WRKY響應(yīng)植物逆境的“角色”

張金梅 白雪 李玥瑩

摘要 植物經(jīng)常面臨大量的逆境脅迫，這些逆境脅迫會對植物造成一些不利影響。為了應(yīng)對這些脅迫，植物通過一個嚴格調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)機制來迅速作出響應(yīng)。WRKY家族是一類廣泛參與響應(yīng)脅迫的轉(zhuǎn)錄因子家族，作為激活因子或者抑制因子來參與轉(zhuǎn)錄組的重新編程。綜述了逆境脅迫中WRKY基因在植物抗性機制中扮演的“角色”及其發(fā)揮的作用。

關(guān)鍵詞 WRKY;逆境脅迫;調(diào)控;角色

Abstract Plants often face a great deal of stress，which will have some adverse effects on plants.In response to these stresses，plants respond quickly through a tightly regulated network of mechanisms.WRKY family is a family of transcription factors that are widely involved in response to stress and participate in transcriptome reprogramming as activators or inhibitors.In this paper，we reviewed the role of WRKY gene in plant response to stress and homology in other plants.

Key words WRKY;Stress of adversity;Regulation;Role

植物在逆境脅迫下會引發(fā)很多問題，如合成激素信號通路的中斷，干擾激素信號傳導(dǎo)會抑制植物的生長和發(fā)育，光合作用受到抑制，誘導(dǎo)植物衰老，細胞程序性死亡，細胞損傷，活性氧生成增加，細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和滲透調(diào)節(jié)平衡受到破壞，嚴重時將導(dǎo)致植物死亡[1-3]。為了應(yīng)對各種逆境脅迫，植物通過一系列生理、代謝以及分子水平上的防御機制來提高植物的耐受能力。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是存在于高等植物中的一大類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它是通過特異性的結(jié)合目標基因啟動子的W-box、WRKY域和其他蛋白質(zhì)的相互作用，還有翻譯后修飾加工[4-8]。WRKY在逆境脅迫中會扮演不同的“角色”，控制參與響應(yīng)脅迫的關(guān)鍵物質(zhì)的生物合成。植物在逆境脅迫下形態(tài)、生理以及分子機制方面都會發(fā)生變化，WRKY在這一系列變化中起重要作用。Bai等[9]報道在番茄中有83個WRKY基因被鑒定出來。萬紅建等[10]報道了這些WRKY基因廣泛參與生物與非生物脅迫。

1 WRKY參與非生物脅迫與生物脅迫

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物生長和發(fā)育的主要調(diào)節(jié)因子。鹽脅迫條件下的WRKY蛋白參與植物的不同生理和發(fā)育過程，如種子大小調(diào)節(jié)、種皮發(fā)育、葉片發(fā)育和葉片衰老調(diào)節(jié)[11-12]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與不同水平的激素調(diào)節(jié)，響應(yīng)植物在各個發(fā)育階段的脅迫，如在鹽脅迫和滲透脅迫下，植物激素脫落酸在響應(yīng)脅迫中快速積累，吲哚乙酸、赤霉素、茉莉酸、水楊酸、油菜素類固醇和乙烯ctr1-1或EIN3的過量表達從而提高耐鹽性，誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)種子萌發(fā)率和幼苗生長[13]。從陸地棉（Gossypium hirsutum）中分離出WRKY41（GhWRKY41）并轉(zhuǎn)化到煙草（Nicotiana benthamiana）中，得到轉(zhuǎn)基因植株，GhWRKY41過表達，降低了植株中丙二醛含量，調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉，抗氧化酶活性增強以及相關(guān)基因的上調(diào)，使植物對鹽和干旱脅迫的抗性增強[11-12]。在王秀玲等[14]研究中轉(zhuǎn)基因植物GhWRKY40過表達植株在對生物脅迫青枯細菌的侵染中表現(xiàn)出敏感性。GhWRKY40在SA/JA信號途徑中起作用，且對傷脅迫和青枯細菌侵染的響應(yīng)具有協(xié)同作用，經(jīng)驗證GhWRKY40和GhMPK20互作于細胞核內(nèi)， GhWRKY40被GhMPK20激活表達參與脅迫響應(yīng)。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子也參與干旱脅迫應(yīng)答，植物在干旱脅迫下嚴重降低了芽和幼苗的數(shù)量，顯著降低了植物水分利用效率，影響植物光合作用，導(dǎo)致光合色素和成分變化、光合器官受損和卡爾文循環(huán)酶的活性下降，同化物分配降低了光合速率，擾亂了葉片的碳水化合物代謝和蔗糖水平，使呼吸代謝速率下降，導(dǎo)致植物在碳資源的利用中不平衡、生成氧種類減少等影響。AtWRKY40在擬南芥應(yīng)對干旱脅迫響應(yīng)中調(diào)節(jié)一系列抗氧化酶活性從而響應(yīng)干旱脅迫誘導(dǎo)[15];AtWRKY40缺失導(dǎo)致干旱脅迫下種子的萌發(fā)率降低，葉片失水加劇，當(dāng)它過表達時則表現(xiàn)相反的表征，較于野生型植株，AtWRKY40缺失突變體植株葉片的抗氧化酶活性、脯氨酸（Pro）以及相關(guān)基因AtCu/ZnSOD、AtCAT1、AtP5C1S、AtG6PD5和AtBAM4表達量和可溶性糖含量都顯著降低，而過表達株系則比野生型植株的抗氧化酶活性、基因的表達量和滲透物質(zhì)的含量都顯著增高[16]。AtWRKY40在應(yīng)對病原菌的侵染過程中受病原菌的誘導(dǎo)，從而合成一些植保素來防御病原菌的侵害。也與其同一來源的基因串聯(lián)復(fù)制使被侵染病原菌的植株抗性增強。

