hsa-miR-150-5p的生物信息學(xué)分析*

李九龍，劉 林，張 湘，蔡雪梅，何德超，劉宇欣，鐘曉武，龍 璠

1.四川省南充市第五人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川南充 637100；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川南充 637000

微小RNA (miRNAs)是一類廣泛存在于各種生物中、大小為20～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA[1-2]。成熟的miRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)結(jié)合,通過(guò)與mRNA 3′非編碼區(qū)(3′UTR)上的靶位點(diǎn)進(jìn)行互補(bǔ)識(shí)別，調(diào)控靶基因的表達(dá)與翻譯[3-4]。miRNAs通過(guò)加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程或減少異常轉(zhuǎn)錄，從而參與多種生物途徑的調(diào)控，以及調(diào)節(jié)與個(gè)體生長(zhǎng)、發(fā)育、疾病發(fā)生過(guò)程相關(guān)基因的表達(dá)，在細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、腫瘤發(fā)生發(fā)展等生物過(guò)程發(fā)揮著重要作用[5-6]。

近年來(lái)miRNAs與自身免疫與炎癥性疾病關(guān)系的相關(guān)研究越來(lái)越多，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-155能夠激活T細(xì)胞依賴性組織炎癥[7]。另外，miR-155缺失的純合體小鼠對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎有著很高的抗性[8]。miR-146a過(guò)表達(dá)抑制了白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)和IL-8等炎性因子的表達(dá)，進(jìn)而緩解炎性反應(yīng)過(guò)程，說(shuō)明miR-146a具有減輕炎性反應(yīng)的作用[9]。Toll樣受體4信號(hào)通路在調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子和趨化因子的生成時(shí)受到miR-146b的抑制作用[10]。miR-150通過(guò)調(diào)控接頭蛋白(GAB1)和叉頭框蛋白P1(FOXP1)的表達(dá)，參與B細(xì)胞成熟過(guò)程[11]。miR-150還可以通過(guò)c-Myb轉(zhuǎn)錄因子負(fù)向調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞和iNKT細(xì)胞，但正向調(diào)節(jié)NK細(xì)胞[12-13]。目前關(guān)于miR-150的具體作用機(jī)制尚不完全清楚，本研究利用miRNAs的進(jìn)化保守性,探討人類miR-150基因hsa-miR-150-5p在其基因家族的進(jìn)化關(guān)系。本研究通過(guò)靶標(biāo)預(yù)測(cè)、數(shù)據(jù)整理和信息分析，獲得相關(guān)信息，同時(shí)分析了靶基因的生物學(xué)功能，為研究hsa-miR-150-5p靶基因的作用機(jī)制及功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 miRNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase[14](http://www.mirbase.org/cgi-bin/browse.pl)，人類miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(HMED)[15](http://bioinfo.life.hust.edu.cn/smallRNA/index.php)，序列比對(duì)軟件Clustalw2 (https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/wise2dba/)和進(jìn)化分析軟件MEGA5.0[16]，miRNA靶基因預(yù)測(cè)在線軟件TargetScan[17](http://www.targetscan.org/)、miRDB[18](http://mirdb.org/miRDB/)和PicTar[19](http://www.pictar.org/)，基因本體(GO)[20](http://geneontology.org/)和代謝通路富集分析(KEGG)[21](http://www.kegg.jp/)。

1.2方法

1.2.1hsa-miR-150-5p表達(dá)譜分析 利用HMED在線工具檢索獲得hsa-miR-150-5p在不同組織和疾病中的每百萬(wàn)讀段中來(lái)自某基因的讀段數(shù)(RPM)數(shù)據(jù)，得到其在不同組織和疾病中特異性表達(dá)豐度信息，從而為hsa-miR-150-5p的組織和疾病定位及功能研究提供更多信息。

1.2.2序列分析 從miRNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase中獲得所有物種hsa-miR-150-5p的堿基序列、染色體定位等信息；利用Clustalw2軟件對(duì)所有物種hsa-miR-150-5p的堿基序列進(jìn)行多序列比對(duì)，分析所有序列特征；再用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用基于距離參數(shù)的鄰接法(NJ)，并自舉檢驗(yàn)1 000次。

1.2.3靶基因預(yù)測(cè)及功能注釋 運(yùn)用在線軟件miRDB、PicTar和TargetScan預(yù)測(cè)hsa-miR-150-5p的靶基因，最后以3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果的交集作為hsa-miR-150-5p候選的靶基因。再利用GO和KEGG對(duì)靶基因的生物學(xué)功能注釋分析，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)hsa-miR-150-5p的生物學(xué)功能。

