三種方法檢測口蹄疫146S抗原含量及抗原穩(wěn)定性的比較研究

楊生海，柴 靜，郭建榮，王富強，劉西蘭，董金杰，張 軍，翟國元，張 勇

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，蘭州 730046)

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, FMD)是一種感染牛、羊和豬等偶蹄動物的、具有高度傳染性的動物疫病[1]?？谔阋卟《?Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV)培養(yǎng)物中可以分離出不同密度的粒子，主要有四種：完全病毒粒子(146S)、空衣殼(75S)、12S蛋白質(zhì)亞單位(12S)、病毒感染相關(guān)成分(VIA抗原4.5S)[2]。

疫苗對動物的保護效果主要取決于兩個方面，一是疫苗毒株與流行毒株的相似程度，二是疫苗中抗原的含量[3]。146S抗原含量是決定口蹄疫疫苗質(zhì)量和免疫效力的關(guān)鍵因素。146S抗原含量檢測方法主要有蔗糖密度梯度離心結(jié)合紫外分光光度計定量法、蔗糖密度梯度離心結(jié)合液相色譜儀定量法及高效液相體積排阻色譜法三種，目前國內(nèi)各口蹄疫疫苗生產(chǎn)廠家主要采用蔗糖密度梯度離心法測定146S抗原含量并對生產(chǎn)環(huán)節(jié)進行控制[4-5]。1974年，荷蘭口蹄疫學(xué)家Barteling采用蔗糖密度梯度離心的方法定量FMDV 146S抗原，能檢測出病毒粒子的質(zhì)量大小[6]，基本原理是146S抗原在特定條件下分布在特定濃度的介質(zhì)中，于259 nm處產(chǎn)生最大紫外吸收峰(用OD259nm表示)，OD259nm與146S濃度成正比。蔗糖密度梯度離心法即將口蹄疫病毒樣品置于蔗糖密度梯度中離心，在離心力的作用下，樣品中的病毒粒子將沉降到相應(yīng)的密度梯度層內(nèi)，經(jīng)紫外分光光度計259 nm檢測時有最高吸收峰，而在其他級份層沒有吸收峰。收集146S吸收峰級份，用紫外分光光度計進行檢測，即可對146S含量進行定量[7]。蔗糖密度梯度離心結(jié)合液相色譜儀定量法是董金杰等在紫外分光光度計定量法的基礎(chǔ)上演變而來，是將滅活的FMDV經(jīng)超濾濃縮后分別加于15%～45%的蔗糖梯度頂部，35000 r/min超速離心3 h后，樣品中病毒粒子沉降到相應(yīng)的密度梯度層內(nèi)，再用安捷倫1260液相色譜儀定量法檢測各區(qū)帶在259 nm處的吸光值，繪制吸收峰圖譜，并計算峰的面積從而得到146S抗原含量[8]。高效液相體積排阻色譜法由Spitteler等2011年首次建立，中國科學(xué)院過程工程研究所率先在國內(nèi)開發(fā)該方法并驗證，目前與中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所聯(lián)合負(fù)責(zé)該方法的改進和應(yīng)用[9]。該方法利用高效液相色譜技術(shù)的凝膠色譜柱分子篩機制，使樣品進入色譜柱后，不同組分按其分子大小進入相應(yīng)孔內(nèi)，大分子因不能進入顆粒內(nèi)部，在色譜柱中滯留時間短，先于小分子被流動相洗脫至柱外，通過這種分子篩效應(yīng)，各組分從大到小依次被洗脫，并進入檢測器，由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)處理色譜信號，即可計算出146S抗原的含量。高效體積排阻色譜技術(shù)常用于生物大分子的分離和純化[10]。為篩選出一種最適合于臨床需求的口蹄疫146S抗原含量檢測方法，對這三種測量方法作一相關(guān)性試驗，并對不同條件下口蹄疫抗原的穩(wěn)定性特性及去除檢測過程中的雜質(zhì)干擾進行了研究。

1 材 料

1.1 儀器設(shè)備 冷凍高速離心機(Thermo公司)、超速冷凍離心機(Beckman公司)、超聲破碎儀(Bandelin公司)、安捷倫1260高效液相色譜儀、安捷倫Cary100紫外分光光度計、全自動密度梯度制備儀(Biocomp公司)、TOSHO公司TSKgel G4000SWXL色譜柱(基質(zhì)為親水修飾的硅膠基質(zhì)高效液相體積排阻色譜柱)、純水機、色譜瓶等。

