約1 μL 5×SDS-PAGE的上樣緩沖液，充分混勻后，將蛋白放在100 ℃水浴中進(jìn)行變性，維持5 min左右，然后冷卻至室溫后再上樣電泳，當(dāng)藍(lán)色的染料到達(dá)了膠底部才可以停止電泳試驗(yàn)。選擇冰水浴的時(shí)候使用100 mA的恒流進(jìn)行轉(zhuǎn)膜約2 h，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)膜后，采用聚偏二氟乙烯膜以濃度5%脫脂奶粉在室溫環(huán)境下封閉約2 h；將抗Apelin、抗peNOS、抗eNOS、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)置于4 ℃環(huán)境下過(guò)夜進(jìn)行孵育。洗滌3次后，加入經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行標(biāo)記后的山羊抗兔二抗，再置于室溫環(huán)境下孵育約1 h；進(jìn)行3次洗滌后，加入ECL顯色液且在凝膠成像儀之下進(jìn)行有效曝光的拍攝。以Image J進(jìn)行灰度值的測(cè)定，注意將對(duì)照組灰度值調(diào)整到1。

表1 兩個(gè)序列的設(shè)計(jì)

2 結(jié) 果

2.1觀察組與對(duì)照組血清Apelin-13水平比較 觀察組血清Apelin-13水平為(53.10±5.75)pg/mL，明顯低于對(duì)照組的(80.44±9.75)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=13.23，P<0.05)。

2.2觀察組與對(duì)照組血清中AngⅡ、NO水平比較 結(jié)果顯示，觀察組和對(duì)照組血清中AngⅡ水平分別為(173.52±11.79)pg/mL和(146.55±7.81)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=10.45，P<0.05)。觀察組與對(duì)照組NO水平分別為(54.91±5.44)μmol/mL和(72.79±8.35)μmol/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.83，P<0.05)。

2.3Scramb組與shApelin組Apelin-13、peNOS、eNOS表達(dá)量、NO水平比較 shApelin組的Apelin-13、peNOS表達(dá)量低于Scramb組(t=19.82、83.28，P<0.05)，但兩組eNOS表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.52，P>0.05)。shApelin組NO水平高于Scramb組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.37，P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 Scramb組與shApelin組Apelin-13、peNOS、eNOS表達(dá)量、NO水平比較

2.4AngⅡ刺激對(duì)HUVECS的peNOS、eNOS表達(dá)量及NO水平的影響 免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果顯示，與未進(jìn)行AngⅡ刺激的HUVECS對(duì)比，AngⅡ刺激后HUVECS的peNOS表達(dá)量降低(t=1.02，P<0.05)，而eNOS表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=0.60，P>0.05)。未進(jìn)行AngⅡ刺激的HUVECS與AngⅡ刺激后的HUVECS細(xì)胞中NO水平分別為(29.87±6.27)μmol/mL和(22.59±3.44)μmol/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.58，P<0.05)。

2.5Apelin-13對(duì)AngⅡ的拮抗作用 AngⅡ刺激后的HUVECS細(xì)胞中peNOS表達(dá)量為(0.98±0.06)×103，AngⅡ、Apelin-13同時(shí)刺激的HUVECS細(xì)胞中peNOS表達(dá)量為(1.25±0.07)×103，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.04，P<0.05)，但 eNOS表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.01±0.04)×103vs. (1.03±0.05)×103，t=1.71，P>0.05]。AngⅡ、Apelin-13同時(shí)刺激的HUVECS細(xì)胞所培養(yǎng)的上清液中NO水平為(21.46±6.38)μmol/mL，低于AngⅡ刺激的NO水平[(29.12±2.95)μmol/mL]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.97，P<0.05)。

3 討 論

自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺是指吻合動(dòng)脈及鄰近的一些靜脈所組成的血管通道，目前，自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺已作為終末期腎臟病患者接受維持性血液透析治療時(shí)的首選血管通路，常用的自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺為自體橈動(dòng)脈與頸靜脈的吻合[10]。臨床研究顯示，隨著自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺血液透析患者生存期的持續(xù)延長(zhǎng)，自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺發(fā)生血管狹窄概率將增加，對(duì)血液透析治療效果及后期生活質(zhì)量均產(chǎn)生較大影響，因此，對(duì)自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺患者術(shù)前、術(shù)后同時(shí)給予有效干預(yù)措施，對(duì)自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺血管狹窄情況的預(yù)防有重要影響意義[11-13]。Apelin是APLN基因編碼的包含77個(gè)氨基酸的前體蛋白，包括Apelin-13、Apelin-17、Apelin-36，其中Apelin-13呈現(xiàn)的活性較高[7,14-15]。有研究顯示，Apelin是AGTR1相關(guān)蛋白(APJ)重要內(nèi)源配體，Apelin主要表達(dá)于機(jī)體的心內(nèi)膜及血管內(nèi)皮細(xì)胞中，而APJ主要定位在內(nèi)皮、平滑肌細(xì)胞及心肌細(xì)胞[6]。另外，Apelin、APJ進(jìn)行結(jié)合以后會(huì)參與多個(gè)生理反應(yīng)過(guò)程，如血管收縮、動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈狹窄等[16-18]。本研究對(duì)自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺血管狹窄患者及未發(fā)生血管狹窄患者的血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，觀察組患者Apelin-13水平低于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明Apelin-13可能對(duì)動(dòng)靜脈內(nèi)瘺血管狹窄存在一定緩解作用。

AngⅡ是一種重要的活性肽，參與血管張力調(diào)節(jié)及血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)生成等過(guò)程[19-20]。有報(bào)道顯示，AngⅡ通過(guò)與AGTR1受體結(jié)合，誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞開(kāi)始凋亡，使血管損傷加重、內(nèi)膜增生，且最終導(dǎo)致發(fā)生血管狹窄[21]。eNOS為血管內(nèi)皮細(xì)胞生成NO過(guò)程中一種重要的合成酶，其中NO能夠保持血管張力穩(wěn)定，使血管平滑肌產(chǎn)生一定抗炎及抗增殖作用[20-21]。本研究使用AngⅡ?qū)UVECS進(jìn)行有效刺激后，發(fā)現(xiàn)peNOS表達(dá)量及NO水平均降低。本研究采用Apelin干擾序列轉(zhuǎn)染HUVECS后，也發(fā)現(xiàn)peNOS表達(dá)量及NO水平均降低，這提示Apelin有可能對(duì)peNOS/NO的信號(hào)通路產(chǎn)生正向調(diào)控效果。

本研究對(duì)Apelin-13在血液透析內(nèi)瘺狹窄患者中的具體作用和機(jī)制進(jìn)行了研究，但研究仍有一定不足：(1)研究只選用了存在中度自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺血管狹窄的患者作為研究對(duì)象，并沒(méi)有研究其他內(nèi)瘺狹窄患者；(2)研究的細(xì)胞選擇比較單一；(3)只在患者體外細(xì)胞水平方面研究了Apelin-13、AngⅡ具備的拮抗作用。因此，還需要后續(xù)進(jìn)行深入研究，采用動(dòng)物模型完成實(shí)證分析。