2 結(jié) 果

2.1hsa-miR-150-5p表達(dá)譜 在HMED數(shù)據(jù)庫(kù)中，RPM<1代表miRNAs低表達(dá)或不表達(dá)， RPM≥100說(shuō)明miRNAs呈高表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，hsa-miR-150-5p在較多組織和疾病標(biāo)本中均呈高表達(dá)，比如在正常皮膚、銀屑癬、扁桃體等組織，肺癌、淋巴瘤等疾病中高水平表達(dá)(RPM≥100)，在急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、乳腺癌表達(dá)水平更高，其中，在乳腺癌表達(dá)水平最高，RPM達(dá)到2 183。

2.2miR-150基因家族成員的分布特征分析 通過(guò)同源性搜索在miRBase數(shù)據(jù)中獲得 miRNA-150基因家族成員的序列36條，都具有典型的莖環(huán)狀二級(jí)結(jié)構(gòu)，分布于人類、猩猩、鼠等23個(gè)物種。絕大部分miRNA-150基因家族成員位于基因間隔區(qū)，少數(shù)成員位于外顯子和內(nèi)含子，還有基因位置未知的。如大猩猩ggo-miR-150和灰短尾負(fù)鼠mdo-miR-150分布位于ENSGGOT00000008813的第1個(gè)內(nèi)含子和ENSMODT00000031346的第5個(gè)內(nèi)含子。見(jiàn)表1。

2.3hsa-miR-150-5p序列同源性分析 人類成熟hsa-miR-150-5p序列號(hào)為MIMAT0000451，定位于人類基因組第19號(hào)染色體，其堿基數(shù)與絕大部分物種均為22個(gè)，除了牛bta-miR-150-5p、灰短尾負(fù)鼠mdo-miR-150-5p 和眼鏡王蛇oha-miR-15-5p的堿基數(shù)23個(gè)，青鳉ola-miR-150-5p、三文魚(yú)ssa-miR-150-5p和大棕蝠efu-miR-150-5p的堿基數(shù)為21個(gè)，以及最短的袋獾sha-miR-150-5p堿基數(shù)為19個(gè)。采用Clustalw2在線軟件進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，miR-150基因家族成員序列堿基具有高度保守性，其中有16個(gè)堿基完全保守，6個(gè)堿基相對(duì)保守。但有一個(gè)堿基保守性較低，可能是由于miR-150基因家族進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生堿基的插入事件，引起了成熟序列長(zhǎng)度發(fā)生變化。袋獾sha-miR-150-5p和大棕蝠efu-miR-150-5p成熟序列可能是在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)了缺失事件，所以序列長(zhǎng)度變短。見(jiàn)圖1。

表1 不同物種miR-150基因家族成員在基因組的分布特征

圖1 miR-150基因家族成員成熟序列多重比對(duì)

圖2 miR-150基因家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4miR-150基因家族成員系統(tǒng)進(jìn)化分析 對(duì)23個(gè)物種的miR-150基因家族成員進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分為5支：青鳉、三文魚(yú)、鉗魚(yú)、斑馬魚(yú)均單獨(dú)聚為一支，人類等19個(gè)物種聚為一支，見(jiàn)圖2。說(shuō)明了人類的miR-150與青鳉、三文魚(yú)、鉗魚(yú)、斑馬魚(yú)的分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，與其他18個(gè)物種的進(jìn)化關(guān)系較近。

2.5miR-150靶基因預(yù)測(cè)及功能分析 為了提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，選用3種靶基因分析軟件PicTar、TargetScan和miRDB預(yù)測(cè)人類hsa-miR-150-5p的靶基因，分別獲得209、351和379個(gè)靶基因，最后取三者的交集作為候選靶基因(共25個(gè))。hsa-miR-150-5p參與多個(gè)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，包括轉(zhuǎn)錄因子、鋅指蛋白、Toll樣受體信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、ATP耦聯(lián)的離子型通道受體和細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白等，見(jiàn)表2。