1.2 試劑與溶液 0.01 mmol/L PBS(pH7.6)、正戊醇(分析純)、三氯乙烯(分析純)、 聚乙二醇(PEG)6000(優(yōu)級純)、無RNA酶蔗糖、10% Nonidet P-40(V/V)、無水硫酸鈉、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、氯化鈉(分析純)、甲醇(色譜純)、Benzonase核酸酶(上海源葉生物科技有限公司)。

1.3 口蹄疫抗原 口蹄疫抗原樣品7份；口蹄疫抗原1號株、口蹄疫抗原2號株、口蹄疫抗原3號株。

2 方 法

2.1 蔗糖密度梯度離心結(jié)合安捷倫Cary100紫外分光光度計定量法 取6支12 mL離心管，每支離心管分別加入2 mL的15%蔗糖溶液、2.5 mL的25%蔗糖溶液、2.5 mL的35%蔗糖溶液、2.5 mL的45%蔗糖溶液，觀察不同濃度之間界限清晰可見，然后置于4 ℃過夜(10～20 h)以形成連續(xù)梯度，或用梯度制備儀制備連續(xù)梯度，1支作為對照。取口蹄疫滅活抗原20 mL于50 mL離心管，加入5 mL三氯乙烯(抗原與三氯乙烯比例為4∶1)，用力振搖5 min，置冷凍高速離心機，4 ℃ 3000 g離心15 min，離心后，準(zhǔn)確取上清液10 mL，加入0.7 g PEG6000，4 ℃連續(xù)攪拌4 h，或40% PEG6000加入2.12 mL，混勻，再靜置過夜。將前一天PEG沉淀抗原液，移入離心管4 ℃ 10000 g離心1 h以沉淀病毒抗原。棄上清液，于離心管內(nèi)加入1 mL含1% NP40的PBS(pH7.6)浸潤沉淀后超聲，取1.0 mL樣品加入裝有蔗糖梯度的離心管，10 ℃ 35000 r/min離心2.5 h。將安捷倫Cary100紫外分光光度計檢測波長調(diào)為259 nm，開始測定并記錄數(shù)據(jù)，直至一管樣品收集完畢。

樣品管OD值減去空白對照管相對應(yīng)每個點的OD值，再將每一個樣品數(shù)據(jù)，采用EXCEL繪制點線圖，對照管為相對比較平滑的直線；測定樣品管的數(shù)據(jù)在35%～45%區(qū)域有一個明顯的峰區(qū)；含量越高峰值越高，確定峰區(qū)的點后計算146S含量。

2.2 蔗糖密度梯度離心結(jié)合安捷倫1260液相色譜儀定量法 取6支12 mL離心管，每支離心管分別加入2 mL的15%蔗糖溶液、2.5 mL的25%蔗糖溶液、2.5 mL的35%蔗糖溶液、2.5 mL的45%蔗糖溶液，觀察不同濃度之間界限清晰可見，然后置于4 ℃過夜(10～20 h)以形成連續(xù)梯度，或用梯度制備儀制備連續(xù)梯度，樣品10000 r/min離心5 min，取1.5 mL樣品加入裝有蔗糖梯度的離心管，10 ℃ 35000 r/min離心3 h。

將安捷倫1260液相色譜儀流速調(diào)為1 mL/min，在259 nm波長下測定紫外吸光光度值，電腦自動記錄檢測曲線，根據(jù)檢測曲線對146S抗原峰手動積分，結(jié)合1 μg口蹄疫146S抗原的峰面積計算所得每毫升抗原的146S含量。

2.3 高效液相體積排阻色譜法 配制50 mmol/L 磷酸緩沖液，含0.1 mol/L Na2SO4，測定pH值應(yīng)在7.2～7.4，使用孔徑0.2 μm濾膜，過濾脫氣處理后使用。高效液相色譜儀檢測波長調(diào)為259 nm，進樣量100 μL，流速0.6 mL/min，采集時間30 min。先用純水沖洗儀器管路，再更換流動相沖洗，待流動相充滿儀器管路，接入色譜柱平衡，觀察基線平穩(wěn)后開始檢測。用稀釋液將146S標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋，HPLC進樣檢測。采用系統(tǒng)自動積分146S在259 nm下的峰面積，以峰面積為橫坐標(biāo)，相應(yīng)146S濃度為縱坐標(biāo)，在EXCEL程序中繪制過原點的線性趨勢線作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