袁柳嬌等[17]根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)了秋茄通過調(diào)節(jié)自身的基因表達情況來提高自身對受污染環(huán)境中重金屬的耐受能力。對于金屬非超積累植物，谷胱甘肽（GSH）和植物金屬螯合素（PC）之間的平衡對于提高Cd的耐受能力非常重要。當(dāng)AtPCS1基因過表達時，PC的合成升高，導(dǎo)致GSH的消耗，這有助于增強氧化應(yīng)激和Cd的敏感表型[18]。 研究發(fā)現(xiàn)，WRKY13通過谷胱甘肽獨立的PC合成途徑調(diào)控Cd耐受，WRKY蛋白可以作為轉(zhuǎn)錄激活因子或者轉(zhuǎn)錄抑制因子。作為轉(zhuǎn)錄激活因子時，通過直接與PDR8啟動子的W-box結(jié)合，正向調(diào)節(jié)鎘耐受，合成木質(zhì)素，而作為轉(zhuǎn)錄抑制因子與下游靶基因作用，控制開花時間。水稻W(wǎng)RKY13選擇結(jié)合順式作用元件W-box結(jié)構(gòu)完全不同類型的PRE4元件，調(diào)控不同脅迫中信號路徑間的交互作用，如在水稻受干旱脅迫時發(fā)揮抑制功能調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉，可以與SNAC1啟動子區(qū)不同的順式作用元件選擇性結(jié)合進行負調(diào)控;當(dāng)選擇性結(jié)合到WRKY45啟動子區(qū)不同的順式作用元件上，也可以發(fā)揮同樣的抑制功能。在水稻受病原菌侵染過程中，還可以結(jié)合另一個與W-box結(jié)構(gòu)完全不同的PRE4順式作用元件，激活自身基因的表達[19]。

2 WRKYs組成的基因簇協(xié)同作用

在植物防御系統(tǒng)中擬南芥WRKY18、WRKY40、WRKY60這3個結(jié)構(gòu)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子均受病原菌的誘導(dǎo)[20]，研究表明這3個轉(zhuǎn)錄因子可以形成AtWRKY18-40-60簇，且是ABA信號調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子。形成同源和異源復(fù)合物是通過自身的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，所以產(chǎn)生的 WRKY蛋白的DNA結(jié)合活性會有顯著差異?；虼厥峭ㄟ^單個基因重復(fù)產(chǎn)生的多個拷貝，因此來源、結(jié)構(gòu)和功能以及由其編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物都存在相似性，這類家族基因一個區(qū)域內(nèi)串聯(lián)復(fù)制緊密排列在一起形成一個基因簇。高密度基因簇，包括Hox域和C2H2鋅指結(jié)構(gòu)基因域等[21]。一個基因簇組成的突變體能夠增強植物的基礎(chǔ)防御作用，對防御途徑中的平衡也起重要作用，協(xié)同調(diào)控使植物抗性增強[22-23]。