表2 3種靶基因分析軟件均能預(yù)測(cè)到的hsa-miR-150-5p靶基因

注：BP,生物過(guò)程；CC，細(xì)胞構(gòu)成；MF，分子功能。

3 討 論

miRNA具有高度的保守性，在許多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，從而能保證生物生命活動(dòng)正常有效地進(jìn)行[22]。miRNAs可通過(guò)促進(jìn)抗炎因子的生成而抑制炎性信號(hào)通路，最終使致炎因子釋放減少而抑制炎性反應(yīng)[23]。有研究顯示，miRNAs 能在獲得性免疫和固有免疫中起著重要的調(diào)控作用，對(duì)機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)具有精細(xì)的調(diào)節(jié)作用，能夠防止機(jī)體出現(xiàn)過(guò)度的免疫激活[24]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-150的表達(dá)異常能夠引起免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生。ZHOU等[25]研究發(fā)現(xiàn)，miR-150在淋巴結(jié)和脾臟中的表達(dá)水平顯著增加，并且可以調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，調(diào)控 T/B細(xì)胞的分化。HONDA等[26]發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)性硬化病患者中miR-150表達(dá)下降，其主要通過(guò)調(diào)控整合素β3，影響整合素的表達(dá)，然后參與系統(tǒng)性硬化病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。在不同的疾病中，miR-150的作用靶點(diǎn)并不相同，部分靶點(diǎn)和作用機(jī)制也需要進(jìn)一步探討。因此，利用信息學(xué)方法深入分析靶基因信號(hào)通路和參與的生物學(xué)過(guò)程，對(duì)進(jìn)一步研究 hsa-miR-150-5p在人類疾病中調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，人類hsa-miR-150-5p具有25個(gè)候選靶基因，它們主要參與了轉(zhuǎn)錄因子、鋅指蛋白、Toll樣受體信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、ATP耦聯(lián)的離子型通道受體和細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白等多種生物學(xué)過(guò)程。其中髓樣分化因子(MyD88)是 Toll 樣受體信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵因子，在傳達(dá)上游信息和疾病發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用。GHORPADE等[27]研究結(jié)果顯示，在結(jié)核桿菌中 miR-150能直接靶向作用于Toll 樣受體信號(hào)通路中的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白 MyD88從而調(diào)節(jié)Toll樣受體的表達(dá)水平。然而，Toll樣受體能夠結(jié)合MSU刺激并進(jìn)一步激活下游核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路從而導(dǎo)致IL-1β前體生成，生成的前體被NLRP3炎性體切割成熟后釋放出細(xì)胞并能夠與細(xì)胞表面 IL-1β受體結(jié)合，從而激活NF-κB，形成一個(gè)正反饋環(huán)。

嘌呤受體P2X配體門控離子通道7受體(P2X7R)是IL-1加工和釋放中的一個(gè)關(guān)鍵因素。P2X7R主要來(lái)源于免疫細(xì)胞，能通過(guò)非選擇性陽(yáng)離子通道或非選擇性的大孔隙發(fā)揮作用，這種孔隙能夠滲透相對(duì)分子質(zhì)量為900的分子。在免疫作用中，P2X7R參與加工和釋放各種炎性因子，如IL-1β、IL-18和TNFα[28]，因此，P2X7R被視為一種促炎癥的受體。既往研究已經(jīng)證實(shí)P2X7R 3′UTR存在miR-150的作用靶點(diǎn)[29]，miR-150能夠直接靶向作用于P2X7R，同時(shí)miR-150能夠直接靶向作用于P2X7R促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7或MDAMB-231和荷瘤小鼠腫瘤的增殖[30]。而 WENG 等[31]研究顯示miR-150抑制Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞P2X7R水平從而降低Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞表面活性物質(zhì)的分泌。

細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白1(SOCS1)家族是一類由細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生，主要參與轉(zhuǎn)錄途徑負(fù)反饋調(diào)節(jié)的蛋白。WHYTE等[32]發(fā)現(xiàn)SOCS1能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化分型，抑制IL-6對(duì)M1細(xì)胞的誘導(dǎo)分化而將其命名為SOCS1，SOCS1能夠抑制巨噬細(xì)胞在脂蛋白/干擾素γ(LPS/IFN-γ)刺激下的M1表型，敲除小鼠SOCS1基因可明顯上調(diào)M1表型的相關(guān)基因(如CD86、IL-6和IL-12)[33]并且能夠增強(qiáng)NF-κB抑制蛋白(I-κB)和p38磷酸化[34]。同時(shí)研究顯示SOCS1能夠負(fù)性調(diào)控 M2表型及IL-4信號(hào)通路，敲除SCOS1小鼠的骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞在IL-4刺激后精氨酸酶Ⅰ表達(dá)明顯增高[32]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-150能夠靶向下調(diào)SOCS1表達(dá)，增加近端腎小管上皮細(xì)胞和足細(xì)胞促纖維化蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)狼瘡性腎炎患者腎纖維化[35]。

本研究篩選預(yù)測(cè)得到25個(gè)候選基因，為后續(xù)進(jìn)一步探索hsa-miR-150-5p的調(diào)控機(jī)制提供了初步的研究方向。由于基因功能研究的限制，部分hsa-miR-150-5p的靶基因無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確注釋。但是對(duì)hsa-miR-150-5p進(jìn)行生物學(xué)信息分析，不僅有利于hsa-miR-150-5p調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的揭示，也為闡明其功能研究提供新的理論基礎(chǔ)。