檢測樣品色譜圖中146S峰保留時間應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖中146S峰的保留時間一致，積分得檢測樣品146S峰面積，將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得146S抗原含量。

2.4 三種檢測方法的重復(fù)性驗證 采用蔗糖密度梯度離心結(jié)合安捷倫Cary100紫外分光光度計定量法重復(fù)檢測口蹄疫抗原1號株樣品20次，計算檢驗結(jié)果的相對偏差；采用蔗糖密度梯度離心結(jié)合安捷倫1260液相色譜儀定量法重復(fù)檢測口蹄疫抗原2號株樣品50次，計算檢驗結(jié)果的相對偏差；采用高效液相體積排阻色譜法重復(fù)檢測口蹄疫抗原3號株樣品20次，計算檢驗結(jié)果的相對偏差。

2.5 口蹄疫抗原穩(wěn)定性實驗 蔗糖密度梯度離心結(jié)合安捷倫1260液相色譜儀定量法重復(fù)性好，簡便易行，所以將口蹄疫A型抗原和O型抗原各1株4 ℃放置12個月后，每個月采用蔗糖密度梯度離心結(jié)合安捷倫1260液相色譜儀定量法檢測抗原含量的變化，將此2株抗原反復(fù)多次冷凍融化后檢測抗原含量的變化。

2.6 利用全能核酸酶去除雜蛋白干擾的實驗 取2支口蹄疫抗原，各吸取2 mL，加入全能核酸酶(Benzonase酶)5 μL，室溫下200 r/min快速搖勻1 h后，3000 r/min 4 ℃離心6 min。按照2.2蔗糖密度梯度離心結(jié)合安捷倫1260液相色譜儀定量法檢測2支口蹄疫抗原及Benzonase核酸酶處理過的抗原含量，根據(jù)色譜圖分析全能核酸酶是否能有效去除雜蛋白干擾，提高色譜純化效率。

3 結(jié)果與分析

3.1 紫外分光光度計定量法及液相色譜儀定量法檢測結(jié)果 結(jié)果見表1。對表1中的兩組數(shù)據(jù)作單因素方差分析，F(xiàn)值為1.659，F(xiàn)crit值為4.0069，P-value值為0.2028，F(xiàn)小于Fcrit，P-value高于0.05，表示兩組數(shù)據(jù)無差異，證明安捷倫Cary100紫外分光光度計定量法和安捷倫1260液相色譜儀定量法兩種方法檢測結(jié)果相關(guān)性顯著。

表1 安捷倫Cary100紫外分光光度計定量法和安捷倫1260液相色譜儀定量法的檢測數(shù)值Tab 1 Detection values of Agilent Cary 100 UV spectrophotometer quantitative method and Agilent 1260 liquid chromatography quantitative method

3.2 紫外分光光度計定量法和液相色譜儀定量法相關(guān)性 圖1結(jié)果顯示，安捷倫Cary100紫外分光光度計定量法和安捷倫1260液相色譜儀定量法檢測數(shù)值相關(guān)系數(shù)R2=0.9456，直線回歸方程為：y=0.771x-0.546，兩種方法的檢測數(shù)值呈正線性相關(guān)，并且相關(guān)性極顯著。

3.3 液相色譜儀定量法和高效液相體積排阻色譜法相關(guān)性 對表2中的兩組數(shù)據(jù)作單因素方差分析，F(xiàn)值為0.0026，F(xiàn)crit值為4.1709，P-value值為0.9594，F(xiàn)小于Fcrit，P-value高于0.05，表示兩組數(shù)據(jù)無差異，證明安捷倫1260液相色譜儀定量法和高效液相體積排阻色譜法兩種方法檢測結(jié)果相關(guān)性顯著。

圖1 安捷倫Cary 100紫外分光光度計定量法和安捷倫1260液相色譜儀定量法檢測數(shù)值的相關(guān)性Fig 1 Correlation between quantitative method of Agilent Cary 100 UV spectrophotometer and quantitative method of Agilent 1260 liquid chromatography

表2 安捷倫1260液相色譜儀定量法和高效液相體積排阻色譜法的檢測數(shù)值Tab 2 Detection values of Agilent 1260 liquid chromatography quantitative method and high performance volume exclusion chromatography

圖2結(jié)果顯示，安捷倫1260液相色譜儀定量法和高效液相體積排阻色譜法檢測數(shù)值相關(guān)系數(shù)R2=0.9416，直線回歸方程為：y=0.9656x+0.5053，兩種方法的檢測數(shù)值呈正線性相關(guān)，并且相關(guān)性極顯著。