ATWRKY18是一種病原和水楊酸誘導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)錄因子，包含植物特異性WRKY鋅指DNA結(jié)合基序。ATWRKY18的高水平表達轉(zhuǎn)基因植物生長遲緩，當(dāng)在中等水平表達時，ATWRKY18增強了轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)育，調(diào)節(jié)防御反應(yīng)，且不會對植物生長造成實質(zhì)性的負面影響。ATWRKY18增強發(fā)育、調(diào)節(jié)防御反應(yīng)需要抗病調(diào)節(jié)蛋白npr1/nim1。因此，ATWRKY18可以積極調(diào)節(jié)防御相關(guān)基因的表達和抗病性[24]。ATWRKY40是作為抑制因子抑制抗霉素A誘導(dǎo)的高光誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)和線粒體的逆行表達，ATWRKY40也是參與調(diào)節(jié)編碼線粒體和葉綠體蛋白的應(yīng)激反應(yīng)基因。此外，ATWRKY40參與調(diào)節(jié)線粒體和葉綠體的功能，逆境脅迫下共同激活應(yīng)答基因的表達。研究表明，ATWRKY40在植物干旱脅迫反應(yīng)中也發(fā)揮了積極作用，可能是通過干擾活性氧清除途徑和滲透液積累過程。干旱脅迫下，野生型植物WRKY40表達強烈，功能喪失突變體在干旱條件下種子發(fā)芽率下降，葉片失水率上升，而在過表達系中則表現(xiàn)出相反的趨勢。此外，ATWRKY40突變體植株積累的丙二醛（MDA）比野生型和過度表達植株多，表明突變體脂質(zhì)過氧化水平提高。WRKY18、WRKY40、WRKY60產(chǎn)生的WRKY蛋白在植物響應(yīng)2種不同類型的病原體中具有部分冗余的作用，WRKY18比其他2種更重要[20]。病原菌侵染時，三突變體比野生型防御對半活體營養(yǎng)型細菌表現(xiàn)更抗，但對壞死營養(yǎng)型真菌表現(xiàn)更感。在進行基因敲除時，必須將3個基因全部敲除才能達到目的。

研究發(fā)現(xiàn)，在假單孢桿菌和黑球病菌侵染的巨桉植株中，EgrWRKY70、EgrWRKY46、EgrWRKY53這3個結(jié)構(gòu)類似的基因與激素水楊酸、茉莉酸甲酯具有協(xié)同作用，且誘導(dǎo)起正調(diào)控作用表現(xiàn)出抗性[22，25-26]。研究還發(fā)現(xiàn)，參與Br油菜素甾體類調(diào)控的植物生長和干旱響應(yīng)過程中3個擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子WRKY46、WRKY54和WRKY70結(jié)構(gòu)相似功能冗余，這三重突變體在干旱脅迫下對Br調(diào)控的植株生長存在缺陷，但耐受性更強。經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序分析表明，在促進Br介導(dǎo)的基因表達和抑制干旱反應(yīng)基因中直接相互作用的是WRKY54與BES1，協(xié)同調(diào)控靶基因的表達，WRKY54被類似GSK3的激酶Br-Insensive2磷酸化，BES1是Br通路的負調(diào)節(jié)因子[27]。

3 WRKY調(diào)節(jié)代謝物的生物合成

WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)特定代謝物的產(chǎn)生，作為特化代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，如通過調(diào)控乙烯合成酶相關(guān)基因的表達，參與其生物合成[28-29]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)是控制代謝的關(guān)鍵限速步驟，調(diào)節(jié)多種酚類化合物的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)苯丙類通路中木質(zhì)素的產(chǎn)生，控制黃酮醇和單寧化合物的生成，所以它也是生物堿代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子。WRKY轉(zhuǎn)錄因子對萜烯通路的調(diào)節(jié)，如從陸地棉中分離出來的GaWRKY1，從黃花蒿中分離出來的AaWRKY1，從水稻中分離出來的OsWRKY13，分別作用特定代謝的關(guān)鍵酶CAD1-A、ADS、查爾酮合成酶（CHS），特異性結(jié)合相關(guān)的啟動子ADSpro2、Os01g24980、Os08g44830，從而合成倍半萜類棉子酚、倍半萜類青蒿素、倍半萜類黃酮[30-35]。

4 WRKY參與植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物脅迫響應(yīng)中的信號通路，參與許多植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)包括脫落酸、生長素、油菜素、類固醇、細胞分裂素、乙烯、茉莉酸和水楊酸等[36]。研究發(fā)現(xiàn)，絲裂原活化蛋白激酶 （mitogenactivated proteinkinase，MAPK） 介導(dǎo)的磷酸化調(diào)控會影響某些 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的活性[37]。當(dāng)受到脅迫應(yīng)激時，植物活性氧的大量積累，氧化信號誘導(dǎo)型OX1蛋白檢測到了植物細胞中ROS的產(chǎn)生和積累，這些蛋白質(zhì)就會刺激下游絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)的快速信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在胞質(zhì)中MAPK級聯(lián)是從MKKK到MKK再到MPK的三級磷酸化，來自MAPK級聯(lián)的信號將進一步轉(zhuǎn)導(dǎo)至轉(zhuǎn)錄因子激活細胞核中的轉(zhuǎn)錄因子功能，結(jié)合特定的順式作用元件并誘導(dǎo)響應(yīng)抗性相關(guān)基因脫落酸等的表達[36，38]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)激調(diào)控OsBWMK1S的表達，在應(yīng)答過程中發(fā)生了不同程度的磷酸化，在OsMKK6轉(zhuǎn)基因過表達植株中，OsWRKY50表達上調(diào)，在依賴水楊酸的防御反應(yīng)中，OsBWMK1磷酸化與PR基因啟動子結(jié)合的W-box序列，OsWRKY53作為OsMPK3/OsMPK6正調(diào)控因子，并與這些MPKs相互作用，降低了茉莉酸和乙烯的誘導(dǎo)，提高了抑菌效果[39-40]。

5 WRKY影響表觀遺傳學(xué)調(diào)控

表觀遺傳學(xué)是控制染色質(zhì)的可達性，全基因組的染色質(zhì)修飾，DNA的復(fù)制、修復(fù)以及結(jié)合的轉(zhuǎn)錄機制，有DNA甲基化和乙酰基化等[41]。表觀遺傳對水稻W(wǎng)RKY基因的表達有一定影響。WRKY基因的應(yīng)答在DNA甲基化水平上被調(diào)控。在耐旱條件下，水稻OsWRKY70 和OsWRKY45甲基化程度高則表現(xiàn)為下調(diào)，甲基化程度低OsWRKY90表現(xiàn)為上調(diào);鹽脅迫下，OsWRKY104高程度甲基化基因表現(xiàn)為下調(diào)[42]。在種子發(fā)育過程中，OsWRKY2甲基化程度的變化和表達變化之間呈負相關(guān)，此外OsWRKY71轉(zhuǎn)錄本和組蛋白H4乙?；赗NAi中被誘導(dǎo)，表明HDT701作為植物防御的負調(diào)控因子，并通過乙?；腿ヒ阴；^程調(diào)節(jié)WRKY基因的表達[43-44]。在稻瘟病抗性誘導(dǎo)中，OsWRKY45-1和OsWRKY45-2 2個等位基因產(chǎn)生的抗性存在差異，插入1個編碼為TE-siR815的內(nèi)含子，在OsWRKY45-1的第一個內(nèi)含子中，ST1基因被抑制，經(jīng)導(dǎo)向RNA的DNA甲基化，ST1基因是WRKY45介導(dǎo)耐藥的重要基因，這種突變導(dǎo)致抗病性表現(xiàn)為OsWRKY45-1的負作用和OsWRKY45-2的正作用[44-45]。

6 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的WRKYs基因編輯

最新突破性的基因組編輯技術(shù) （CRISPR）/Cas是一種簇狀、有規(guī)則間隔的回文重復(fù)序列系統(tǒng)，已成為占主導(dǎo)地位的基因組編輯工具。CRISPR/Cas系統(tǒng)主要可以分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3種類型，其中最簡單和最常用的類型CRISPR/Cas9系統(tǒng)是膿毒鏈球菌的II型系統(tǒng)[46-48]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)可引入包括堿基替換，插入突變和缺失突變等多種突變類型[49]。與之前的不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)可以同時編輯多個基因在多個位點引起突變[50-54]。以CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的甘藍型油菜基因組定向改變其基因型來探究。首先利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建針對甘藍型油菜BnWRKY11和BnWRKY70基因的表達盒，構(gòu)建Cas9、gRNA與Cas9形成復(fù)合物，使其轉(zhuǎn)染到細胞，并引導(dǎo)酶切割目標DNA，與RNA通過互補序列結(jié)合，細胞試圖修復(fù)DNA斷裂，這就導(dǎo)致插入或刪除，改變其閱讀框，提前形成終止密碼子，然后在T0代或T1代對目標位點進行擴增和測序，結(jié)果表明，BnWRKY70基因的過表達會降低對菌核病的抗性，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以在油菜甘藍中產(chǎn)生多個同源突變植株，在定向改變基因中具有較高的編輯效率，可以在有限的世代內(nèi)產(chǎn)生純合突變體，所以表明可以利用其來提高油菜對病原菌的抗性[55]。

7 展望

近年來，隨著研究發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族演繹的角色逐步被解密，通過在染色體水平、基因分子水平上的分析研究，展示了WRKY所扮演的多元化調(diào)控角色，了解到WRKY轉(zhuǎn)錄因子的重要性，特別是在抗逆境生理脅迫中?？梢詮钠涓鞣N角度，如WRKY的種類、功能作用、各種類相關(guān)聯(lián)性、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等，在植物育種方面的價值，挖掘出它更深刻的意義，提供更完善的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的理論基礎(chǔ)。

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