3.4 紫外分光光度計定量法重復(fù)性試驗結(jié)果 表3結(jié)果顯示，口蹄疫抗原1號株樣品檢測20次，相對偏差大于10%的樣品數(shù)為6個，相對偏差在5%～10%之間的樣品數(shù)為8個，相對偏差在1%～5%之間的樣品數(shù)為5個，相對偏差在1%以下的樣品數(shù)為1個，用統(tǒng)計學(xué)方法計算此組檢測數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差σ值為2.1073，證明此檢測方法重復(fù)性一般。

圖2 安捷倫1260液相色譜儀定量法和高效液相體積排阻色譜法檢測數(shù)值的相關(guān)性Fig 2 Correlation between quantitative method of Agilent 1260 liquid chromatograph and detection value of high performance volume exclusion chromatography

表3 紫外分光光度計定量法檢測口蹄疫抗原1號株樣品20次的146S含量及相對偏差Tab 3 146S content and relative deviation of FMD antigen strain 1 detected 20 times by quantitative method of ultraviolet spectrophotometer

3.5 液相色譜儀定量法重復(fù)性試驗結(jié)果 表4結(jié)果顯示，口蹄疫抗原2號株樣品檢測50次，相對偏差大于10%的樣品數(shù)為3個，相對偏差在5%～10%之間的樣品數(shù)為7個，相對偏差在1%～5%之間的樣品數(shù)為26個，相對偏差在1%以下的樣品數(shù)為14個，用統(tǒng)計學(xué)方法計算此組檢測數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差σ值為0.4759，證明此檢測方法重復(fù)性很好。

表4 液相色譜儀定量法檢測口蹄疫抗原2號株樣品50次的146S含量及相對偏差Tab 4 146S content and relative deviation of FMD antigen strain 2 detected 50 times by quantitative method of liquid chromatograph

3.6 高效液相體積排阻色譜法標(biāo)準(zhǔn)曲線 結(jié)果見圖3和圖4。高效液相體積排阻色譜法所用標(biāo)準(zhǔn)品采用系統(tǒng)自動積分146S在259 nm下的峰面積，以峰面積為橫坐標(biāo)，相應(yīng)146S濃度為縱坐標(biāo)，在EXCEL程序中繪制過原點的線性趨勢線作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9923，大于0.99，符合標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)。

圖3 口蹄疫146S 抗原標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig 3 Standard chromatogram of 146S antigen of FMD

圖4 口蹄疫146S 抗原標(biāo)準(zhǔn)品曲線Fig 4 146S antigen standard curve of FMD

3.7 高效液相體積排阻色譜法重復(fù)性實驗結(jié)果 根據(jù)表5所示，口蹄疫抗原3號株樣品檢測20次，相對偏差都小于4%，用統(tǒng)計學(xué)方法計算此組檢測數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差σ值為0.2924，證明此檢測方法重復(fù)性非常好。

表5 高效液相體積排阻色譜法檢測口蹄疫抗原3號株樣品20次的146S含量及相對偏差Tab 5 146S content and relative deviation of FMD antigen strain 3 detected 20 times by high performance size exclusion chromatography

3.8 口蹄疫抗原穩(wěn)定性實驗 表6、表7結(jié)果顯示，將口蹄疫A型抗原和O型抗原各一株4 ℃放置12個月，每月采用蔗糖密度梯度離心結(jié)合安捷倫1260液相色譜儀定量法檢測，結(jié)果抗原含量沒有變化，將此2株抗原多次冷凍融化后檢測，抗原含量的降解比較多, 所以口蹄疫抗原適合4 ℃保存。

表6 液相色譜儀定量法檢測兩株抗原4℃放置12個月的含量變化Tab 6 Changes in the content of two antigens after 12 months at 4℃ by quantitative method of liquid chromatograph

表7 液相色譜儀定量法檢測兩株抗原反復(fù)多次凍融后抗原含量的變化Tab 7 Changes of antigen content after repeated freeze-thaw of two antigens by quantitative method of liquid chromatograph

3.9 Benzonase核酸酶處理前后抗原檢測圖 圖5結(jié)果顯示，未加Benzonase核酸酶處理的抗原檢測圖(圖5A)色譜峰出現(xiàn)之前，還出現(xiàn)了雜蛋白的紫外吸收峰，而加Benzonase核酸酶處理后的抗原檢測圖(圖5B)除色譜峰之外，再沒有出現(xiàn)雜蛋白的紫外吸收峰，所以Benzonase核酸酶能夠有效去除雜蛋白干擾，增加蛋白產(chǎn)量，提高色譜純化的效率。

圖5 液相色譜儀定量法檢測1號抗原色譜圖Fig 5 Quantitative detection of No.1 antigen by quantitative method of liquid chromatograph

4 討論與結(jié)論

將口蹄疫A型抗原和O型抗原各一株4 ℃放置12個月，每月采用蔗糖密度梯度離心結(jié)合安捷倫1260液相色譜儀定量法檢測，結(jié)果抗原含量沒有變化，將此2株抗原多次冷凍融化后檢測，發(fā)現(xiàn)抗原含量的降解比較多。因此口蹄疫抗原或疫苗適合4 ℃保存，不能冷凍，冷凍后抗原含量的降解比較多，會大大降低口蹄疫疫苗的免疫效力。Benzonase核酸酶，是一種核酸內(nèi)切酶，可將核酸降解成為2～5個堿基的5’單磷酸核苷酸，能夠有效降低蛋白樣品的粘度，提高色譜純化的效率，去除蛋白樣品中核酸污染，并且沒有蛋白酶活性殘留，它能夠完全去除檢測過程中干擾物質(zhì)對146S特征峰的影響，獲得最佳的檢測信號并實現(xiàn)146S抗原含量的準(zhǔn)確測定。

使用蔗糖密度梯度離心法對口蹄疫146S抗原含量進行定量是一種標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法操作較復(fù)雜，對儀器設(shè)備要求較高[11]。分別用蔗糖密度梯度離心結(jié)合安捷倫Cary100紫外分光光度計定量法、蔗糖密度梯度離心結(jié)合安捷倫1260液相色譜儀定量法及高效液相體積排阻色譜法三種檢測方法，對口蹄疫滅活抗原中的146S含量進行檢測，對三種檢測方法的數(shù)據(jù)作單因素方差分析，結(jié)果F小于Fcrit，P-value高于0.05，表明三種檢測方法的數(shù)據(jù)無差異，安捷倫Cary100紫外分光光度計定量法和安捷倫1260液相色譜儀定量法檢測數(shù)值相關(guān)系數(shù)R2=0.9456，安捷倫1260液相色譜儀定量法和高效液相體積排阻色譜法檢測數(shù)值相關(guān)系數(shù)R2=0.9416，因此三種檢測方法的檢測數(shù)值相關(guān)性極顯著，呈正相關(guān)性，蔗糖密度梯度離心結(jié)合安捷倫Cary100紫外分光光度計定量法重復(fù)性檢測數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差σ值為2.1073，此檢測方法重復(fù)性一般，操作步驟繁瑣。高效液相體積排阻色譜法重復(fù)性檢測數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差σ值為0.2924，重復(fù)性非常好，自動化程度高，但是操作不夠簡易，尤其要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如果每次、每批檢測有一種試劑等因素有變動，都需要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，影響檢測結(jié)果。蔗糖密度梯度離心結(jié)合安捷倫1260液相色譜儀定量法重復(fù)性檢測數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差σ值為0.4759，此檢測方法重復(fù)性很好，并且簡便易行，所以基于臨床需求，蔗糖密度梯度離心結(jié)合安捷倫1260液相色譜儀定量法更適合口蹄疫抗原檢測，通過優(yōu)化篩選，期望能為口蹄疫疫苗中146S抗原含量的檢測方法進一步標(biāo)準(zhǔn)化奠定基礎(chǔ)，在疫苗質(zhì)量控制中，可以在生產(chǎn)階段用抗原含量測定的方法保證疫苗中有效抗原的含量，而在成品疫苗的效力檢驗時嘗試將抗原含量檢測方法與替代試驗動物檢測方法相結(jié)合進行綜合評價，大批量的終產(chǎn)品檢驗可以通過抗原含量測定方法試驗數(shù)據(jù)來進行檢驗，從而減少試驗的數(shù)量，在終產(chǎn)品的組分發(fā)生改變時或者疫苗中添加免疫增強劑等情況時用動物進行效力檢驗，同時檢測疫苗組分改變或添加免疫增強劑后所需要的有效抗原含量新標(biāo)準(zhǔn)，以探索一種有較好重復(fù)性、可靠性和易于標(biāo)準(zhǔn)化的替代方法。